Xem mẫu
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
NGHIÊN CỨU TOÀN BỘ TRÌNH TỰ GEN PAGA TRÊN MỘT SỐ
CHỦNG BACILLUS ATHRACIS PHÂN LẬP
Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM
Đinh Thị Thu Hằng*; Nguyễn Thái Sơn**
TÓM TẮT
Mục tiêu: nghiên cứu trình tự đầy đủ gen pagA (protective antigen gene) mã hóa kháng
nguyên bảo vệ PA (protein quan trọng tham gia tạo độc tố bệnh than) trên một số chủng
Bacillus anthracis có độc lực phân lập ở miền Bắc Việt Nam. Vật liệu và phương pháp: 3 chủng
B. anthracis do Viện Y học Dự phòng Quân đội cung cấp. Tách chiết và khuếch đại chính xác
ADN tổng số từ dịch nuôi cấy sau khi đã bất hoạt bằng nhiệt sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Toàn
bộ gen pagA được tách dòng trong vector pJET1.2/blunt, lựa chọn các plasmid tái tổ hợp mang
gen mong muốn và phân tích trình tự. Kết quả và kết luận: đã tách dòng và giải trình tự toàn bộ
gen pagA của 3 chủng B. anthracis có độc lực. Xác định được 3 đột biến điểm (TC), gồm 1
đột biến đồng nghĩa (TC)195 và 2 đột biến sai nghĩa (TC)1693, (TC)1799 khi so sánh với trình
tự tham chiếu B. anthracis Vollum-USA. Đột biến (TC)1693 xuất hiện trên cả 3/3 chủng B.
anthracis nghiên cứu. Còn 2 đột biến là (TC)195 và (TC)1799 tìm thấy ở cả 2 chủng 4NS,
1C3. Gen pagA rất bền vững, không có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng B. anthracis
nghiên cứu ở Việt Nam và thế giới.
*
Từ khóa: Gen pagA (protective antigen gene); Tách dòng gen; Độc lực; Bacillus anthracis;
Việt Nam.
Study of Complete Sequence of Protective Antigen Gene of
Bacillus Anthrasis Strains Isolated in Northern Vietnam
Summary
Objectives: Study of the entire sequences of pagA gene encoding protective antigen of
Bacillus anthracis strains isolated in Northern Vietnam. Materials and methods: Three B.
anthracis strains were provided by the Military Institute of Preventive Medicine. Total DNA of
heat inactived cultures were extracted and amplified PCR high fidelity using specific primer
pairs for complete pagA gene. The amplified pagA gene from B. anthracis strains were cloned
in pJET1.2/blunt by conventional recombinant methods and analysed recombinants plasmid by
restriction enzyme. PagA gene was sequenced from both ends by extension from vector
specific priming sites (pJET1.2_F and pJET1.2_R) and by primer walking.
* Học viện Quân y
** Bệnh viện Quân y 103
Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com)
Ngày nhận bài: 08/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 14/02/2015
Ngày bài báo được đăng: 02/03/2015
135
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
Results and conclusions: The pagA gene complete sequences were cloned, analysed of 3 B.
anthracis strains VCM1168, 4NS, 1C3 isolated in Northern Vietnam and this is the first
publication in Vietnam. Three point mutations (TC) were identified, one synonymous mutation
(TC)195 and two missense mutations (TC)1693 (Serine Proline) and (TC)1799 (Valine
Alanine) when compared with B. anthracis strain Vollum-USA. The results demonstrate that
pagA gene of B. anthracis strains is very conservative, there is no sequenced significant
difference between the studied B. anthracis strains in Vietnam and the world. The entire pagA
gene sequences of 3 B. anthracis strains VCM1168, 4NS and 1C3 were submitted in Genbank
with accession number KP213102, KP213103 and KP213104, respectively.
* Key words: PagA gene (protective antigen gene); Cloning; Virulence; Bacillus anthracis;
Vietnam.
ĐẶT VẤN ĐỀ
B. anthracis là trực khuẩn Gram
dương, sinh bào tử gây bệnh than nguy
hiểm ở người và động vật. Khả năng gây
bệnh của B. anthracis chủ yếu nhờ sự có
mặt của các gen nằm trên 2 plasmid lớn
là pXO1 (182 kb) và pXO2 (95 kb) - được
gọi là plasmid độc tố. pXO1 chứa các gen
sản xuất độc tố, trong khi pXO2 chứa gen
liên quan đến quá trình tổng hợp vỏ polyD-glutamic axít [5, 8]. Chỉ những chủng
có đầy đủ 2 plasmid này mới có khả năng
gây bệnh nguy hiểm. Những chủng thiếu
1 trong 2 plasmid (pXO1+, pXO2-); (pXO1, pXO2+) hoặc thiếu cả 2 plasmid (pXO1-,
pXO2-) sẽ bị giảm hẳn độc lực hoặc
không còn khả năng gây bệnh [7, 8]. Trên
plasmid pXO1, có 3 gen quan trọng nhất
lần lượt là gen lef mã hóa cho yếu tố gây
chết lethal factor (LF), gen cya mã hóa là
yếu tố gây phù nề (edema factor, EF) một adenylyl cyclase dẫn đến phù nề da
trong những cá thể nhiễm bệnh và gen
pagA mã hóa cho kháng nguyên bảo vệ
PA - protein quan trọng tham gia tạo độc
tố bệnh than (Anthrax) [6]. Trong đó, gen
pagA với kháng nguyên PA đóng vai trò
quyết định độc tính của vi khuẩn (VK)
136
than. Bản thân PA không gây độc, nhưng
khi khi kết hợp với yếu tố LF hay EF cho
phép tạo độc tố gây chết hay phù thũng
trong tế bào chủ nhiễm bệnh. Ngoài ra,
PA còn có khả năng gây đáp ứng miễn
dịch chống bệnh than [3, 8, 9].
Trên thế giới, đã có một số công trình
nghiên cứu về gen pagA cũng như
nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của
kháng nguyên bảo vệ PA. Price và CS
nghiên cứu về gen pagA từ 26 mẫu đa
dạng về nguồn gốc để xác định sự biến
đổi tự nhiên trong gen này, giúp hiểu
thêm sự tiến hóa của B. anthracis [9]. Ở
Việt Nam, bệnh than vẫn còn xuất hiện rải
rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Sơn
La, Điện Biên, Lai Châu... [1]. Gần đây,
(10 - 2014) ở Mèo Vạc, Hà Giang đã ghi
nhận 09 ca nhiễm bệnh than do ăn thịt gia
súc chết mắc bệnh than. Việc xuất hiện
trở lại của VK than một lần nữa cảnh báo
mầm bệnh nguy hiểm này cần được quan
tâm đúng mức và có phương án phòng
chống hiệu quả, tránh để xảy ra bùng
phát dịch. Hiện nay, nghiên cứu phân tử
về VK than phân lập ở Việt Nam, đặc biệt
về gen pagA còn hạn chế, chưa có
nghiên cứu phân tích trình tự toàn bộ
chiều dài gen pagA [1, 2]. Với phạm vi bài
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
báo này, chúng tôi công bố những kết
quả đạt được trong nghiên cứu tách dòng
và phân tích trình tự toàn bộ gen pagA từ
3 chủng B. anthracis có độc lực được
phân lập ở miền Bắc Việt Nam làm tiền
đề cho việc nghiên cứu chẩn đoán phân
tử VK than có độc lực.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Chủng VK B. anthracis và tách
chiết ADN.
Chủng B. anthracis VCM1168, 4NS và
1C3 có độc lực do Viện Y học Dự phòng
Quân đội cung cấp (hợp tác nghiên cứu
giữa Học viện Quân y và Cục Quân y).
Phân lập các chủng VK này từ BN và đất
nơi gia súc chết bị bệnh than, định danh
bằng thanh API50CH, PCR xác định gen
đặc trưng của VK than, thử nghiệm trên
động vật thí nghiệm (chuột nhắt trắng) để
khảo sát khả năng gây chết hàng loạt.
Tiến hành tách chiết ADN genome theo
quy trình của nhà sản xuất (ADN genome
QIAGen minikit) sau khi bất hoạt chủng ở
điều kiện 121oC/20 phút.
2. PCR.
Dựa trên trình tự gen pagA của các
chủng VK than đã được công bố trên
Ngân hàng gen (CP007665, AE011190,
CP001216...), chúng tôi thiết kế cặp mồi
đặc hiệu (bảng 1) nhằm nhân toàn bộ gen
pagA và đặt tổng hợp bởi IDT (Mỹ). Thiết
kế cặp mồi tách dòng gen pagA ở hai đầu
vùng nối là đầu 5’ và đầu 3’ của gen
pagA, cách trình tự start codon và stop
137
codon khoảng > 20 nucleotid đảm bảo
nhân trọn vẹn gen này. Thực hiện phản
ứng PCR high fidelity trên máy PCR
Eppendorf Master proS (Đức), sử dụng
hóa chất PCR high fidelity (Thermo
scientific). Phản ứng PCR 20 l gồm các
thành phần: Phusion Master Mix 1X với
HF Buffer (F-531S Thermo scientific);
0,25 M mồi xuôi, mồi ngược; ~ 10 ng
ADN khuôn; điều chỉnh H2O đủ thể tích
20 l. Chu trình nhiệt: biến tính 98oC
trong 30 giây, khuếch đại 30 chu kỳ
(98oC, 8 giây; 42oC, 20 giây; 72oC, 50
giây), sau đó hoàn thành kéo dài chuỗi ở
72ºC trong 6 phút. Sản phẩm PCR được
điện di kiểm tra trên gel agarose 1,2%
TBE 0,5X, nhuộm ethidium bromide, tiến
hành tinh sạch bằng kit GeneJet PCR
purification (#K0701 Thermo scientific),
điện di kiểm tra và định lượng bằng
Nanodrop.
3. Tách dòng gen pagA.
Tiến hành nối ghép trực tiếp sản phẩm
PCR tinh sạch gen pagA với vector tách
dòng pJET1.2/blunt nhờ T4-ligase
(Thermo scientific). Sản phẩm nối ghép
được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli
DH5 (One Shot Max Efficiency DH5 Invitrogen) bằng phương pháp sốc nhiệt
(42oC trong 45 giây) để tiến hành chọn
lọc dòng tế bào mang vector chứa gen
mong muốn. Tiến hành cắt kiểm tra
plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc bằng
enzym hạn chế BglII và cặp enzym hạn
chế XbaI và EcoRI (FastDigest - Thermo
scientific).
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
Bảng 1: Các mồi sử dụng trong nghiên cứu.
TÊN MỒI
MỤC ĐÍCH
TRÌNH TỰ (5’-3’)
KÍCH THƯỚC
SẢN PHẨM (bp)
pagAF/ BamHI
PCR
CGAGGATCCAAAGGAGAACGTATATGAA
2323
pagAR/XhoI
PCR
CA CTCGAG CACCTAGAATTACCTTATC
2323
pJET1.2_F
Giải trình tự
CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC
-
pagA_F1
Giải trình tự
CAACGAGAAAATCCTACTGA
-
pagA_F2
Giải trình tự
GATCAATCCACACAGAATAC
-
pagA_F3
Giải trình tự
TGGAAGAGTGAGGGTGGA
-
pJET1.2_R
Giải trình tự
AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG
-
4. Giải trình tự gen pagA.
Sau khi kiểm tra chính xác gen pagA trong vector tách dòng pJET1.2/blunt, các
plasmid tái tổ hợp mang gen pagA được giải trình tự theo nguyên lý Sanger trên máy
ABI 3730XL, sử dụng các mồi giải trình tự theo thiết kế (bảng 1), sử dụng phần mềm
Bioedit và Geneious R7 để xử lý, nối ghép tạo trình tự toàn bộ gen pagA, so sánh và
phân tích trình tự thu được với trình tự tham chiếu trên Ngân hàng Gen.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Khuếch đại gen pagA từ các chủng VK than có độc lực.
Theo tính toán, nếu như nhân thành công toàn bộ gen pagA với cặp mồi đã thiết kế,
sản phẩm PCR sẽ cho band ADN có kích thước 2.323 bp. Enzym sử dụng cho phản
ứng khuếch đại gen pagA là Phusion High-Fidelity ADN polymerase. Đây là enzym có
hiệu suất khuếch đại lớn, ngay cả trên những mẫu khuôn dài với độ chính xác và tốc
độ cao.
Hình 1: Kết quả kiểm tra sản phẩm tổng
hợp gen pagA trên gel agarose 1,2%.
M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo
Scientific); 1: Sản phẩm PCR của chủng
B. anthracis VCM1168.
Sản phẩm khuếch đại gen pagA từ chủng VK than VCM1168 bằng cặp mồi
pagAF/BamHI và pagAR/XhoI là 1 band rõ nét, đặc hiệu có kích thước tương đương
với kích thước mong muốn. Do đó, sản phẩm PCR được tinh sạch chuẩn bị cho các
bước tiếp theo.
138
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
2. Tách dòng toàn bộ gen pagA.
Tiến hành phản ứng nối ghép trực tiếp
sản phẩm PCR gen pagA sau tinh sạch
với vector pJET1.2/blunt, biến nạp vào tế
bào E. coli DH5α. Để kiểm tra sự có mặt
của gen pagA trong plasmid tái tổ hợp
(được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc),
chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra bằng
enzym hạn chế là cặp enzym XbaI và
EcoRI cùng với enzym BglII.
Với cặp enzym XbaI và EcoRI, một
trình tự nhận biết của XbaI được sử dụng
là điểm cắt nằm trên vùng đa điểm cắt và
một vị trí cắt của enzym EcoRI nằm trong
trình tự của gen pagA. Còn với enzym
hạn chế BglII, 2 vị trí cắt của enzym này
nằm trên vùng đa điểm cắt, ở 2 đầu của
đoạn gen cài xen vào. Dựa vào tính toán
lý thuyết, đã chọn được các dòng tế bào
mang plasmid chứa gen pagA cho sản
phẩm cắt có kích thước khoảng 4,0 và
1,2 kb, được cắt kiểm tra bằng cặp
enzym XbaI và EcoRI. Đối với enzym
BglII là khoảng 2,8 và 2,4 kb.
Hình 2: Kết quả cắt kiểm tra ADN plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc trên gel
agarose 1,2%.
M: Thang ADN 1 kb (Thermo Scientific); 1 - 4: Sản phẩm cắt bằng cặp enzym hạn chế XbaI và
EcoRI với các dòng khuẩn lạc 1 - 4; 5 - 7: Sản phẩm cắt bằng enzym hạn chế BglII với các
dòng khuẩn lạc 1, 2, 4 (chủng B. anthracis VCM1168)
Với cặp enzym hạn chế XbaI và
EcoRI, đường chạy số 2, 4 là 2 dòng
plasmid tái tổ hợp có mang gen ngoại
lai. Sản phẩm cắt bao gồm 2 band ADN
có kích thước tương đương tính toán lý
thuyết. Còn với enzym hạn chế BglII,
đường chạy số 6, 7 là 2 dòng plasmid
tái tổ hợp có mang gen ngoại lai. Sản
phẩm cắt gồm 2 band ADN có kích
thước đúng như tính toán là: 2,8 và 2,4
139
kb. Với kết quả này, có thể khẳng định:
đã tách dòng thành công toàn bộ gen
pagA của 3 chủng VK than là
VCM1168, 4NS và 1C3 trong vector
tách dòng pJet1.2/blunt. Chúng tôi đặt
tên cho vector tách dòng chứa toàn bộ
gen pagA này là pJET1-pagA1, pJET1pagA2, pJET1-pagA3, tương ứng với 3
chủng nghiên cứu là B. anthracis
VCM1168, 4NS và 1C3.
nguon tai.lieu . vn
NGHIÊN CỨU TOÀN BỘ TRÌNH TỰ GEN PAGA TRÊN MỘT SỐ
CHỦNG BACILLUS ATHRACIS PHÂN LẬP
Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM
Đinh Thị Thu Hằng*; Nguyễn Thái Sơn**
TÓM TẮT
Mục tiêu: nghiên cứu trình tự đầy đủ gen pagA (protective antigen gene) mã hóa kháng
nguyên bảo vệ PA (protein quan trọng tham gia tạo độc tố bệnh than) trên một số chủng
Bacillus anthracis có độc lực phân lập ở miền Bắc Việt Nam. Vật liệu và phương pháp: 3 chủng
B. anthracis do Viện Y học Dự phòng Quân đội cung cấp. Tách chiết và khuếch đại chính xác
ADN tổng số từ dịch nuôi cấy sau khi đã bất hoạt bằng nhiệt sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Toàn
bộ gen pagA được tách dòng trong vector pJET1.2/blunt, lựa chọn các plasmid tái tổ hợp mang
gen mong muốn và phân tích trình tự. Kết quả và kết luận: đã tách dòng và giải trình tự toàn bộ
gen pagA của 3 chủng B. anthracis có độc lực. Xác định được 3 đột biến điểm (TC), gồm 1
đột biến đồng nghĩa (TC)195 và 2 đột biến sai nghĩa (TC)1693, (TC)1799 khi so sánh với trình
tự tham chiếu B. anthracis Vollum-USA. Đột biến (TC)1693 xuất hiện trên cả 3/3 chủng B.
anthracis nghiên cứu. Còn 2 đột biến là (TC)195 và (TC)1799 tìm thấy ở cả 2 chủng 4NS,
1C3. Gen pagA rất bền vững, không có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng B. anthracis
nghiên cứu ở Việt Nam và thế giới.
*
Từ khóa: Gen pagA (protective antigen gene); Tách dòng gen; Độc lực; Bacillus anthracis;
Việt Nam.
Study of Complete Sequence of Protective Antigen Gene of
Bacillus Anthrasis Strains Isolated in Northern Vietnam
Summary
Objectives: Study of the entire sequences of pagA gene encoding protective antigen of
Bacillus anthracis strains isolated in Northern Vietnam. Materials and methods: Three B.
anthracis strains were provided by the Military Institute of Preventive Medicine. Total DNA of
heat inactived cultures were extracted and amplified PCR high fidelity using specific primer
pairs for complete pagA gene. The amplified pagA gene from B. anthracis strains were cloned
in pJET1.2/blunt by conventional recombinant methods and analysed recombinants plasmid by
restriction enzyme. PagA gene was sequenced from both ends by extension from vector
specific priming sites (pJET1.2_F and pJET1.2_R) and by primer walking.
* Học viện Quân y
** Bệnh viện Quân y 103
Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com)
Ngày nhận bài: 08/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 14/02/2015
Ngày bài báo được đăng: 02/03/2015
135
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
Results and conclusions: The pagA gene complete sequences were cloned, analysed of 3 B.
anthracis strains VCM1168, 4NS, 1C3 isolated in Northern Vietnam and this is the first
publication in Vietnam. Three point mutations (TC) were identified, one synonymous mutation
(TC)195 and two missense mutations (TC)1693 (Serine Proline) and (TC)1799 (Valine
Alanine) when compared with B. anthracis strain Vollum-USA. The results demonstrate that
pagA gene of B. anthracis strains is very conservative, there is no sequenced significant
difference between the studied B. anthracis strains in Vietnam and the world. The entire pagA
gene sequences of 3 B. anthracis strains VCM1168, 4NS and 1C3 were submitted in Genbank
with accession number KP213102, KP213103 and KP213104, respectively.
* Key words: PagA gene (protective antigen gene); Cloning; Virulence; Bacillus anthracis;
Vietnam.
ĐẶT VẤN ĐỀ
B. anthracis là trực khuẩn Gram
dương, sinh bào tử gây bệnh than nguy
hiểm ở người và động vật. Khả năng gây
bệnh của B. anthracis chủ yếu nhờ sự có
mặt của các gen nằm trên 2 plasmid lớn
là pXO1 (182 kb) và pXO2 (95 kb) - được
gọi là plasmid độc tố. pXO1 chứa các gen
sản xuất độc tố, trong khi pXO2 chứa gen
liên quan đến quá trình tổng hợp vỏ polyD-glutamic axít [5, 8]. Chỉ những chủng
có đầy đủ 2 plasmid này mới có khả năng
gây bệnh nguy hiểm. Những chủng thiếu
1 trong 2 plasmid (pXO1+, pXO2-); (pXO1, pXO2+) hoặc thiếu cả 2 plasmid (pXO1-,
pXO2-) sẽ bị giảm hẳn độc lực hoặc
không còn khả năng gây bệnh [7, 8]. Trên
plasmid pXO1, có 3 gen quan trọng nhất
lần lượt là gen lef mã hóa cho yếu tố gây
chết lethal factor (LF), gen cya mã hóa là
yếu tố gây phù nề (edema factor, EF) một adenylyl cyclase dẫn đến phù nề da
trong những cá thể nhiễm bệnh và gen
pagA mã hóa cho kháng nguyên bảo vệ
PA - protein quan trọng tham gia tạo độc
tố bệnh than (Anthrax) [6]. Trong đó, gen
pagA với kháng nguyên PA đóng vai trò
quyết định độc tính của vi khuẩn (VK)
136
than. Bản thân PA không gây độc, nhưng
khi khi kết hợp với yếu tố LF hay EF cho
phép tạo độc tố gây chết hay phù thũng
trong tế bào chủ nhiễm bệnh. Ngoài ra,
PA còn có khả năng gây đáp ứng miễn
dịch chống bệnh than [3, 8, 9].
Trên thế giới, đã có một số công trình
nghiên cứu về gen pagA cũng như
nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của
kháng nguyên bảo vệ PA. Price và CS
nghiên cứu về gen pagA từ 26 mẫu đa
dạng về nguồn gốc để xác định sự biến
đổi tự nhiên trong gen này, giúp hiểu
thêm sự tiến hóa của B. anthracis [9]. Ở
Việt Nam, bệnh than vẫn còn xuất hiện rải
rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Sơn
La, Điện Biên, Lai Châu... [1]. Gần đây,
(10 - 2014) ở Mèo Vạc, Hà Giang đã ghi
nhận 09 ca nhiễm bệnh than do ăn thịt gia
súc chết mắc bệnh than. Việc xuất hiện
trở lại của VK than một lần nữa cảnh báo
mầm bệnh nguy hiểm này cần được quan
tâm đúng mức và có phương án phòng
chống hiệu quả, tránh để xảy ra bùng
phát dịch. Hiện nay, nghiên cứu phân tử
về VK than phân lập ở Việt Nam, đặc biệt
về gen pagA còn hạn chế, chưa có
nghiên cứu phân tích trình tự toàn bộ
chiều dài gen pagA [1, 2]. Với phạm vi bài
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
báo này, chúng tôi công bố những kết
quả đạt được trong nghiên cứu tách dòng
và phân tích trình tự toàn bộ gen pagA từ
3 chủng B. anthracis có độc lực được
phân lập ở miền Bắc Việt Nam làm tiền
đề cho việc nghiên cứu chẩn đoán phân
tử VK than có độc lực.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Chủng VK B. anthracis và tách
chiết ADN.
Chủng B. anthracis VCM1168, 4NS và
1C3 có độc lực do Viện Y học Dự phòng
Quân đội cung cấp (hợp tác nghiên cứu
giữa Học viện Quân y và Cục Quân y).
Phân lập các chủng VK này từ BN và đất
nơi gia súc chết bị bệnh than, định danh
bằng thanh API50CH, PCR xác định gen
đặc trưng của VK than, thử nghiệm trên
động vật thí nghiệm (chuột nhắt trắng) để
khảo sát khả năng gây chết hàng loạt.
Tiến hành tách chiết ADN genome theo
quy trình của nhà sản xuất (ADN genome
QIAGen minikit) sau khi bất hoạt chủng ở
điều kiện 121oC/20 phút.
2. PCR.
Dựa trên trình tự gen pagA của các
chủng VK than đã được công bố trên
Ngân hàng gen (CP007665, AE011190,
CP001216...), chúng tôi thiết kế cặp mồi
đặc hiệu (bảng 1) nhằm nhân toàn bộ gen
pagA và đặt tổng hợp bởi IDT (Mỹ). Thiết
kế cặp mồi tách dòng gen pagA ở hai đầu
vùng nối là đầu 5’ và đầu 3’ của gen
pagA, cách trình tự start codon và stop
137
codon khoảng > 20 nucleotid đảm bảo
nhân trọn vẹn gen này. Thực hiện phản
ứng PCR high fidelity trên máy PCR
Eppendorf Master proS (Đức), sử dụng
hóa chất PCR high fidelity (Thermo
scientific). Phản ứng PCR 20 l gồm các
thành phần: Phusion Master Mix 1X với
HF Buffer (F-531S Thermo scientific);
0,25 M mồi xuôi, mồi ngược; ~ 10 ng
ADN khuôn; điều chỉnh H2O đủ thể tích
20 l. Chu trình nhiệt: biến tính 98oC
trong 30 giây, khuếch đại 30 chu kỳ
(98oC, 8 giây; 42oC, 20 giây; 72oC, 50
giây), sau đó hoàn thành kéo dài chuỗi ở
72ºC trong 6 phút. Sản phẩm PCR được
điện di kiểm tra trên gel agarose 1,2%
TBE 0,5X, nhuộm ethidium bromide, tiến
hành tinh sạch bằng kit GeneJet PCR
purification (#K0701 Thermo scientific),
điện di kiểm tra và định lượng bằng
Nanodrop.
3. Tách dòng gen pagA.
Tiến hành nối ghép trực tiếp sản phẩm
PCR tinh sạch gen pagA với vector tách
dòng pJET1.2/blunt nhờ T4-ligase
(Thermo scientific). Sản phẩm nối ghép
được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli
DH5 (One Shot Max Efficiency DH5 Invitrogen) bằng phương pháp sốc nhiệt
(42oC trong 45 giây) để tiến hành chọn
lọc dòng tế bào mang vector chứa gen
mong muốn. Tiến hành cắt kiểm tra
plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc bằng
enzym hạn chế BglII và cặp enzym hạn
chế XbaI và EcoRI (FastDigest - Thermo
scientific).
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
Bảng 1: Các mồi sử dụng trong nghiên cứu.
TÊN MỒI
MỤC ĐÍCH
TRÌNH TỰ (5’-3’)
KÍCH THƯỚC
SẢN PHẨM (bp)
pagAF/ BamHI
PCR
CGAGGATCCAAAGGAGAACGTATATGAA
2323
pagAR/XhoI
PCR
CA CTCGAG CACCTAGAATTACCTTATC
2323
pJET1.2_F
Giải trình tự
CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC
-
pagA_F1
Giải trình tự
CAACGAGAAAATCCTACTGA
-
pagA_F2
Giải trình tự
GATCAATCCACACAGAATAC
-
pagA_F3
Giải trình tự
TGGAAGAGTGAGGGTGGA
-
pJET1.2_R
Giải trình tự
AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG
-
4. Giải trình tự gen pagA.
Sau khi kiểm tra chính xác gen pagA trong vector tách dòng pJET1.2/blunt, các
plasmid tái tổ hợp mang gen pagA được giải trình tự theo nguyên lý Sanger trên máy
ABI 3730XL, sử dụng các mồi giải trình tự theo thiết kế (bảng 1), sử dụng phần mềm
Bioedit và Geneious R7 để xử lý, nối ghép tạo trình tự toàn bộ gen pagA, so sánh và
phân tích trình tự thu được với trình tự tham chiếu trên Ngân hàng Gen.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Khuếch đại gen pagA từ các chủng VK than có độc lực.
Theo tính toán, nếu như nhân thành công toàn bộ gen pagA với cặp mồi đã thiết kế,
sản phẩm PCR sẽ cho band ADN có kích thước 2.323 bp. Enzym sử dụng cho phản
ứng khuếch đại gen pagA là Phusion High-Fidelity ADN polymerase. Đây là enzym có
hiệu suất khuếch đại lớn, ngay cả trên những mẫu khuôn dài với độ chính xác và tốc
độ cao.
Hình 1: Kết quả kiểm tra sản phẩm tổng
hợp gen pagA trên gel agarose 1,2%.
M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo
Scientific); 1: Sản phẩm PCR của chủng
B. anthracis VCM1168.
Sản phẩm khuếch đại gen pagA từ chủng VK than VCM1168 bằng cặp mồi
pagAF/BamHI và pagAR/XhoI là 1 band rõ nét, đặc hiệu có kích thước tương đương
với kích thước mong muốn. Do đó, sản phẩm PCR được tinh sạch chuẩn bị cho các
bước tiếp theo.
138
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
2. Tách dòng toàn bộ gen pagA.
Tiến hành phản ứng nối ghép trực tiếp
sản phẩm PCR gen pagA sau tinh sạch
với vector pJET1.2/blunt, biến nạp vào tế
bào E. coli DH5α. Để kiểm tra sự có mặt
của gen pagA trong plasmid tái tổ hợp
(được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc),
chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra bằng
enzym hạn chế là cặp enzym XbaI và
EcoRI cùng với enzym BglII.
Với cặp enzym XbaI và EcoRI, một
trình tự nhận biết của XbaI được sử dụng
là điểm cắt nằm trên vùng đa điểm cắt và
một vị trí cắt của enzym EcoRI nằm trong
trình tự của gen pagA. Còn với enzym
hạn chế BglII, 2 vị trí cắt của enzym này
nằm trên vùng đa điểm cắt, ở 2 đầu của
đoạn gen cài xen vào. Dựa vào tính toán
lý thuyết, đã chọn được các dòng tế bào
mang plasmid chứa gen pagA cho sản
phẩm cắt có kích thước khoảng 4,0 và
1,2 kb, được cắt kiểm tra bằng cặp
enzym XbaI và EcoRI. Đối với enzym
BglII là khoảng 2,8 và 2,4 kb.
Hình 2: Kết quả cắt kiểm tra ADN plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc trên gel
agarose 1,2%.
M: Thang ADN 1 kb (Thermo Scientific); 1 - 4: Sản phẩm cắt bằng cặp enzym hạn chế XbaI và
EcoRI với các dòng khuẩn lạc 1 - 4; 5 - 7: Sản phẩm cắt bằng enzym hạn chế BglII với các
dòng khuẩn lạc 1, 2, 4 (chủng B. anthracis VCM1168)
Với cặp enzym hạn chế XbaI và
EcoRI, đường chạy số 2, 4 là 2 dòng
plasmid tái tổ hợp có mang gen ngoại
lai. Sản phẩm cắt bao gồm 2 band ADN
có kích thước tương đương tính toán lý
thuyết. Còn với enzym hạn chế BglII,
đường chạy số 6, 7 là 2 dòng plasmid
tái tổ hợp có mang gen ngoại lai. Sản
phẩm cắt gồm 2 band ADN có kích
thước đúng như tính toán là: 2,8 và 2,4
139
kb. Với kết quả này, có thể khẳng định:
đã tách dòng thành công toàn bộ gen
pagA của 3 chủng VK than là
VCM1168, 4NS và 1C3 trong vector
tách dòng pJet1.2/blunt. Chúng tôi đặt
tên cho vector tách dòng chứa toàn bộ
gen pagA này là pJET1-pagA1, pJET1pagA2, pJET1-pagA3, tương ứng với 3
chủng nghiên cứu là B. anthracis
VCM1168, 4NS và 1C3.