Xem mẫu
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Summary
PURIFICATION OF RECOMBINANT CELL PERMEABLE PROTEINS
AND THE POSSIBILITY FOR PROTEIN THERAPY
Inactivated proteins caused many human diseases. Protein therapy is one of the therapies for
many diseases related to a defected protein or inhibitor of a biological process to stop the growth
of the tumor. Here, we present the results of improved recombinant cell-penetrating peptides
(rCPPs). These rCPPs can serve as new tools for delivering protein in biology and medicine applications. We cloned the CPP in-frame with green fluorescent protein (rCPP - GFP). We were
able to express and purify full-length rCPP - GFP fusion proteins. The results showed that, each
purified r.protein was tested in Hela and Jurkat cell lines for their transduction efficiency and translocation. The purified rCPPs - GFP fusion proteins have biological activity as good as HIV virus
derived TAT - EGFP peptides. The expressed rCPPs-EGFPs were able to translocate across both
the cytoplasm and nucleus, thus, these intracellular regulatory proteins can be used as protein
transporters for therapeutic purposes.
Key words: CPP, protein recombination, TAT, therapeutic protein
PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG CHUỘT
Hoàng Đạo Bảo Trâm1, Tô Minh Quân2, Đoàn Nguyên Vũ2,
Nguyễn Thị Ngọc Mỹ2, Lê Thị Ngọc Hương2, Lưu Phương Nam3, Phan Kim Ngọc2
1
2
Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
3
Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng chuột được tiến hành trên 15 mẫu tủy răng chuột
nhắt trắng Mus musculus var. albino 2 - 3 tuần tuổi. Răng cửa hàm dưới chuột được xử lý bằng dung dịch
Peniciline 400UI/ml, Streptomycine 400µg/ml trong 20 phút. Mảnh mô tủy răng được nuôi cấy sơ cấp trên
đĩa 35mm trong môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml, ở
điều kiện 37oC, CO2 5%. Sau 3 tuần, các tế bào hợp dòng, cấy chuyền sang Flask 25cm2 và tiếp tục quá
trình nuôi cấy thứ cấp cho tới thế hệ thứ tư (P4). Sự biểu hiện các marker bề mặt của tế bào được đánh giá
bằng phương pháp Flow Cytometry. Kết quả cho thấy tế bào tủy răng chuột P4 có biểu hiện các marker của
tế bào gốc trung mô CD73, CD90, CD105 và không biểu hiện các marker của tế bào máu CD19, CD34,
CD45. Các tế bào có thời gian nhân đôi là 45 giờ và đỉnh đường cong tăng trưởng đạt vào ngày thứ 7. Tế
bào gốc tủy răng chuột đã được nuôi cấy thành công bằng phương pháp nuôi cấy mảnh mô tủy răng chuột.
Từ khóa: tế bào gốc tủy răng, phân lập tế bào, nuôi cấy tế bào
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tủy răng là mô liên kết chứa các tế bào,
mạch máu và thần kinh, có chức năng duy trì
TCNCYH 82 (2) - 2013
sự sống của răng. Tương tự như tủy xương,
tủy răng chứa các tế bào gốc trung mô. Ngoài
ra, tủy răng còn chứa tiền nguyên bào ngà và
13
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
tế bào tạo máu. Có thể nói tế bào tủy răng là
nguồn nguyên liệu quý đối với các nghiên cứu
trong lĩnh vực tái tạo mô răng và nha chu [1].
Các mô hình nghiên cứu in vitro và mô hình
nghiên cứu trên động vật là những giai đoạn
thử nghiệm quan trọng để chuẩn bị cho các
nghiên cứu ứng dụng tiếp theo trên người.
Nhiều tác giả trên thế giới đã sử dụng chuột
trong các thử nghiệm về tế bào gốc của răng
và tiềm năng biệt hóa và tạo mô của các tế
bào này. Các dòng tế bào tủy răng chuột biểu
hiện các phân tử bề mặt tế bào tương tự như
tế bào gốc tủy răng người, đây là những
phương tiện quý báu để xác định kiểu hình
của các dạng tế bào tiền thân khác nhau, dựa
trên các mức độ biểu hiện dưới quần thể khác
nhau của các phân tử bề mặt tế bào, từ đó có
thể đánh giá tiềm năng sửa chữa ở tủy răng
cũng như đối với các tổn thương mô vùng sọ mặt [2].
Nghiên cứu của Balic và cộng sự thực hiện
năm 2010, đánh giá trong điều kiện in vitro
các đặc tính của tế bào tiền thân của tủy răng
cửa của chuột. Kết quả nghiên cứu cho thấy
tủy răng cửa hàm dưới chưa mọc và đã mọc
chuột chứa một quần thể giàu tế bào tiền
thân và rất ít tế bào gốc, tương tự như các
răng cối chưa mọc của chuột; và quá trình
liên tục tạo nguyên bào ngà và ngà răng ở
mặt ngoài và mặt trong của các răng cửa
được thực hiện bởi quần thể tế bào tiền thân
chứ không phải từ các tế bào gốc trung mô
đa năng có trong tủy răng [3, 4]. Trong khi
đó, quần thể tế bào tủy răng cối đã mọc của
chuột chỉ chứa một số lượng nhỏ tế bào đa
Địa chỉ liên hệ: Hoàng Đạo Bảo Trâm, Đại học Y Dược
Thành phố Hồ Chí Minh - 217 Hồng Bàng, Quận 5, Thành
phố Hồ Chí Minh.
Email: hoangdaobaotram@gmail.com
Ngày nhận: 14/3/2013
Ngày được chấp thuận: 26/4/2013
14
năng [4]. Trong một thử nghiệm in vitro khác,
Shahrul và cộng sự tiến hành phân lập tế bào
gốc tủy răng chuột. Các tế bào này có tốc độ
tăng sinh cao và có khả năng biệt hóa thành
các tế bào tạo sụn [5].
Nằm trong một chuỗi nghiên cứu thử
nghiệm in vitro về tế bào gốc tủy răng được
phối hợp thực hiện giữa Đại học Y Dược
thành phố Hồ Chí Minh và Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành
phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu này được tiến
hành nhằm mục tiêu: phân lập và nuôi cấy tế
bào gốc của tủy răng chuột.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Phân lập và nuôi cấy tế bào tủy
răng chuột
Tủy răng được thu nhận từ răng hàm dưới
chuột nhắt trắng Mus musculus var. albino, 2 3 tuần tuổi, cân nặng 20 - 25g. Răng hàm
dưới chuột được xử lý bề mặt bằng dung dịch
Peniciline 400UI/ml và Streptomycine 400µg/
ml trong 20 phút.
Mảnh mô tủy được thu nhận và nuôi cấy
sơ cấp trong môi trường DMEM/F12 (Sigma)
bổ sung huyết thanh bào thai bò (FBS) 10%
(Sigma), Peniciline 100UI/ml (Sigma), Streptomycine 100µg/ml (Sigma) ở điều kiện 37oC,
5% CO2. Ở thời điểm hợp dòng, các tế bào
được cấy chuyền sang chai nuôi cấy Flask
25cm2 bằng dung dịch Trypsin/EDTA 0,25%:
0,02% (Sigma). Quá trình nuôi cấy thứ cấp
được tiếp tục thực hiện trong môi trường
DMEM/F12 bổ sung FBS 10%, Peniciline
100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml ở điều kiện
37oC, CO2 5%.
2. Xác định tính gốc của tế bào tủy răng
chuột
Tế bào tủy răng chuột được kiểm tra sự
biểu hiện các marker bề mặt CD73, CD90,
TCNCYH 82 (2) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
CD105 và CD19, CD34, CD45 bằng phương
pháp Flow Cytometry. Phương pháp này sử
dụng các loại kháng thể được gắn các hạt
phát huỳnh quang và có khả năng nhận diện
đặc hiệu một số marker bề mặt tế bào. Nếu tế
bào biểu hiện marker cần quan tâm, tế bào và
kháng thể đặc hiệu sẽ liên kết với nhau tại
marker tạo thành phức hợp tế bào - kháng
thể. Phức hợp này được nhận diện bởi máy
FACS thông qua hạt phát huỳnh quang trên
kháng thể. Nếu không biểu hiện, phức hợp tế
bào - kháng thể không được hình thành,
không thể được nhận diện bởi máy FACS.
3. Xây dựng đường cong tăng trưởng
tế bào
Đường cong tăng trưởng tế bào được xây
dựng bằng cách xác định số lượng tế bào
sống phát triển từ quần thể tế bào ban đầu
qua các mốc thời gian. Tế bào được nuôi cấy
vào 33 giếng của đĩa 96 giếng với mật độ 103
a
c
tế bào/giếng. Mỗi ngày thực hiện đếm số
lượng tế bào sống trong 3 giếng bằng phương
pháp nhuộm Trypan Blue, thí nghiệm được
tiến hành liên tục trong 11 ngày.
III. KẾT QUẢ
1. Kết quả phân lập và nuôi cấy tế bào
tủy răng chuột
Quá trình nuôi cấy tế bào được quan sát
hàng ngày qua kính hiển vi quang học đảo
ngược. Sau 7 ngày, có thể quan sát được
hiện tượng tế bào bám trải xung quanh mảnh
mô. Lúc này, các tế bào có rất nhiều hình
dạng khác nhau như dạng hình thoi, dạng kéo
dài, dạng hình sao, dạng giống tế bào nội mô.
Ngoài ra, các tế bào hồng cầu từ các mạch
máu của tủy răng xuất hiện xung quanh mảnh
mô. Tuy nhiên, hồng cầu không có khả năng
bám vào bề mặt đĩa nuôi cấy và bị loại dần
sau một số lần thay môi trường.
b
d
Hình 1. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược,
tế bào tủy răng chuột nuôi cấy sơ cấp
a: Ngày 1: Mảnh mô tủy răng; b: Ngày 7: Tế bào bám trải từ rìa mảnh mô;
c: Ngày 14: Tế bào bao quanh hoàn toàn mảnh mô; d: Ngày 21: Tế bào hợp dòng.
TCNCYH 82 (2) - 2013
15
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Trong những ngày nuôi cấy tiếp theo, các
tế bào dần dần biểu hiện hình thái đặc trưng
của tế bào trung mô: tế bào trải dài, nhân lớn
hình oval trở nên chiếm ưu thế. Đến ngày thứ
14, hầu hết các tế bào có hình thái khá đồng
nhất, rải rác một vài tế bào có dạng hình sao
và dạng kéo dài. Các tế bào bắt đầu hợp dòng
vào khoảng ngày thứ 19 - 20, mật độ tế bào
chiếm 80 - 90% diện tích bề mặt nuôi cấy. Sau
3 tuần, các tế bào đã hợp dòng, trải thành một
lớp đơn phủ kín bề mặt đĩa nuôi (hình 1). Quá
trình nuôi cấy sơ cấp kết thúc vào thời điểm 3
tuần, các tế bào tủy răng được cấy sang chai
a
nuôi cấy mới nhằm tăng diện tích cho tế bào
bám dính và tăng sinh. Trong giai đoạn nuôi
cấy sơ cấp, các tế bào trải qua các giai đoạn
có hình thái và kích thước khá đa dạng. Ở các
thế hệ tế bào tiếp theo, tế bào có hình dạng
khá đồng nhất, các tế bào dạng hình thoi
chiếm ưu thế, đây là hình dạng đặc trưng của
tế bào trung mô (hình 2).
Đối với các tế bào nuôi cấy thứ cấp, như
P1, P2, P3, P4, thời gian hợp dòng của tế bào
vào khoảng 7 - 8 ngày. Như vậy, tốc độ tăng
sinh của tế bào nuôi cấy thứ cấp cao hơn so
với tế bào nuôi cấy sơ cấp.
b
Hình 2. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược tế bào tủy răng chuột P4 hợp dòng
(a: x 40); b: x 100).
2. Kết quả xác định tính gốc của tế bào
tủy răng chuột
Tế bào tủy răng chuột thế hệ thứ tư (P4)
được xác định tính gốc bằng phương pháp
Flow Cytometry. Kết quả cho thấy tỷ lệ tế bào
tủy răng chuột P4 dương tính với các marker
CD73 (99,75%), CD90 (91,92%,), CD105
(99,4%) và âm tính với các marker CD19
(1,53%), CD34 (0,86%), CD45 (0,47%) (hình 3).
3. Kết quả xây dựng đường cong tăng
trưởng tế bào
Sự tăng sinh tế bào được đánh giá bằng
phương pháp nhuộm Trypan Blue. Biểu đồ 1
mô tả số lượng tế bào sống được đánh giá
mỗi ngày trong quá trình nuôi cấy. Sau ngày
16
thứ nhất, tế bào có biểu hiện giảm số lượng.
Các tế bào tăng sinh mạnh từ ngày 1 đến
ngày 6 và có xu hướng ngừng hoạt động tăng
sinh. Từ ngày thứ 7, số lượng tế bào giảm
dần. Thời gian nhân đôi của tế bào là 45 giờ.
Kết quả các thí nghiệm trên cho thấy tế
bào được thu nhận và nuôi cấy có dạng hình
thoi, dài 80 - 100 µm, rộng 15 - 20 µm. Tế bào
có biểu hiện những marker dương tính của tế
bào trung mô như CD73, CD90, CD105 và
không biểu hiện những marker âm tính với tế
bào trung mô như CD19, CD34, CD45. Dựa
trên các tiêu chuẩn của Hiệp hội quốc tế về tế
bào gốc [6], các tế bào phân lập và nuôi cấy
từ mảnh mô tủy răng chuột trong thử nghiệm
này được xác định là tế bào gốc trung mô.
TCNCYH 82 (2) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Hình 3. Kết quả đánh giá marker bề mặt tế bào tủy răng chuột
Đường cong tăng trưởng
Biểu đồ 1. Đường cong tăng trưởng của tế bào tủy răng chuột thế hệ thứ tư
IV. BÀN LUẬN
Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem
Cells - MSC) là những tế bào có khả năng tự
phân chia và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào
có nguồn gốc trung mô như tế bào tạo sụn,
xương, mỡ, cơ và mô liên kết đệm. Do đó,
MSC được xem là nguồn tế bào gốc nhiều
triển vọng cho các phương pháp điều trị bằng
liệu pháp tế bào. MSC được đặc trưng bởi các
TCNCYH 82 (2) - 2013
marker in vitro như STRO-1, CD146, CD73,
CD90, CD105 hoặc CD44, 14. STRO-1 là một
protein màng dùng để xác định các tế bào gốc
trung mô ở tủy xương. MSC được thu từ
nhiều nguồn như tủy xương, máu cuống rốn,
mô mỡ, răng... MSC từ răng là nguồn tế bào
tự thân được thu nhận dễ dàng, ít gây xâm
lấn và có tiềm năng biệt hóa thành các loại tế
bào răng.
17
nguon tai.lieu . vn
Summary
PURIFICATION OF RECOMBINANT CELL PERMEABLE PROTEINS
AND THE POSSIBILITY FOR PROTEIN THERAPY
Inactivated proteins caused many human diseases. Protein therapy is one of the therapies for
many diseases related to a defected protein or inhibitor of a biological process to stop the growth
of the tumor. Here, we present the results of improved recombinant cell-penetrating peptides
(rCPPs). These rCPPs can serve as new tools for delivering protein in biology and medicine applications. We cloned the CPP in-frame with green fluorescent protein (rCPP - GFP). We were
able to express and purify full-length rCPP - GFP fusion proteins. The results showed that, each
purified r.protein was tested in Hela and Jurkat cell lines for their transduction efficiency and translocation. The purified rCPPs - GFP fusion proteins have biological activity as good as HIV virus
derived TAT - EGFP peptides. The expressed rCPPs-EGFPs were able to translocate across both
the cytoplasm and nucleus, thus, these intracellular regulatory proteins can be used as protein
transporters for therapeutic purposes.
Key words: CPP, protein recombination, TAT, therapeutic protein
PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG CHUỘT
Hoàng Đạo Bảo Trâm1, Tô Minh Quân2, Đoàn Nguyên Vũ2,
Nguyễn Thị Ngọc Mỹ2, Lê Thị Ngọc Hương2, Lưu Phương Nam3, Phan Kim Ngọc2
1
2
Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
3
Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng chuột được tiến hành trên 15 mẫu tủy răng chuột
nhắt trắng Mus musculus var. albino 2 - 3 tuần tuổi. Răng cửa hàm dưới chuột được xử lý bằng dung dịch
Peniciline 400UI/ml, Streptomycine 400µg/ml trong 20 phút. Mảnh mô tủy răng được nuôi cấy sơ cấp trên
đĩa 35mm trong môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml, ở
điều kiện 37oC, CO2 5%. Sau 3 tuần, các tế bào hợp dòng, cấy chuyền sang Flask 25cm2 và tiếp tục quá
trình nuôi cấy thứ cấp cho tới thế hệ thứ tư (P4). Sự biểu hiện các marker bề mặt của tế bào được đánh giá
bằng phương pháp Flow Cytometry. Kết quả cho thấy tế bào tủy răng chuột P4 có biểu hiện các marker của
tế bào gốc trung mô CD73, CD90, CD105 và không biểu hiện các marker của tế bào máu CD19, CD34,
CD45. Các tế bào có thời gian nhân đôi là 45 giờ và đỉnh đường cong tăng trưởng đạt vào ngày thứ 7. Tế
bào gốc tủy răng chuột đã được nuôi cấy thành công bằng phương pháp nuôi cấy mảnh mô tủy răng chuột.
Từ khóa: tế bào gốc tủy răng, phân lập tế bào, nuôi cấy tế bào
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tủy răng là mô liên kết chứa các tế bào,
mạch máu và thần kinh, có chức năng duy trì
TCNCYH 82 (2) - 2013
sự sống của răng. Tương tự như tủy xương,
tủy răng chứa các tế bào gốc trung mô. Ngoài
ra, tủy răng còn chứa tiền nguyên bào ngà và
13
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
tế bào tạo máu. Có thể nói tế bào tủy răng là
nguồn nguyên liệu quý đối với các nghiên cứu
trong lĩnh vực tái tạo mô răng và nha chu [1].
Các mô hình nghiên cứu in vitro và mô hình
nghiên cứu trên động vật là những giai đoạn
thử nghiệm quan trọng để chuẩn bị cho các
nghiên cứu ứng dụng tiếp theo trên người.
Nhiều tác giả trên thế giới đã sử dụng chuột
trong các thử nghiệm về tế bào gốc của răng
và tiềm năng biệt hóa và tạo mô của các tế
bào này. Các dòng tế bào tủy răng chuột biểu
hiện các phân tử bề mặt tế bào tương tự như
tế bào gốc tủy răng người, đây là những
phương tiện quý báu để xác định kiểu hình
của các dạng tế bào tiền thân khác nhau, dựa
trên các mức độ biểu hiện dưới quần thể khác
nhau của các phân tử bề mặt tế bào, từ đó có
thể đánh giá tiềm năng sửa chữa ở tủy răng
cũng như đối với các tổn thương mô vùng sọ mặt [2].
Nghiên cứu của Balic và cộng sự thực hiện
năm 2010, đánh giá trong điều kiện in vitro
các đặc tính của tế bào tiền thân của tủy răng
cửa của chuột. Kết quả nghiên cứu cho thấy
tủy răng cửa hàm dưới chưa mọc và đã mọc
chuột chứa một quần thể giàu tế bào tiền
thân và rất ít tế bào gốc, tương tự như các
răng cối chưa mọc của chuột; và quá trình
liên tục tạo nguyên bào ngà và ngà răng ở
mặt ngoài và mặt trong của các răng cửa
được thực hiện bởi quần thể tế bào tiền thân
chứ không phải từ các tế bào gốc trung mô
đa năng có trong tủy răng [3, 4]. Trong khi
đó, quần thể tế bào tủy răng cối đã mọc của
chuột chỉ chứa một số lượng nhỏ tế bào đa
Địa chỉ liên hệ: Hoàng Đạo Bảo Trâm, Đại học Y Dược
Thành phố Hồ Chí Minh - 217 Hồng Bàng, Quận 5, Thành
phố Hồ Chí Minh.
Email: hoangdaobaotram@gmail.com
Ngày nhận: 14/3/2013
Ngày được chấp thuận: 26/4/2013
14
năng [4]. Trong một thử nghiệm in vitro khác,
Shahrul và cộng sự tiến hành phân lập tế bào
gốc tủy răng chuột. Các tế bào này có tốc độ
tăng sinh cao và có khả năng biệt hóa thành
các tế bào tạo sụn [5].
Nằm trong một chuỗi nghiên cứu thử
nghiệm in vitro về tế bào gốc tủy răng được
phối hợp thực hiện giữa Đại học Y Dược
thành phố Hồ Chí Minh và Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành
phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu này được tiến
hành nhằm mục tiêu: phân lập và nuôi cấy tế
bào gốc của tủy răng chuột.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Phân lập và nuôi cấy tế bào tủy
răng chuột
Tủy răng được thu nhận từ răng hàm dưới
chuột nhắt trắng Mus musculus var. albino, 2 3 tuần tuổi, cân nặng 20 - 25g. Răng hàm
dưới chuột được xử lý bề mặt bằng dung dịch
Peniciline 400UI/ml và Streptomycine 400µg/
ml trong 20 phút.
Mảnh mô tủy được thu nhận và nuôi cấy
sơ cấp trong môi trường DMEM/F12 (Sigma)
bổ sung huyết thanh bào thai bò (FBS) 10%
(Sigma), Peniciline 100UI/ml (Sigma), Streptomycine 100µg/ml (Sigma) ở điều kiện 37oC,
5% CO2. Ở thời điểm hợp dòng, các tế bào
được cấy chuyền sang chai nuôi cấy Flask
25cm2 bằng dung dịch Trypsin/EDTA 0,25%:
0,02% (Sigma). Quá trình nuôi cấy thứ cấp
được tiếp tục thực hiện trong môi trường
DMEM/F12 bổ sung FBS 10%, Peniciline
100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml ở điều kiện
37oC, CO2 5%.
2. Xác định tính gốc của tế bào tủy răng
chuột
Tế bào tủy răng chuột được kiểm tra sự
biểu hiện các marker bề mặt CD73, CD90,
TCNCYH 82 (2) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
CD105 và CD19, CD34, CD45 bằng phương
pháp Flow Cytometry. Phương pháp này sử
dụng các loại kháng thể được gắn các hạt
phát huỳnh quang và có khả năng nhận diện
đặc hiệu một số marker bề mặt tế bào. Nếu tế
bào biểu hiện marker cần quan tâm, tế bào và
kháng thể đặc hiệu sẽ liên kết với nhau tại
marker tạo thành phức hợp tế bào - kháng
thể. Phức hợp này được nhận diện bởi máy
FACS thông qua hạt phát huỳnh quang trên
kháng thể. Nếu không biểu hiện, phức hợp tế
bào - kháng thể không được hình thành,
không thể được nhận diện bởi máy FACS.
3. Xây dựng đường cong tăng trưởng
tế bào
Đường cong tăng trưởng tế bào được xây
dựng bằng cách xác định số lượng tế bào
sống phát triển từ quần thể tế bào ban đầu
qua các mốc thời gian. Tế bào được nuôi cấy
vào 33 giếng của đĩa 96 giếng với mật độ 103
a
c
tế bào/giếng. Mỗi ngày thực hiện đếm số
lượng tế bào sống trong 3 giếng bằng phương
pháp nhuộm Trypan Blue, thí nghiệm được
tiến hành liên tục trong 11 ngày.
III. KẾT QUẢ
1. Kết quả phân lập và nuôi cấy tế bào
tủy răng chuột
Quá trình nuôi cấy tế bào được quan sát
hàng ngày qua kính hiển vi quang học đảo
ngược. Sau 7 ngày, có thể quan sát được
hiện tượng tế bào bám trải xung quanh mảnh
mô. Lúc này, các tế bào có rất nhiều hình
dạng khác nhau như dạng hình thoi, dạng kéo
dài, dạng hình sao, dạng giống tế bào nội mô.
Ngoài ra, các tế bào hồng cầu từ các mạch
máu của tủy răng xuất hiện xung quanh mảnh
mô. Tuy nhiên, hồng cầu không có khả năng
bám vào bề mặt đĩa nuôi cấy và bị loại dần
sau một số lần thay môi trường.
b
d
Hình 1. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược,
tế bào tủy răng chuột nuôi cấy sơ cấp
a: Ngày 1: Mảnh mô tủy răng; b: Ngày 7: Tế bào bám trải từ rìa mảnh mô;
c: Ngày 14: Tế bào bao quanh hoàn toàn mảnh mô; d: Ngày 21: Tế bào hợp dòng.
TCNCYH 82 (2) - 2013
15
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Trong những ngày nuôi cấy tiếp theo, các
tế bào dần dần biểu hiện hình thái đặc trưng
của tế bào trung mô: tế bào trải dài, nhân lớn
hình oval trở nên chiếm ưu thế. Đến ngày thứ
14, hầu hết các tế bào có hình thái khá đồng
nhất, rải rác một vài tế bào có dạng hình sao
và dạng kéo dài. Các tế bào bắt đầu hợp dòng
vào khoảng ngày thứ 19 - 20, mật độ tế bào
chiếm 80 - 90% diện tích bề mặt nuôi cấy. Sau
3 tuần, các tế bào đã hợp dòng, trải thành một
lớp đơn phủ kín bề mặt đĩa nuôi (hình 1). Quá
trình nuôi cấy sơ cấp kết thúc vào thời điểm 3
tuần, các tế bào tủy răng được cấy sang chai
a
nuôi cấy mới nhằm tăng diện tích cho tế bào
bám dính và tăng sinh. Trong giai đoạn nuôi
cấy sơ cấp, các tế bào trải qua các giai đoạn
có hình thái và kích thước khá đa dạng. Ở các
thế hệ tế bào tiếp theo, tế bào có hình dạng
khá đồng nhất, các tế bào dạng hình thoi
chiếm ưu thế, đây là hình dạng đặc trưng của
tế bào trung mô (hình 2).
Đối với các tế bào nuôi cấy thứ cấp, như
P1, P2, P3, P4, thời gian hợp dòng của tế bào
vào khoảng 7 - 8 ngày. Như vậy, tốc độ tăng
sinh của tế bào nuôi cấy thứ cấp cao hơn so
với tế bào nuôi cấy sơ cấp.
b
Hình 2. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược tế bào tủy răng chuột P4 hợp dòng
(a: x 40); b: x 100).
2. Kết quả xác định tính gốc của tế bào
tủy răng chuột
Tế bào tủy răng chuột thế hệ thứ tư (P4)
được xác định tính gốc bằng phương pháp
Flow Cytometry. Kết quả cho thấy tỷ lệ tế bào
tủy răng chuột P4 dương tính với các marker
CD73 (99,75%), CD90 (91,92%,), CD105
(99,4%) và âm tính với các marker CD19
(1,53%), CD34 (0,86%), CD45 (0,47%) (hình 3).
3. Kết quả xây dựng đường cong tăng
trưởng tế bào
Sự tăng sinh tế bào được đánh giá bằng
phương pháp nhuộm Trypan Blue. Biểu đồ 1
mô tả số lượng tế bào sống được đánh giá
mỗi ngày trong quá trình nuôi cấy. Sau ngày
16
thứ nhất, tế bào có biểu hiện giảm số lượng.
Các tế bào tăng sinh mạnh từ ngày 1 đến
ngày 6 và có xu hướng ngừng hoạt động tăng
sinh. Từ ngày thứ 7, số lượng tế bào giảm
dần. Thời gian nhân đôi của tế bào là 45 giờ.
Kết quả các thí nghiệm trên cho thấy tế
bào được thu nhận và nuôi cấy có dạng hình
thoi, dài 80 - 100 µm, rộng 15 - 20 µm. Tế bào
có biểu hiện những marker dương tính của tế
bào trung mô như CD73, CD90, CD105 và
không biểu hiện những marker âm tính với tế
bào trung mô như CD19, CD34, CD45. Dựa
trên các tiêu chuẩn của Hiệp hội quốc tế về tế
bào gốc [6], các tế bào phân lập và nuôi cấy
từ mảnh mô tủy răng chuột trong thử nghiệm
này được xác định là tế bào gốc trung mô.
TCNCYH 82 (2) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Hình 3. Kết quả đánh giá marker bề mặt tế bào tủy răng chuột
Đường cong tăng trưởng
Biểu đồ 1. Đường cong tăng trưởng của tế bào tủy răng chuột thế hệ thứ tư
IV. BÀN LUẬN
Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem
Cells - MSC) là những tế bào có khả năng tự
phân chia và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào
có nguồn gốc trung mô như tế bào tạo sụn,
xương, mỡ, cơ và mô liên kết đệm. Do đó,
MSC được xem là nguồn tế bào gốc nhiều
triển vọng cho các phương pháp điều trị bằng
liệu pháp tế bào. MSC được đặc trưng bởi các
TCNCYH 82 (2) - 2013
marker in vitro như STRO-1, CD146, CD73,
CD90, CD105 hoặc CD44, 14. STRO-1 là một
protein màng dùng để xác định các tế bào gốc
trung mô ở tủy xương. MSC được thu từ
nhiều nguồn như tủy xương, máu cuống rốn,
mô mỡ, răng... MSC từ răng là nguồn tế bào
tự thân được thu nhận dễ dàng, ít gây xâm
lấn và có tiềm năng biệt hóa thành các loại tế
bào răng.
17