Xem mẫu
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
PHÁ VỠ ESCHERISCHIA COLI TÁI TỔ HỢP BẰNG LYSOZYM
ĐỂ PHÂN TÍCH CÁC ENZYM ĐƯỢC BIỂU HIỆN
Lê Thị Kim Tuyến1, Bạch Khánh Hòa2
1
Trường Đại học Thăng Long, 2Trường Đại học Y Hà Nội
Việc thu thập protein tái tổ hợp sau khi biến nạp vào Escherichia coli, nhất là những protein có hoạt tính
enzym, đòi hỏi một phương pháp phá vỡ tế bào hợp lý để hoạt tính enzym được bảo toàn. Nghiên cứu nhằm
sử dụng lysozim để phá vỡ Escherichia coli. Phương pháp nghiên cứu: chủng tế bào ER 3081 được biến
nạp với pSAPV6 tái tổ hợp chứa gen enzim hạn chế của chủng Rothia dendocariosa ATCC 17931.
Lysozim được dùng để phá vỡ tế bào ở các điều kiện thí nghiệm khác nhau và đồng thời hoạt tính enzym
hạn chế được kiểm tra. Kết quả cho thấy phương pháp sử dụng lysozim để phá vỡ vi khuẩn cho phép thu
thập enzim hạn chế tái tổ hợp giữ hoạt tính cao.
Từ khóa: Phá vỡ tế bào - Escherichia coli, protein tái tổ hợp, nguyên sinh chất, lysozim
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
không quá 40°C hoặc một số hóa chất thích
được sử dụng khi nghiên cứu các thành phần
hợp. Những phương pháp thường được dùng
như siêu âm, nghiền nát, áp lực cao đã được
của sinh tổng hợp tế bào. Gần đây, với sự phát
triển ngành sinh học phân tử, vi khuẩn này còn
nhiều tác giả nghiên cứu so sánh với nhau [1].
Việc dùng máy móc thường tạo ra hiệu lực rất
được dùng làm tế bào chủ cho các plasmit tái
tổ hợp trong phương pháp clon gen. Phương
cao để vỡ màng tế bào nhưng cũng ảnh
Trong lịch sử, Escherichia coli thường
pháp này rất cần thiết cho việc sản xuất các
loại protein ứng dụng trong nghiên cứu và
hưởng không ít đến sự nguyên vẹn của các
protein được giải phóng. Mặt khác, các vách
nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội [2]. Việc
tế bào vi khuẩn chứa một lớp peptidoglycan
và lysozim là một enzim có chức năng phân
nghiên cứu các protein trong nguyên sinh chất
của Escherichia coli đòi hỏi trải qua giai đoạn
hủy đặc hiệu peptidoglycan, do vậy nó có vai
trò làm phá vỡ các vi khuẩn. Tuy nhiên, pepti-
phá vỡ tế bào vi khuẩn. Có rất nhiều phương
pháp vật lý đã được dùng như nghiền nát,
doglycan là thành phần chính của vách tế bào
siêu âm hoặc nhiệt độ cao để làm vỡ cả màng
ở vi khuẩn Gram + trong khi ở vi khuẩn Gram trong đó có Escherichia coli, lớp peptidoglycan
và vách tế bào. Có phương pháp sử dụng
chất hóa học như dùng hóa chất kiềm. Vấn đề
mỏng và còn bị bao phủ bằng một lớp màng
bên ngoài [3]. Sử dụng phương pháp enzym
đặt ra là lựa chọn một phương pháp phù hợp
nhằm bảo vệ được hoạt tính cao của những
để phá vỡ vi khuẩn là tốt nhất để giữ nguyên
vẹn các protein trong nguyên sinh chất, thêm
protein dễ bị thoái hóa. Điều đó có nghĩa là
phương pháp này chỉ sử dụng với nhiệt độ
nữa không đòi hỏi máy móc.
Địa chỉ liên hệ: Bạch Khánh Hòa, bộ môn Huyết học Truyền máu, trường Đại học Y Hà Nội,
Email: hoa17med@gmail.com
Ngày nhận: 08/01/2013
Ngày được chấp thuận: 20/6/2013
8
Đã có một quy trình sử dụng lyzozim
ở nhiệt độ cao 100ºC để phá vi khuẩn
Escherichia coli trong quá trình tách chiết ADN
[4]. Tuy nhiên, quy trình này không áp dụng
được cho việc nghiên cứu protein vì nhiệt độ
cao làm thoái hóa và mất hoạt tính protein. Vì
lý do đó, chúng tôi nghiên cứu sử dụng
TCNCYH 83 (3) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
lysozim để phá vỡ vi khuẩn Escherichia coli ở
mM EDTA, 3,3mM Tris HCl pH8, 0,017% SDS
nhiệt độ ≤ 40°C nhằm bảo vệ được hoạt tính
protein. Quy trình này áp dụng cho việc phân
và 0,015% bromophenol blue). Sản phẩm
phản ứng được phân tích trên gel 1% agarose
tích các enzym tái tổ hợp được biểu hiện
trong nguyên sinh chất.
cùng với các thang ADN chuẩn lambda - Hind
III và PhiX174 - HaeIII hoặc lambda - BstEII và
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
pBR322 - MspI [5]. Các gel được chụp với
máy ảnh Canon 50D theo phương pháp của
1.
Chủng vi khuẩn
Sử dụng chủng tế bào ER 3081 (F-λ- fhuA2
lacZ::T7 gene1 [lon] ompT gal attB::(pCD13lysY, lacIq) sulA11 R(mcr-73::miniTn10-TetS)2
[dcm] R(zgb- 210::Tn10 –TetS) endA1 D
Porch T. và Erpelding J.E [6].
4. Tinh chế enzim trên cột HeparineSepharose 6B (Pharmacia)
Nguyên sinh chất được tinh chế qua 1ml
cột Heparine-Sepharose 6B đã cân bằng với
(mcrC-mrr)114::IS10). Chủng này được biến
nạp với pSAPV6 [6] tái tổ hợp chứa gen
dung dịch đệm phá tế bào có thêm 0,05 M
enzym hạn chế của chủng Rothia dendocariosa ATCC 17931.
đệm phá tế bào chứa 0,05 M NaCl trước khi
NaCl. Cột được rửa 5 lần với 1ml dung dịch
tiến hành loại enzim bằng 10 ml gradient NaCl
2. Phá tế bào
0,1 - 0,9M trong đệm phá tế bào. Thể tích mỗi
30 ml huyền dịch tế bào nuôi cấy trong môi
phân đoạn thu được là 0,3 ml.
trường LB + Amp ở 37°C qua đêm được ly
tâm trong tuyp Falcon 5', với tốc độ 8000 rpm.
Cặn tế bào được hòa tan trong 1,5ml dung
dịch đệm phá tế bào (20 mM Tris, 1mM DTT,
III. KẾT QUẢ
1. Quán sát sự phá vỡ E. coli
Hình
1
cho
thấy hỗn
dịch
tế
bào
0,1 mM EDTA). Nhiều nồng độ tế bào được
hòa loãng từ 1/1, 1/2, 1/4 và 1/8. Thêm tuần
Escherichia coli trong dần sau khi được xử lý
tự vào các ống 20, 10, 5 và 2,5 µl dung dịch
lysozim 10 mg/ml (Sigma) để có một tỷ lệ
của tế bào bị phân hủy dẫn đến tế bào vi khuẩn
tương đương giữa tế bào/lysozim. Ủ 1 giờ ở
4°C. Ly tâm 5' ở 12.000v/p ở 4°C.
3. Phản ứng cắt ADN hạn chế
Hoạt tính của enzim hạn chế được thử ở
nhiều độ pha loãng của nước nổi bậc 3 (9, 3,
bằng lysozim. Điều này chứng tỏ peptidoglycan
bị phá vỡ, làm giảm độ đục của hỗn dịch.
Cũng có thể quan sát tế bào Escherichia
coli bị phá vỡ bằng lysozim sau khi ly tâm ở
hình 2.
1: Escherichia coli chứng cho thấy vi khuẩn
1, 1/3 µl) trong đệm phản ứng (NEBuffer 4: 20
mM Tris-acetate, pH 7.9, 10 mM magnesium
không bị phá vỡ, cặn lắng đẹp; 2: vi khuẩn
tươi (mới thu hoạch sau khi nuôi cấy); 3: vi
acetate, 50 mM potassium acetate, 1 mM
khuẩn đông lạnh ở - 30°C, 4 vi khuẩn biến nạp
DTT, 100 µg/ml BSA và 80 µM AdoMet) với 1
với plasmid tái tổ hợp mang enzim hạn chế
μg cơ chất ADN (pAdeBsaBI) cho mỗi 50 μl
bảo quản ở - 30°C, cho thấy hiệu quả phá vỡ
thể tích phản ứng. Ủ 20 phút ở 37°C. Dừng
tế bào khác nhau tùy theo tình trạng tế bào.
phản ứng với đệm Gel Loading Dye, Blue của
Tế bào vỡ càng nhiều thì thể tích cặn tế bào
càng lớn và màu nước nổi càng đậm.
New England Biolabs (2,5% Ficoll - 400, 11
TCNCYH 83 (3) - 2013
9
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
1
2
Hình 1. Sự phá vỡ E. coli với lysozim
1: Hỗn dịch vi khuẩn chứng
2: Hỗn dịch vi khuẩn cho thêm lysozim
1
2
3
4
Hình 2. Sự phá vỡ E. coli với lysozim sau ly tâm
1: E. coli chứng
2: vi khuẩn tươi
3: vi khuẩn đông lạnh ở - 30°C
4: vi khuẩn biến nạp với plasmid tái tổ hợp mang enzym hạn chế đông lạnh
2. Ảnh hưởng của nồng độ tế bào
Hình 3: Phá vỡ Escherichia coli bằng cách
sử dụng một tỷ lệ lysozim/số tế bào tương
ứng, 4 nồng độ 1/1, 1/2, 1/4 và 1/8.
Bảng 1 cho thấy, ở độ pha loãng tế bào
1/8, sự phá vỡ cao nhất, gần gấp 3 lần tế bào
không pha loãng.
Theo kết quả trên hình 3, có thể cho rằng
Hiệu quả sự phá vỡ này được phân tích
khi đo nồng độ endonucleasa trong nguyên
3µl nguyên sinh chất của nồng độ tế bào 1/1 là
thể tích chứa đựng 1U endonucleasa. Trên cơ
sinh chất bằng kỹ thuật bán định lượng. Nếu
cho rằng 1U enzym là đơn vị cho phép thủy
sở đó, có thể suy ra số đơn vị endonucleasa
trong nguyên sinh chất tế bào vỡ ở nồng độ
phân hoàn toàn lượng ADN chuẩn đang
dùng, thì có thể ước lượng số đơn vị
tiếp theo.
endonucleasa có được ở các nồng độ tế bào.
còn có sự hoạt động của các endonucleasa vi
10
Lưu ý: bên cạnh enzym hạn chế tái tổ hợp
TCNCYH 83 (3) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
khuẩn, vì thế hình vạch ADN hạn chế không được thấy rõ.
Bảng 1. Ước lượng endonucleasa trong nguyên sinh chất
các tế bào vỡ bằng lysozim tùy theo nồng độ tế bào
Nồng độ tế bào
1U
U/ml
1/1
3 ml
333
1/2
6 ml
333
1/4
12 ml
666
1/8
9 ml
888
Hình 3. Hoạt tính endonucleasa trong 9, 3, 1, 1/3 ml nguyên sinh chất
1 - 4: nồng độ tế bào 1/1;
6 - 9: nồng độ tế bào 1/2;
11 - 14: nồng độ tế bào 1/4;
16 - 19: nồng độ tế bào 1/8;
5, 10, 15 và 20: ADN thang λ-Hind III + PhiX174-Hae III.
3. Quan sát enzym hạn chế tái tổ hợp
Để xem hoạt động enzym hạn chế tái tổ hợp, nguyên sinh chất của hỗn hợp vi khuẩn ở độ
pha loãng 1/1 được đưa qua cột heparine - sepharose. Hình 4: Enzym hạn chế tái tổ hợp nhiều
nhất ở phân đoạn 15 - 16 và mức độ hoạt tính này đã cho phép xác định tính đặc hiệu của enzym.
TCNCYH 83 (3) - 2013
11
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Hình 4. Endonucleasa tái tổ hợp trong các phân đoạn
sau khi qua cột heparin - sepharose
2 - 7: phân đoạn 3, 5, 7, 9, 10, 11;
9 - 16: phân đoạn 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19;
18 - 24: phân đoạn 20, 21, 23, 25, 27, 29, 31;
1, 8, 17 và 25: ADN thang λ-Hind III + PhiX174-Hae III.
IV. BÀN LUẬN
Sự phá vỡ Escherichia coli với lysozim sau
(ống nghiệm số 4) thì hiệu quả phá vỡ cao
ly tâm được quan sát rõ ở hình 2. Ống nghiệm
nhất. Thật ra, sự biểu hiện của enzym hạn chế
tái tổ hợp đã gây hiện tượng hủy hoại vật chủ
số 1, vi khuẩn không bị phá vỡ, có cặn tủa
gọn gàng ở dưới đáy ống nghiệm với thể tích
và do vậy tế bào dễ vỡ hơn. Theo lý thuyết,
Escherichia coli là vi khuẩn Gram - có thành
nhỏ nhất . Ống nghiệm số 2, vi khuẩn bị phá
vỡ sẽ phồng lên và không đủ độ nặng để lắng
phần murein ít hơn Gram + và có thêm lớp
màng tế bào bao quanh, do đó có thể suy nghĩ
dưới đáy ống nghiệm nữa mặc dù cùng tốc độ
ly tâm. Thêm nữa, nước nổi có sự thay đổi
rằng sự phá vỡ vi khuẩn này không hiệu quả.
màu, càng nhiều tế bào vỡ màu càng đậm. Khi
hỗn dịch Escherichia coli bị đông lạnh ở -30°C
(ống nghiệm số 3), tủa tế bào phồng lên hơn
so với vi khuẩn được thu hoạch tươi chứng tỏ
Tuy nhiên, kết quả cho thấy có sự phá vỡ tế
bào trong điều kiện thí nghiệm được thiết lập.
Khi kết hợp việc đông lạnh vi khuẩn trước khi
xử lý bằng lysozim, việc phá vỡ tế bào hiệu
quả hơn.
Ở độ pha loãng tế bào 1/8, hiệu quả phá
vi khuẩn bị phá vỡ nhiều hơn. Điều này được
giải thích như sau: khi đông lạnh (cũng là tác
vỡ đạt cao nhất, gần gấp 3 lần tế bào không
động vật lý) gây ra sự phá hủy màng tế bào
bằng cách tách rời các phân tử cấu trúc ra
pha loãng (bảng 1). Điều này cần lưu ý khi
muốn thu lại nhiều sản phẩm. Nhưng cần phải
khỏi nhau. Trong khi dùng Escherichia coli đã
biến nạp với plasmid tái tổ hợp mang gen enzym
thao tác với thể tích hỗn hợp tối thiểu nhiều
hơn 8 lần so với thể tích ban đầu. Tuy nhiên,
hạn chế và bị đông lạnh trước khi dùng lysozim
đối với việc phân tích tính chất enzym, số
12
TCNCYH 83 (3) - 2013
nguon tai.lieu . vn
PHÁ VỠ ESCHERISCHIA COLI TÁI TỔ HỢP BẰNG LYSOZYM
ĐỂ PHÂN TÍCH CÁC ENZYM ĐƯỢC BIỂU HIỆN
Lê Thị Kim Tuyến1, Bạch Khánh Hòa2
1
Trường Đại học Thăng Long, 2Trường Đại học Y Hà Nội
Việc thu thập protein tái tổ hợp sau khi biến nạp vào Escherichia coli, nhất là những protein có hoạt tính
enzym, đòi hỏi một phương pháp phá vỡ tế bào hợp lý để hoạt tính enzym được bảo toàn. Nghiên cứu nhằm
sử dụng lysozim để phá vỡ Escherichia coli. Phương pháp nghiên cứu: chủng tế bào ER 3081 được biến
nạp với pSAPV6 tái tổ hợp chứa gen enzim hạn chế của chủng Rothia dendocariosa ATCC 17931.
Lysozim được dùng để phá vỡ tế bào ở các điều kiện thí nghiệm khác nhau và đồng thời hoạt tính enzym
hạn chế được kiểm tra. Kết quả cho thấy phương pháp sử dụng lysozim để phá vỡ vi khuẩn cho phép thu
thập enzim hạn chế tái tổ hợp giữ hoạt tính cao.
Từ khóa: Phá vỡ tế bào - Escherichia coli, protein tái tổ hợp, nguyên sinh chất, lysozim
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
không quá 40°C hoặc một số hóa chất thích
được sử dụng khi nghiên cứu các thành phần
hợp. Những phương pháp thường được dùng
như siêu âm, nghiền nát, áp lực cao đã được
của sinh tổng hợp tế bào. Gần đây, với sự phát
triển ngành sinh học phân tử, vi khuẩn này còn
nhiều tác giả nghiên cứu so sánh với nhau [1].
Việc dùng máy móc thường tạo ra hiệu lực rất
được dùng làm tế bào chủ cho các plasmit tái
tổ hợp trong phương pháp clon gen. Phương
cao để vỡ màng tế bào nhưng cũng ảnh
Trong lịch sử, Escherichia coli thường
pháp này rất cần thiết cho việc sản xuất các
loại protein ứng dụng trong nghiên cứu và
hưởng không ít đến sự nguyên vẹn của các
protein được giải phóng. Mặt khác, các vách
nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội [2]. Việc
tế bào vi khuẩn chứa một lớp peptidoglycan
và lysozim là một enzim có chức năng phân
nghiên cứu các protein trong nguyên sinh chất
của Escherichia coli đòi hỏi trải qua giai đoạn
hủy đặc hiệu peptidoglycan, do vậy nó có vai
trò làm phá vỡ các vi khuẩn. Tuy nhiên, pepti-
phá vỡ tế bào vi khuẩn. Có rất nhiều phương
pháp vật lý đã được dùng như nghiền nát,
doglycan là thành phần chính của vách tế bào
siêu âm hoặc nhiệt độ cao để làm vỡ cả màng
ở vi khuẩn Gram + trong khi ở vi khuẩn Gram trong đó có Escherichia coli, lớp peptidoglycan
và vách tế bào. Có phương pháp sử dụng
chất hóa học như dùng hóa chất kiềm. Vấn đề
mỏng và còn bị bao phủ bằng một lớp màng
bên ngoài [3]. Sử dụng phương pháp enzym
đặt ra là lựa chọn một phương pháp phù hợp
nhằm bảo vệ được hoạt tính cao của những
để phá vỡ vi khuẩn là tốt nhất để giữ nguyên
vẹn các protein trong nguyên sinh chất, thêm
protein dễ bị thoái hóa. Điều đó có nghĩa là
phương pháp này chỉ sử dụng với nhiệt độ
nữa không đòi hỏi máy móc.
Địa chỉ liên hệ: Bạch Khánh Hòa, bộ môn Huyết học Truyền máu, trường Đại học Y Hà Nội,
Email: hoa17med@gmail.com
Ngày nhận: 08/01/2013
Ngày được chấp thuận: 20/6/2013
8
Đã có một quy trình sử dụng lyzozim
ở nhiệt độ cao 100ºC để phá vi khuẩn
Escherichia coli trong quá trình tách chiết ADN
[4]. Tuy nhiên, quy trình này không áp dụng
được cho việc nghiên cứu protein vì nhiệt độ
cao làm thoái hóa và mất hoạt tính protein. Vì
lý do đó, chúng tôi nghiên cứu sử dụng
TCNCYH 83 (3) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
lysozim để phá vỡ vi khuẩn Escherichia coli ở
mM EDTA, 3,3mM Tris HCl pH8, 0,017% SDS
nhiệt độ ≤ 40°C nhằm bảo vệ được hoạt tính
protein. Quy trình này áp dụng cho việc phân
và 0,015% bromophenol blue). Sản phẩm
phản ứng được phân tích trên gel 1% agarose
tích các enzym tái tổ hợp được biểu hiện
trong nguyên sinh chất.
cùng với các thang ADN chuẩn lambda - Hind
III và PhiX174 - HaeIII hoặc lambda - BstEII và
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
pBR322 - MspI [5]. Các gel được chụp với
máy ảnh Canon 50D theo phương pháp của
1.
Chủng vi khuẩn
Sử dụng chủng tế bào ER 3081 (F-λ- fhuA2
lacZ::T7 gene1 [lon] ompT gal attB::(pCD13lysY, lacIq) sulA11 R(mcr-73::miniTn10-TetS)2
[dcm] R(zgb- 210::Tn10 –TetS) endA1 D
Porch T. và Erpelding J.E [6].
4. Tinh chế enzim trên cột HeparineSepharose 6B (Pharmacia)
Nguyên sinh chất được tinh chế qua 1ml
cột Heparine-Sepharose 6B đã cân bằng với
(mcrC-mrr)114::IS10). Chủng này được biến
nạp với pSAPV6 [6] tái tổ hợp chứa gen
dung dịch đệm phá tế bào có thêm 0,05 M
enzym hạn chế của chủng Rothia dendocariosa ATCC 17931.
đệm phá tế bào chứa 0,05 M NaCl trước khi
NaCl. Cột được rửa 5 lần với 1ml dung dịch
tiến hành loại enzim bằng 10 ml gradient NaCl
2. Phá tế bào
0,1 - 0,9M trong đệm phá tế bào. Thể tích mỗi
30 ml huyền dịch tế bào nuôi cấy trong môi
phân đoạn thu được là 0,3 ml.
trường LB + Amp ở 37°C qua đêm được ly
tâm trong tuyp Falcon 5', với tốc độ 8000 rpm.
Cặn tế bào được hòa tan trong 1,5ml dung
dịch đệm phá tế bào (20 mM Tris, 1mM DTT,
III. KẾT QUẢ
1. Quán sát sự phá vỡ E. coli
Hình
1
cho
thấy hỗn
dịch
tế
bào
0,1 mM EDTA). Nhiều nồng độ tế bào được
hòa loãng từ 1/1, 1/2, 1/4 và 1/8. Thêm tuần
Escherichia coli trong dần sau khi được xử lý
tự vào các ống 20, 10, 5 và 2,5 µl dung dịch
lysozim 10 mg/ml (Sigma) để có một tỷ lệ
của tế bào bị phân hủy dẫn đến tế bào vi khuẩn
tương đương giữa tế bào/lysozim. Ủ 1 giờ ở
4°C. Ly tâm 5' ở 12.000v/p ở 4°C.
3. Phản ứng cắt ADN hạn chế
Hoạt tính của enzim hạn chế được thử ở
nhiều độ pha loãng của nước nổi bậc 3 (9, 3,
bằng lysozim. Điều này chứng tỏ peptidoglycan
bị phá vỡ, làm giảm độ đục của hỗn dịch.
Cũng có thể quan sát tế bào Escherichia
coli bị phá vỡ bằng lysozim sau khi ly tâm ở
hình 2.
1: Escherichia coli chứng cho thấy vi khuẩn
1, 1/3 µl) trong đệm phản ứng (NEBuffer 4: 20
mM Tris-acetate, pH 7.9, 10 mM magnesium
không bị phá vỡ, cặn lắng đẹp; 2: vi khuẩn
tươi (mới thu hoạch sau khi nuôi cấy); 3: vi
acetate, 50 mM potassium acetate, 1 mM
khuẩn đông lạnh ở - 30°C, 4 vi khuẩn biến nạp
DTT, 100 µg/ml BSA và 80 µM AdoMet) với 1
với plasmid tái tổ hợp mang enzim hạn chế
μg cơ chất ADN (pAdeBsaBI) cho mỗi 50 μl
bảo quản ở - 30°C, cho thấy hiệu quả phá vỡ
thể tích phản ứng. Ủ 20 phút ở 37°C. Dừng
tế bào khác nhau tùy theo tình trạng tế bào.
phản ứng với đệm Gel Loading Dye, Blue của
Tế bào vỡ càng nhiều thì thể tích cặn tế bào
càng lớn và màu nước nổi càng đậm.
New England Biolabs (2,5% Ficoll - 400, 11
TCNCYH 83 (3) - 2013
9
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
1
2
Hình 1. Sự phá vỡ E. coli với lysozim
1: Hỗn dịch vi khuẩn chứng
2: Hỗn dịch vi khuẩn cho thêm lysozim
1
2
3
4
Hình 2. Sự phá vỡ E. coli với lysozim sau ly tâm
1: E. coli chứng
2: vi khuẩn tươi
3: vi khuẩn đông lạnh ở - 30°C
4: vi khuẩn biến nạp với plasmid tái tổ hợp mang enzym hạn chế đông lạnh
2. Ảnh hưởng của nồng độ tế bào
Hình 3: Phá vỡ Escherichia coli bằng cách
sử dụng một tỷ lệ lysozim/số tế bào tương
ứng, 4 nồng độ 1/1, 1/2, 1/4 và 1/8.
Bảng 1 cho thấy, ở độ pha loãng tế bào
1/8, sự phá vỡ cao nhất, gần gấp 3 lần tế bào
không pha loãng.
Theo kết quả trên hình 3, có thể cho rằng
Hiệu quả sự phá vỡ này được phân tích
khi đo nồng độ endonucleasa trong nguyên
3µl nguyên sinh chất của nồng độ tế bào 1/1 là
thể tích chứa đựng 1U endonucleasa. Trên cơ
sinh chất bằng kỹ thuật bán định lượng. Nếu
cho rằng 1U enzym là đơn vị cho phép thủy
sở đó, có thể suy ra số đơn vị endonucleasa
trong nguyên sinh chất tế bào vỡ ở nồng độ
phân hoàn toàn lượng ADN chuẩn đang
dùng, thì có thể ước lượng số đơn vị
tiếp theo.
endonucleasa có được ở các nồng độ tế bào.
còn có sự hoạt động của các endonucleasa vi
10
Lưu ý: bên cạnh enzym hạn chế tái tổ hợp
TCNCYH 83 (3) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
khuẩn, vì thế hình vạch ADN hạn chế không được thấy rõ.
Bảng 1. Ước lượng endonucleasa trong nguyên sinh chất
các tế bào vỡ bằng lysozim tùy theo nồng độ tế bào
Nồng độ tế bào
1U
U/ml
1/1
3 ml
333
1/2
6 ml
333
1/4
12 ml
666
1/8
9 ml
888
Hình 3. Hoạt tính endonucleasa trong 9, 3, 1, 1/3 ml nguyên sinh chất
1 - 4: nồng độ tế bào 1/1;
6 - 9: nồng độ tế bào 1/2;
11 - 14: nồng độ tế bào 1/4;
16 - 19: nồng độ tế bào 1/8;
5, 10, 15 và 20: ADN thang λ-Hind III + PhiX174-Hae III.
3. Quan sát enzym hạn chế tái tổ hợp
Để xem hoạt động enzym hạn chế tái tổ hợp, nguyên sinh chất của hỗn hợp vi khuẩn ở độ
pha loãng 1/1 được đưa qua cột heparine - sepharose. Hình 4: Enzym hạn chế tái tổ hợp nhiều
nhất ở phân đoạn 15 - 16 và mức độ hoạt tính này đã cho phép xác định tính đặc hiệu của enzym.
TCNCYH 83 (3) - 2013
11
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Hình 4. Endonucleasa tái tổ hợp trong các phân đoạn
sau khi qua cột heparin - sepharose
2 - 7: phân đoạn 3, 5, 7, 9, 10, 11;
9 - 16: phân đoạn 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19;
18 - 24: phân đoạn 20, 21, 23, 25, 27, 29, 31;
1, 8, 17 và 25: ADN thang λ-Hind III + PhiX174-Hae III.
IV. BÀN LUẬN
Sự phá vỡ Escherichia coli với lysozim sau
(ống nghiệm số 4) thì hiệu quả phá vỡ cao
ly tâm được quan sát rõ ở hình 2. Ống nghiệm
nhất. Thật ra, sự biểu hiện của enzym hạn chế
tái tổ hợp đã gây hiện tượng hủy hoại vật chủ
số 1, vi khuẩn không bị phá vỡ, có cặn tủa
gọn gàng ở dưới đáy ống nghiệm với thể tích
và do vậy tế bào dễ vỡ hơn. Theo lý thuyết,
Escherichia coli là vi khuẩn Gram - có thành
nhỏ nhất . Ống nghiệm số 2, vi khuẩn bị phá
vỡ sẽ phồng lên và không đủ độ nặng để lắng
phần murein ít hơn Gram + và có thêm lớp
màng tế bào bao quanh, do đó có thể suy nghĩ
dưới đáy ống nghiệm nữa mặc dù cùng tốc độ
ly tâm. Thêm nữa, nước nổi có sự thay đổi
rằng sự phá vỡ vi khuẩn này không hiệu quả.
màu, càng nhiều tế bào vỡ màu càng đậm. Khi
hỗn dịch Escherichia coli bị đông lạnh ở -30°C
(ống nghiệm số 3), tủa tế bào phồng lên hơn
so với vi khuẩn được thu hoạch tươi chứng tỏ
Tuy nhiên, kết quả cho thấy có sự phá vỡ tế
bào trong điều kiện thí nghiệm được thiết lập.
Khi kết hợp việc đông lạnh vi khuẩn trước khi
xử lý bằng lysozim, việc phá vỡ tế bào hiệu
quả hơn.
Ở độ pha loãng tế bào 1/8, hiệu quả phá
vi khuẩn bị phá vỡ nhiều hơn. Điều này được
giải thích như sau: khi đông lạnh (cũng là tác
vỡ đạt cao nhất, gần gấp 3 lần tế bào không
động vật lý) gây ra sự phá hủy màng tế bào
bằng cách tách rời các phân tử cấu trúc ra
pha loãng (bảng 1). Điều này cần lưu ý khi
muốn thu lại nhiều sản phẩm. Nhưng cần phải
khỏi nhau. Trong khi dùng Escherichia coli đã
biến nạp với plasmid tái tổ hợp mang gen enzym
thao tác với thể tích hỗn hợp tối thiểu nhiều
hơn 8 lần so với thể tích ban đầu. Tuy nhiên,
hạn chế và bị đông lạnh trước khi dùng lysozim
đối với việc phân tích tính chất enzym, số
12
TCNCYH 83 (3) - 2013