Xem mẫu
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015
NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA
YERSINIA PESTIS VÀ PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR
XÁC ĐỊNH YERSINIA PESTIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM
Đinh Thị Thu Hằng*; Nguyễn Thái Sơn**; Nguyễn Văn An**
Cao Thị Dinh***; Triệu Thị Nguyệt***
TÓM TẮT
Mục tiêu: xác định trình tự đầy đủ gen ypo2088 (trên nhiễm sắc thể [NST]), pla, caf1 (trên
hai plasmid độc lực là pPCP1 và pMT1) của chủng vi khuẩn (VK) Yersinia pestis Yp1 phân lập
ở Việt Nam và phát triển kỹ thuật PCR đa mồi xác định nhanh, chính xác Y. pestis gây bệnh.
Vật liệu và phương pháp: chủng Y. pestis Yp1 có đầy đủ độc lực được lưu giữ tại “Ngân hàng
Chủng và Gen” của Học viện Quân y. Toàn bộ chiều dài gen ypo2088, pla và caf1 sau khi
khuếch đại chính xác được tách dòng và phân tích trình tự. Từ kết quả phân tích trình tự kết
hợp với trình tự các chủng tham chiếu trên Ngân hàng Gen, 3 cặp mồi là ypo2088F/R, plaF/R
và caf1F/R đã thiết kế để khuếch đại đồng thời gen đích tương ứng trong phản ứng PCR đa
mồi xác định VK dịch hạch gây bệnh. Kết quả và kết luận: tách dòng và phân tích trình tự đầy
đủ 3 gen là ypo2088, pla và caf1 của chủng VK Y. pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam. Xác định
được 1 đột biến sai nghĩa trên gen pla, hai gen còn lại có mức độ tương đồng 100% khi so
sánh với trình tự tham chiếu (mã số CP000900). Kết quả một lần nữa chứng minh, trình tự gen
ypo2088, pla và caf1 rất ổn định, không có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng Y. pestis.
Trình tự đầy đủ 3 gen này đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số lần lượt là
KM880027, KM880025 và KM880026. Đã thiết kế thành công phản ứng PCR đa mồi khuếch
đại đồng thời 3 gen đích xác định chính xác VK dịch hạch gây bệnh.
*
Từ khóa: Caf1 (F1 capsule antigene); Độc lực; PCR đa mồi; Yersinia pestis.
Study on the Complete Sequences of Virulence Genes of Yersinia
Pestis and Development of a Multiplex PCR Assay for Detection of
Pathogenic Yersinia Pestis in Vietnam
Summary
Objectives: Sequence analysis of the entire ypo2088 gene (within bacterial chromosome),
pla and caf1 genes (on the virulence plasmids pPCP1 and pMT1) of the pathogenic Yersinia
pestis strain Yp1 isolated in Vietnam and development of a multiplex PCR assay for rapid and
accurate detection of pathogenic Y. pestis. Materials and methods: Y. pestis strain Yp1 with full
virulence was provided by Strain and Gene Bank of Vietnam Military Medical University. Total DNA
was extracted from culture media following autoclaved inactivation. Subsequently, full-length ypo2088,
* Học viện Quân y
** Bệnh viện Quân y 103
*** Đại học Khoa học tự nhiên
Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com)
Ngày nhận bài: 02/03/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2015
Ngày bài báo được đăng: 31/03/2015
57
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015
pla and caf1 genes were amplified using high-fidelity PCR. The purified PCR products were
cloned in pJET1.2/blunt by conventional recombinant methods and they were sequenced from
both ends. According to these sequencing results and the reference sequences in Genbank,
three primer pairs, including ypo2088F/R, plaF/R and caf1F/R, were designed in a multiplex PCR
assay for detection of pathogenic Y. pestis. Results and conclusions: One missense mutation
was identified in pla gene, two remaining genes were found to be 100% similar in sequence to
the reference sequences of Y. pestis Angola (accession number KP000900). These results again
demonstrate that ypo2088, pla, caf1 gene sequences are very conservative, with no significant
difference among Y. pestis strains. The complete sequences of these genes were submitted to
Genbank with accession number KM880027, KM880025 and KM880026, respectively. A multiplex
PCR assay that amplifies these three target genes was successfully developed for rapid and
accurate detection of pathogenic Y. pestis.
*
Key words: Caf1 (capsule fraction 1 gene); Multiplex PCR; pla (plasminogen gene);
Yersinia pestis.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Y. pestis là VK Gram âm, không sinh bào
tử thuộc chi Yersinia - họ Enterobacteriaceae.
Trong 11 loài thuộc chi Yersinia, chỉ có
ba loài gây bệnh ở người là Y. pestis,
Y. pseudotuberculosis và Y. enterocolitica.
Loài nguy hiểm nhất, Y. pestis gây bệnh
dịch hạch và viêm phổi cấp tính phân biệt
với hai loài còn lại [8, 10]. Tiềm năng hủy
diệt của dịch hạch đã được chứng minh
qua thùc tÕ lµ 200 triệu ca tử vong trong
lịch sử, dẫn đầu danh sách các bệnh
truyền nhiễm nguy hiểm. Theo Tổ chức Y
tế Thế giới, từ 1989 đến 2003, thế giới đã
ghi nhận 38.310 ca nhiễm và 2.845 ca tử
vong, tập trung chủ yếu ở châu Phi và
châu Á - nơi thiếu hoặc chưa đáp ứng
đầy đủ của hệ thống giám sát, các cơ sở
chẩn đoán hay báo cáo dịch [5]. Đặc biệt,
những năm gần đây, mối quan tâm đối
với VK dịch hạch được đặt ở mức cao, do
khả năng sử dụng Y. pestis như một loại
vũ khí sinh học [8].
Trên thế giới, toàn bộ hệ gen của
một số chủng chuẩn như Y. pestis KIM5
58
(thuộc về biovar Mediaevalis), CO92 (chủng
biovar Orientalis) đã được giải trình tự,
tạo thuận lợi cho nghiên cứu, xác định
Y. pestis [9]. Genome của Y. pestis
(chủng CO92) bao gồm một “NST” 4,65
Mb và ba plasmid lần lượt là pLcr, pPCP1
và pMT1. Ngoài các sản phẩm do hệ gen
trên NST, yếu tố độc lực của Y. pestis là
do gen trên các plasmid này đảm nhiệm.
Trong đó, pPCP1 và pMT1 là 2 plasmid
được xác định chỉ có riêng ở Y. pestis [8].
pPCP1 (kích thước 9,6 kb), có gen quan
trọng là pla mã hóa chất hoạt hóa
plasminogen Pla, đóng vai trò quan trọng
đối với khả năng xâm nhập của Y. pestis
vào cơ thể qua da [4]. Plasmid còn lại
là pMT1 có kích thước tương đối lớn
(110 kb) tiêu biểu với các gen mã hóa
cho kháng nguyên vỏ F1, gen biểu hiện
phospholipase D (PID), cả hai đều có vai
trò trong lây lan dịch hạch [8].
Ở Việt Nam, bệnh dịch hạch còn xuất
hiện rải rác ở khu vực Tây Nguyên như
Gia Lai, ĐắK Lắk [5]. Nghiên cứu về
Y. pestis cũng như bệnh dịch hạch chủ
yếu tập trung về dịch tễ học, thống kê,
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015
giám sát bệnh trên cơ sở các vùng sinh
thái. Những kết quả nghiên cứu về phân
tử VK dịch hạch còn hạn chế và đơn lẻ
trên một số gen đích [1, 5]. Nghiên cứu
này tách dòng và giải trình tự toàn bộ gen
đặc trưng trên NST - ypo2088 và gen độc
lực trên plasmid pPCP1, pMT1 tương
ứng là pla và caf1 của chủng Y. pestis
Yp1 phân lập ở Việt Nam. Đồng thời,
nhóm tác giả đã phát triển kỹ thuật PCR
đa mồi (multiplex PCR - mPCR) sử dụng
3 gen đích này để xác định chính xác VK
dịch hạch có độc lực trong tự nhiên.
Nghiên cứu đã góp phần làm phong phú
thêm những kết quả về đa dạng di truyền
các gen độc lực của VK dịch hạch cũng
như cung cấp công cụ phân tử hữu hiệu
cho phép chẩn đoán nhanh và chính xác
Y. pestis có độc lực.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Chủng vi khuẩn.
Chủng Y. pestis Yp1 có độc lực và
chủng đối chứng âm E. coli ATCC 25922
do Ngân hàng Chủng và Gen của Học
viện Quân y cung cấp, xác định đặc điểm
hình thể, tính chất sinh vật hóa học bằng
card định danh GN46 (Vitek 2 - BioMérieux)
và thử nghiệm độc lực trên chuột nhắt
trắng để khảo sát khả năng gây chết
hàng loạt.
2. Tách chiết ADN và PCR.
Chủng VK được bất hoạt ở điều kiện
121oC/20 phút, sau đó tách ADN tổng số
theo quy trình của nhà sản xuất (ADN
genome QIAGen minikit). Thiết kế các
cặp mồi tách dòng dựa trên trình tự gen
ypo2088, pla và caf1 trên Ngân hàng Gen
và được tổng hợp bởi IDT (Mỹ). Sử dụng
sinh phẩm Phusion High-Fidelity ADN
polymerase (Thermo scientific) để phân
lập gen đích với chu trình nhiệt, nhiệt độ
gắn mồi TaoC và thời gian kéo dài chuỗi
như sau: biến tính 98oC trong 30 giây,
khuếch đại 30 - 32 chu kỳ (98oC, 8 giây;
TaoC, 20 giây; 72oC, 30 - 35 giây), sau đó
hoàn thành kéo dài chuỗi ở 72º trong
6 phút. Trong đó, nhiệt độ gắn mồi
Ta oC và thời gian kéo dài chuỗi phụ
thuộc vào trình tự mồi và kích thước
sản phẩm.
Bảng 1: Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứu.
TÊN MỒI
MỤC ĐÍCH
TRÌNH TỰ (5’-3’)
NHIỆT ĐỘ GẮN
KÍCH
MỒI (Ta: oC) THƯỚC (bp)
PCR/giải
trình tự
ypo2088F/BamHI
PCR
GGGATCCGTGATGATTAAGTTCATGCT
52
719
PCR/giải
trình tự
CCTCGAGGTCTGTATTGCTGAGAAAAG
52
719
plaF/EcoRI
PCR
CGAATTCGCAGAGAGATTAAGGGTGT
57
1019
plaR/XhoI
PCR
ACTCGAGTTCCACAGACATCCTCCC
57
1019
caf1F/BamHI
PCR
AGGATCCGGACACAAGCCCTCTCTAC
60
654
ypo2088R/XhoI
59
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015
caf1R/XhoI
PCR
TCTCGAGCGAGGGTTAGGCTCAAAGT
60
654
pJET1.2_F
Giải trình tự
CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC
58
-
pJET1.2_R
Giải trình tự
AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG
58
-
GGATGAGATAACGCGGGTGT-F
56
103
56
438
56
271
mPCR
ypoF1/R1
mPCR
AGAGAATCGTGATGCCGTCC-R
plaF1/R1
mPCR
CGGGATGCTGAGTGGAAAGT-F
ATTACCCGCACTCCTTTCGG-R
cafF1/R1
mPCR
CGCTTACTCTTGGCGGCTAT-F
GCTGCAAGTTTACCGCCTTT-R
3. Tách dòng và giải trình tự gen.
4. Multiplex PCR.
Tiến hành nối ghép trực tiếp sản phẩm
Tham khảo trình tự các gen ypo2088,
PCR tinh sạch của 3 gen ypo2088, pla
pla và caf1 của chủng VK dịch hạch trên
và caf1 với vector tách dòng pJET1.2/blunt
Ngân hàng Gen kết hợp với kết quả giải
nhờ T4-ligase (Thermo scientific). Sản
trình tự trong nghiên cứu này, 3 cặp mồi
phẩm nối ghép được biến nạp vào tế
tương ứng với các gen đích trên được
bào khả biến E. coli DH5 (Invitrogen)
thiết kế trong phản ứng PCR đa mồi xác
bằng phương pháp sốc nhiệt. Tiến hành
kiểm tra các thể tái tổ hợp bằng PCR
khuẩn lạc (PCR colony), cắt bằng enzym
hạn chế AvaI và XbaI (Thermo scientific).
Xác đinh trình tự các gen đích theo cả
hai chiều theo phương pháp Sanger
với các mồi trên vector pJET1.2F/R và
mồi khuếch đại (bảng 1). Sử dụng phần
định Y. pestis có độc lực (bảng 1). Thành
phần mPCR như sau: 1,2X Dream Taq
Buffer; 0,25 mM dNTPs; MgCl2 0,6 mM;
0,25 μM mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại;
Dream Taq 0,8U; ~ 10 ng ADN khuôn,
điều chỉnh H2O đủ thể tích 25 μl. Chu
trình nhiệt: biến tính 94oC/4 phút, tiếp
theo là 30 chu kỳ (94oC/30 giây; 56oC/30
giây; 72oC/30 giây), sau đó hoàn thành
mềm Bioedit và Genious R7 để xử lý,
kéo dài chuỗi ở 72º trong 6 phút. Sản
nối ghép tạo trình tự toàn bộ gen
phẩm mPCR được điện di kiểm tra trên
ypo2088, pla, caf1, so sánh và phân tích
gel agarose 1,5% TBE 0,5X; nhuộm ethidium
trình tự đã xác định với trình tự trên
bromide và quan sát bằng hệ thống soi
Ngân hàng Gen.
gel Dolphin-DOC.
60
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Tách dòng và giải trình tự toàn bộ gen ypo2088, pla và caf1.
Hình 1: Kết quả kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích bằng Phusion ADN
polymerase trên gel agrose 1,2%.
a) M: Thang ADN chuẩn 100 bp (Thermo Scientific); 1: Sản phẩm tổng hợp gen ypo2088.
b) M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Scientific); 1, 2: Sản phẩm tổng hợp gen pla, caf1.
ADN tổng số của chủng Y. pestis Yp1
được dùng để phân lập gen ypo2088, pla
và caf1 bằng PCR sử dụng Phusion HighFidelity ADN polymerase với các cặp mồi
tách dòng tương ứng. Điện di kiểm tra
sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2%
(hình 1) cho thấy, 3 sản phẩm khuếch đại
rất đặc hiệu, thể hiện bằng các band đậm,
rõ nét, không có band phụ, kích thước
tương đương với tính toán lý thuyết.
Theo như thiết kế, nếu khuếch đại
thành công, các gen này sử dụng cặp mồi
là ypo2088F/R, plaF/R và cafF/R sẽ cho
sản phẩm có kích thước tương ứng là
645, 1019 và 654 bp, tương đương với
kích thước sản phẩm PCR trên bản gel
điện di. Việc lựa chọn gen đặc trưng
của Y. pestis trên NST là ypo2088 và gen
độc lực pla, caf1 trên plasmid được tham
61
khảo từ một số nghiên cứu trên thế giới
[4, 7, 10]. Nhóm nghiên cứu đã phân lập
toàn bộ chiều dài của các gen này để
phân tích trình tự của chủng VK dịch hạch
có độc lực ở Việt Nam nhằm xác định có
sự sai khác nào trong trình tự nucleotid
với các chủng Y. pestis có độc lực trên
thế giới.
Như vậy, từ kết quả điện di kiểm tra
sản phẩm PCR khuếch đại các gen đích
và gen độc lực của Y. pestis như trên có
thể kết luận, bước đầu đã khuếch đại
thành công gen ypo2088, pla và caf1 của
chủng Y. pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam.
Sau khi tinh sạch, các sản phẩm PCR
này được gắn vào vector tách dòng
pJET1.2/blunt. Plasmid tái tổ hợp chứa
gen đích mong muốn, kiểm tra bằng PCR
colony và enzym hạn chế AvaI và XbaI
(hình 2).
nguon tai.lieu . vn
NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA
YERSINIA PESTIS VÀ PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR
XÁC ĐỊNH YERSINIA PESTIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM
Đinh Thị Thu Hằng*; Nguyễn Thái Sơn**; Nguyễn Văn An**
Cao Thị Dinh***; Triệu Thị Nguyệt***
TÓM TẮT
Mục tiêu: xác định trình tự đầy đủ gen ypo2088 (trên nhiễm sắc thể [NST]), pla, caf1 (trên
hai plasmid độc lực là pPCP1 và pMT1) của chủng vi khuẩn (VK) Yersinia pestis Yp1 phân lập
ở Việt Nam và phát triển kỹ thuật PCR đa mồi xác định nhanh, chính xác Y. pestis gây bệnh.
Vật liệu và phương pháp: chủng Y. pestis Yp1 có đầy đủ độc lực được lưu giữ tại “Ngân hàng
Chủng và Gen” của Học viện Quân y. Toàn bộ chiều dài gen ypo2088, pla và caf1 sau khi
khuếch đại chính xác được tách dòng và phân tích trình tự. Từ kết quả phân tích trình tự kết
hợp với trình tự các chủng tham chiếu trên Ngân hàng Gen, 3 cặp mồi là ypo2088F/R, plaF/R
và caf1F/R đã thiết kế để khuếch đại đồng thời gen đích tương ứng trong phản ứng PCR đa
mồi xác định VK dịch hạch gây bệnh. Kết quả và kết luận: tách dòng và phân tích trình tự đầy
đủ 3 gen là ypo2088, pla và caf1 của chủng VK Y. pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam. Xác định
được 1 đột biến sai nghĩa trên gen pla, hai gen còn lại có mức độ tương đồng 100% khi so
sánh với trình tự tham chiếu (mã số CP000900). Kết quả một lần nữa chứng minh, trình tự gen
ypo2088, pla và caf1 rất ổn định, không có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng Y. pestis.
Trình tự đầy đủ 3 gen này đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số lần lượt là
KM880027, KM880025 và KM880026. Đã thiết kế thành công phản ứng PCR đa mồi khuếch
đại đồng thời 3 gen đích xác định chính xác VK dịch hạch gây bệnh.
*
Từ khóa: Caf1 (F1 capsule antigene); Độc lực; PCR đa mồi; Yersinia pestis.
Study on the Complete Sequences of Virulence Genes of Yersinia
Pestis and Development of a Multiplex PCR Assay for Detection of
Pathogenic Yersinia Pestis in Vietnam
Summary
Objectives: Sequence analysis of the entire ypo2088 gene (within bacterial chromosome),
pla and caf1 genes (on the virulence plasmids pPCP1 and pMT1) of the pathogenic Yersinia
pestis strain Yp1 isolated in Vietnam and development of a multiplex PCR assay for rapid and
accurate detection of pathogenic Y. pestis. Materials and methods: Y. pestis strain Yp1 with full
virulence was provided by Strain and Gene Bank of Vietnam Military Medical University. Total DNA
was extracted from culture media following autoclaved inactivation. Subsequently, full-length ypo2088,
* Học viện Quân y
** Bệnh viện Quân y 103
*** Đại học Khoa học tự nhiên
Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com)
Ngày nhận bài: 02/03/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2015
Ngày bài báo được đăng: 31/03/2015
57
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015
pla and caf1 genes were amplified using high-fidelity PCR. The purified PCR products were
cloned in pJET1.2/blunt by conventional recombinant methods and they were sequenced from
both ends. According to these sequencing results and the reference sequences in Genbank,
three primer pairs, including ypo2088F/R, plaF/R and caf1F/R, were designed in a multiplex PCR
assay for detection of pathogenic Y. pestis. Results and conclusions: One missense mutation
was identified in pla gene, two remaining genes were found to be 100% similar in sequence to
the reference sequences of Y. pestis Angola (accession number KP000900). These results again
demonstrate that ypo2088, pla, caf1 gene sequences are very conservative, with no significant
difference among Y. pestis strains. The complete sequences of these genes were submitted to
Genbank with accession number KM880027, KM880025 and KM880026, respectively. A multiplex
PCR assay that amplifies these three target genes was successfully developed for rapid and
accurate detection of pathogenic Y. pestis.
*
Key words: Caf1 (capsule fraction 1 gene); Multiplex PCR; pla (plasminogen gene);
Yersinia pestis.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Y. pestis là VK Gram âm, không sinh bào
tử thuộc chi Yersinia - họ Enterobacteriaceae.
Trong 11 loài thuộc chi Yersinia, chỉ có
ba loài gây bệnh ở người là Y. pestis,
Y. pseudotuberculosis và Y. enterocolitica.
Loài nguy hiểm nhất, Y. pestis gây bệnh
dịch hạch và viêm phổi cấp tính phân biệt
với hai loài còn lại [8, 10]. Tiềm năng hủy
diệt của dịch hạch đã được chứng minh
qua thùc tÕ lµ 200 triệu ca tử vong trong
lịch sử, dẫn đầu danh sách các bệnh
truyền nhiễm nguy hiểm. Theo Tổ chức Y
tế Thế giới, từ 1989 đến 2003, thế giới đã
ghi nhận 38.310 ca nhiễm và 2.845 ca tử
vong, tập trung chủ yếu ở châu Phi và
châu Á - nơi thiếu hoặc chưa đáp ứng
đầy đủ của hệ thống giám sát, các cơ sở
chẩn đoán hay báo cáo dịch [5]. Đặc biệt,
những năm gần đây, mối quan tâm đối
với VK dịch hạch được đặt ở mức cao, do
khả năng sử dụng Y. pestis như một loại
vũ khí sinh học [8].
Trên thế giới, toàn bộ hệ gen của
một số chủng chuẩn như Y. pestis KIM5
58
(thuộc về biovar Mediaevalis), CO92 (chủng
biovar Orientalis) đã được giải trình tự,
tạo thuận lợi cho nghiên cứu, xác định
Y. pestis [9]. Genome của Y. pestis
(chủng CO92) bao gồm một “NST” 4,65
Mb và ba plasmid lần lượt là pLcr, pPCP1
và pMT1. Ngoài các sản phẩm do hệ gen
trên NST, yếu tố độc lực của Y. pestis là
do gen trên các plasmid này đảm nhiệm.
Trong đó, pPCP1 và pMT1 là 2 plasmid
được xác định chỉ có riêng ở Y. pestis [8].
pPCP1 (kích thước 9,6 kb), có gen quan
trọng là pla mã hóa chất hoạt hóa
plasminogen Pla, đóng vai trò quan trọng
đối với khả năng xâm nhập của Y. pestis
vào cơ thể qua da [4]. Plasmid còn lại
là pMT1 có kích thước tương đối lớn
(110 kb) tiêu biểu với các gen mã hóa
cho kháng nguyên vỏ F1, gen biểu hiện
phospholipase D (PID), cả hai đều có vai
trò trong lây lan dịch hạch [8].
Ở Việt Nam, bệnh dịch hạch còn xuất
hiện rải rác ở khu vực Tây Nguyên như
Gia Lai, ĐắK Lắk [5]. Nghiên cứu về
Y. pestis cũng như bệnh dịch hạch chủ
yếu tập trung về dịch tễ học, thống kê,
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015
giám sát bệnh trên cơ sở các vùng sinh
thái. Những kết quả nghiên cứu về phân
tử VK dịch hạch còn hạn chế và đơn lẻ
trên một số gen đích [1, 5]. Nghiên cứu
này tách dòng và giải trình tự toàn bộ gen
đặc trưng trên NST - ypo2088 và gen độc
lực trên plasmid pPCP1, pMT1 tương
ứng là pla và caf1 của chủng Y. pestis
Yp1 phân lập ở Việt Nam. Đồng thời,
nhóm tác giả đã phát triển kỹ thuật PCR
đa mồi (multiplex PCR - mPCR) sử dụng
3 gen đích này để xác định chính xác VK
dịch hạch có độc lực trong tự nhiên.
Nghiên cứu đã góp phần làm phong phú
thêm những kết quả về đa dạng di truyền
các gen độc lực của VK dịch hạch cũng
như cung cấp công cụ phân tử hữu hiệu
cho phép chẩn đoán nhanh và chính xác
Y. pestis có độc lực.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Chủng vi khuẩn.
Chủng Y. pestis Yp1 có độc lực và
chủng đối chứng âm E. coli ATCC 25922
do Ngân hàng Chủng và Gen của Học
viện Quân y cung cấp, xác định đặc điểm
hình thể, tính chất sinh vật hóa học bằng
card định danh GN46 (Vitek 2 - BioMérieux)
và thử nghiệm độc lực trên chuột nhắt
trắng để khảo sát khả năng gây chết
hàng loạt.
2. Tách chiết ADN và PCR.
Chủng VK được bất hoạt ở điều kiện
121oC/20 phút, sau đó tách ADN tổng số
theo quy trình của nhà sản xuất (ADN
genome QIAGen minikit). Thiết kế các
cặp mồi tách dòng dựa trên trình tự gen
ypo2088, pla và caf1 trên Ngân hàng Gen
và được tổng hợp bởi IDT (Mỹ). Sử dụng
sinh phẩm Phusion High-Fidelity ADN
polymerase (Thermo scientific) để phân
lập gen đích với chu trình nhiệt, nhiệt độ
gắn mồi TaoC và thời gian kéo dài chuỗi
như sau: biến tính 98oC trong 30 giây,
khuếch đại 30 - 32 chu kỳ (98oC, 8 giây;
TaoC, 20 giây; 72oC, 30 - 35 giây), sau đó
hoàn thành kéo dài chuỗi ở 72º trong
6 phút. Trong đó, nhiệt độ gắn mồi
Ta oC và thời gian kéo dài chuỗi phụ
thuộc vào trình tự mồi và kích thước
sản phẩm.
Bảng 1: Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứu.
TÊN MỒI
MỤC ĐÍCH
TRÌNH TỰ (5’-3’)
NHIỆT ĐỘ GẮN
KÍCH
MỒI (Ta: oC) THƯỚC (bp)
PCR/giải
trình tự
ypo2088F/BamHI
PCR
GGGATCCGTGATGATTAAGTTCATGCT
52
719
PCR/giải
trình tự
CCTCGAGGTCTGTATTGCTGAGAAAAG
52
719
plaF/EcoRI
PCR
CGAATTCGCAGAGAGATTAAGGGTGT
57
1019
plaR/XhoI
PCR
ACTCGAGTTCCACAGACATCCTCCC
57
1019
caf1F/BamHI
PCR
AGGATCCGGACACAAGCCCTCTCTAC
60
654
ypo2088R/XhoI
59
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015
caf1R/XhoI
PCR
TCTCGAGCGAGGGTTAGGCTCAAAGT
60
654
pJET1.2_F
Giải trình tự
CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC
58
-
pJET1.2_R
Giải trình tự
AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG
58
-
GGATGAGATAACGCGGGTGT-F
56
103
56
438
56
271
mPCR
ypoF1/R1
mPCR
AGAGAATCGTGATGCCGTCC-R
plaF1/R1
mPCR
CGGGATGCTGAGTGGAAAGT-F
ATTACCCGCACTCCTTTCGG-R
cafF1/R1
mPCR
CGCTTACTCTTGGCGGCTAT-F
GCTGCAAGTTTACCGCCTTT-R
3. Tách dòng và giải trình tự gen.
4. Multiplex PCR.
Tiến hành nối ghép trực tiếp sản phẩm
Tham khảo trình tự các gen ypo2088,
PCR tinh sạch của 3 gen ypo2088, pla
pla và caf1 của chủng VK dịch hạch trên
và caf1 với vector tách dòng pJET1.2/blunt
Ngân hàng Gen kết hợp với kết quả giải
nhờ T4-ligase (Thermo scientific). Sản
trình tự trong nghiên cứu này, 3 cặp mồi
phẩm nối ghép được biến nạp vào tế
tương ứng với các gen đích trên được
bào khả biến E. coli DH5 (Invitrogen)
thiết kế trong phản ứng PCR đa mồi xác
bằng phương pháp sốc nhiệt. Tiến hành
kiểm tra các thể tái tổ hợp bằng PCR
khuẩn lạc (PCR colony), cắt bằng enzym
hạn chế AvaI và XbaI (Thermo scientific).
Xác đinh trình tự các gen đích theo cả
hai chiều theo phương pháp Sanger
với các mồi trên vector pJET1.2F/R và
mồi khuếch đại (bảng 1). Sử dụng phần
định Y. pestis có độc lực (bảng 1). Thành
phần mPCR như sau: 1,2X Dream Taq
Buffer; 0,25 mM dNTPs; MgCl2 0,6 mM;
0,25 μM mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại;
Dream Taq 0,8U; ~ 10 ng ADN khuôn,
điều chỉnh H2O đủ thể tích 25 μl. Chu
trình nhiệt: biến tính 94oC/4 phút, tiếp
theo là 30 chu kỳ (94oC/30 giây; 56oC/30
giây; 72oC/30 giây), sau đó hoàn thành
mềm Bioedit và Genious R7 để xử lý,
kéo dài chuỗi ở 72º trong 6 phút. Sản
nối ghép tạo trình tự toàn bộ gen
phẩm mPCR được điện di kiểm tra trên
ypo2088, pla, caf1, so sánh và phân tích
gel agarose 1,5% TBE 0,5X; nhuộm ethidium
trình tự đã xác định với trình tự trên
bromide và quan sát bằng hệ thống soi
Ngân hàng Gen.
gel Dolphin-DOC.
60
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Tách dòng và giải trình tự toàn bộ gen ypo2088, pla và caf1.
Hình 1: Kết quả kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích bằng Phusion ADN
polymerase trên gel agrose 1,2%.
a) M: Thang ADN chuẩn 100 bp (Thermo Scientific); 1: Sản phẩm tổng hợp gen ypo2088.
b) M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Scientific); 1, 2: Sản phẩm tổng hợp gen pla, caf1.
ADN tổng số của chủng Y. pestis Yp1
được dùng để phân lập gen ypo2088, pla
và caf1 bằng PCR sử dụng Phusion HighFidelity ADN polymerase với các cặp mồi
tách dòng tương ứng. Điện di kiểm tra
sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2%
(hình 1) cho thấy, 3 sản phẩm khuếch đại
rất đặc hiệu, thể hiện bằng các band đậm,
rõ nét, không có band phụ, kích thước
tương đương với tính toán lý thuyết.
Theo như thiết kế, nếu khuếch đại
thành công, các gen này sử dụng cặp mồi
là ypo2088F/R, plaF/R và cafF/R sẽ cho
sản phẩm có kích thước tương ứng là
645, 1019 và 654 bp, tương đương với
kích thước sản phẩm PCR trên bản gel
điện di. Việc lựa chọn gen đặc trưng
của Y. pestis trên NST là ypo2088 và gen
độc lực pla, caf1 trên plasmid được tham
61
khảo từ một số nghiên cứu trên thế giới
[4, 7, 10]. Nhóm nghiên cứu đã phân lập
toàn bộ chiều dài của các gen này để
phân tích trình tự của chủng VK dịch hạch
có độc lực ở Việt Nam nhằm xác định có
sự sai khác nào trong trình tự nucleotid
với các chủng Y. pestis có độc lực trên
thế giới.
Như vậy, từ kết quả điện di kiểm tra
sản phẩm PCR khuếch đại các gen đích
và gen độc lực của Y. pestis như trên có
thể kết luận, bước đầu đã khuếch đại
thành công gen ypo2088, pla và caf1 của
chủng Y. pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam.
Sau khi tinh sạch, các sản phẩm PCR
này được gắn vào vector tách dòng
pJET1.2/blunt. Plasmid tái tổ hợp chứa
gen đích mong muốn, kiểm tra bằng PCR
colony và enzym hạn chế AvaI và XbaI
(hình 2).