Xem mẫu
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT ELISA
ĐỊNH LƢỢNG NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA
Hà Thị Hải*; Nguyễn Ngọc Tuấn**; Nguyễn Trung Nguyên***
Phùng Thế Hải**; Nguyễn Đặng Dũng**
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn Hổ mang miền Bắc Việt Nam
(Naja atra). Đối tượng và phương pháp: bộ xét nghiệm ELISA sử dụng huyết thanh kháng nọc
rắn N.atra đặc hiệu từ ngựa và thỏ; tiến hành tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, xác định
ngưỡng phát hiện và giới hạn định lượng của bộ xét nghiệm. Kết quả: ngưỡng phát hiện (LOD)
của bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn Hổ mang N.atra là 0,87 ng/ml, giới hạn định lượng
(LOQ) là 1,27 ng/ml; bộ kít đạt yêu cầu về độ nhạy, độ ổn định và độ đúng.
* Từ khóa: Nọc rắn; Naja atra; ELISA.
Development of Quantitative ELISA Test Kit for the Detection of
Chinese Cobra (Naja atra) Venom
Summary
Objective: To develop an ELISA test for venom quantitation in clinical samples of snakebite
victims by Chinese cobra (Naja atra). Materials and methods: An ELISA testkit (developed using
horse and rabbit sera specific to N.atra venom) was optimized for reaction conditions, as well as
limit of detection (LoD), limit of quantitation (LoQ). Results: LoD and LoQ values of the test for
were 0.87 ng/ml and 1.27 ng/ml, respectively; the test was primarily qualified for analytical
sensitivity, reproducibility and accuracy.
* Key words: Venom; Naja atra; ELISA.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Với nạn nhân rắn độc cắn, việc đánh
giá mức độ nhiễm độc có giá trị hỗ trợ
cho việc theo dõi tiến triển bệnh nhân
(BN), chỉ định điều trị bằng huyết thanh
kháng nọc đặc hiệu và tiên lượng bệnh.
Tuy nhiên, việc phân mức độ nhiễm độc
đối với nạn nhân rắn độc cắn nói chung,
với rắn Hổ mang nói riêng chủ yếu dựa
vào kinh nghiệm lâm sàng của bác sỹ
điều trị nạn nhân rắn độc cắn. Do vậy,
có sự khác nhau giữa các trung tâm
điều trị nạn nhận rắn độc cắn. Xét nghiệm
xác định nọc rắn định tính và định lượng
được xem là cơ sở khoa học khách quan,
* §¹i häc Y Th¸i B×nh
** Häc viÖn Qu©n y
*** BÖnh viÖn B¹ch Mai
Người phản hồi (Corresponding): NguyÔn §Æng Dòng (dzungmd@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/01/2015
Ngày bài báo được đăng: 28/01/2015
38
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
giúp phân loại mức độ nhiễm độc nọc rắn
trên lâm sàng. Dựa trên kết quả định lượng
nồng độ nọc rắn trong máu nạn nhân, đối
chiếu với sự xuất hiện và mức độ biểu hiện
của một số triệu chứng, bác sỹ điều trị có
thể đánh giá một cách khách quan hơn
mức độ nhiễm độc nọc rắn và đặc biệt, có
thể chỉ định và/hoặc điều chỉnh liều sử
dụng huyết thanh kháng nọc đặc hiệu
cho nạn nhân. Kỹ thuật ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay) là phương
pháp phân tích miễn dịch dựa trên tương
tác giữa kháng nguyên và kháng thể, với
một số ưu điểm đáng kể là độ nhạy phân
tích cao, tương đối dễ thực hiện, thời gian
thực hiện không kéo dài, có thể thực hiện
đồng thời với nhiều mẫu hoặc thực hiện
từng mẫu thử. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi tiến hành xây dựng và tối ưu
hóa những điều kiện chủ yếu cho một hệ
thống kít ELISA sử dụng lượng nọc rắn
Hổ mang Naja atra trên in vitro.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu.
* Sinh phẩm, hóa chất:
- Nọc rắn Hổ mang miền Bắc (Naja atra).
- Kháng thể IgG ngựa kháng nọc rắn
Hổ mang Naja atra (Đài Loan), kháng thể
IgG thỏ kháng nọc rắn Hổ mang Naja atra
(Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y),
kháng thể kháng IgG thỏ gắn enzym (Thermo).
- Các hóa chất: OPD, gelatin, PBS...
(Hãng Sigma và Merck).
* Dụng cụ, thiết bị:
- Micropipette và đầu côn các loại: 2 µl,
10 µl, 20 µl, 200 µl, 1.000 µl.
- Pipet đa kênh loại 100 - 300 µl.
- Phiến ELISA 96 giếng (Corning).
- Tủ ấm.
- Máy đo mật độ quang DTX 880
(Beckman Coulter).
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Nguyên lý phản ứng:
Hình 1: Sơ đồ thiết kế và các bước tiến hành phản ứng ELISA.
39
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
Thiết kế phản ứng dựa dựa trên
nguyên lý của kỹ thuật ELISA sandwich
(hình 1), trong đó kháng thể thứ nhất (KT1)
là kháng thể IgG đặc hiệu với nọc rắn Hổ
1. Xác định các điều kiện tối ƣu của
phản ứng.
mang Naja atra (sử dụng làm kháng thể bắt
giữ), gắn cố định trên bề mặt giếng phản
ứng (pha rắn - solid phase); kháng thể thứ
hai (KT2 - kháng thể phát hiện) là kháng thể
đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn, nhưng
có nguồn gốc khác với kháng thể bắt giữ;
kháng thể thứ ba (KT3) kháng thể kháng lại
kháng thể phát hiện, được gắn enzym
horse-radish peoxidase (HRP).
* Xây dựng và tối ưu hóa hệ thống ELISA
định lượng nọc rắn:
- Xác định các điều kiện tối ưu của phản
ứng.
- Xây dựng đường chuẩn tương quan
tuyến tính giữa mật độ quang (OD) của
dung dịch phản ứng và nồng độ nọc rắn
chuẩn.
- Xác định ngưỡng phát hiện của bộ kít.
- Xác định độ ổn định của bộ kít bằng
cách tính toán hệ số biến thiên (CV) giữa
các lần thực hiện phản ứng độc lập nhau.
- Xác định độ đúng của kỹ thuật bằng
cách tính toán tỷ lệ phục hồi (%) sau khi tiến
hành định lượng trên mẫu chuẩn với nồng
Nhằm đạt độ nhạy và độ chính xác cao
nhất khi phân tích bằng phương pháp
ELISA, tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết
quả phân tích cần được khảo sát. Dưới đây
là một số thông số để phản ứng đạt được
mật độ quang (OD) tối ưu và phù hợp nhất
cho phản ứng bao gồm:
- Nọc rắn chuẩn pha trong dung dịch FBS.
- Nồng độ kháng thể gắn bản (IgG ngựa
kháng nọc rắn) 10 µg/ml.
- Nồng độ kháng thể phát hiện (IgG thỏ
kháng nọc rắn) 5 µg/ml.
- Kháng thể gắn enzym pha loãng ở tỷ lệ
thể tích 1:10.000 trong dung dịch PBS-T
(0,05% Tween).
- Dung dịch blocking: gelatin 1%.
- Nồng độ cơ chất 0,5 mg/ml OPD pha
trong đệm citrate có bổ sung 0,006% H2O2.
- Thời gian ủ mẫu 60 phút, ủ kháng thể
phát hiện 30 phút, ủ kháng thể gắn enzym
30 phút và ủ cơ chất 10 phút.
- Nhiệt độ áp dụng 37oC.
2. Xây dựng đƣờng chuẩn.
lượng nọc rắn Hổ mang Naja atra trên nạn
Tổng số nọc rắn 1 mg/ml, pha thành các
nồng độ: 100 ng/ml; 31,6 ng/ml; 10 ng/ml; 3
ng/ml; 1 ng/ml và 0,3 ng/ml (pha trong dung
dịch FBS). Qua nghiên cứu, chúng tôi đã
nhân đã được chẩn đoán xác định là bị rắn
xây dựng được khoảng tuyến tính từ 0,3 -
Hổ mang Naja atra cắn. Do đó, trong nghiên
31,6 ng/ml có OD từ 0,06 - 0,6 (R2 = 0,999;
cứu này, chúng tôi không tiến hành khảo sát
hình 2).
độ nọc rắn đã biết.
Mục đích phát triển bộ kít là nhằm định
độ đặc hiệu chẩn đoán của bộ kít đã xây
dựng.
40
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
Nång ®é näc r¾n chuÈn
Bảng 1: Độ nhạy của bộ kít ELISA (LOD
và LOQ).
L O D
L O Q
O D
S è
c h ø n Sg D
g iÕ n g
© m
Nồng
Nồng
độ
OD
MËt ®é quang OD
24
0,073
0,001 0,075
độ
OD
(ng/ml)
0,82
(ng/ml)
0,083
1,27
Như vậy, LOD của phản ứng có mật độ
Hình 2: Đồ thị đường chuẩn của
phản ứng.
quang 0,075 và LOQ là 0,083. Dựa theo
đường chuẩn, LOD, tính theo nồng độ của
nọc rắn tổng số là 0,87 ng/ml và LOQ tương
ứng là 1,27 ng/ml.
4. Kết quả xác định độ ổn định và độ
đúng của phƣơng pháp.
Bảng 2: Hệ số biến thiên.
M
M É u
Mo (ng/ml)
t h ö
H Ö
c ñ a
l Ë p
Hình 3: Phản ứng ELISA với mẫu
nọc rắn chuẩn.
3. Xác định ngƣỡng phát hiện của bộ
kít.
Độ nhạy của phản ứng được đại diện bởi
giới hạn phát hiện (LOD: Limit of Detection)
và giới hạn định lượng (LOQ: Limit of
Quantification). LOD là lượng thấp nhất chất
cần thử trong mẫu thử còn có thể phát hiện
được mà không nhất thiết phải xác định
chính xác hàm lượng. LOQ là lượng thấp
nhất chất cần thử có trong mẫu thử còn có
thể xác định được với mức độ đúng và
chính xác thích hợp.
(ng/ml)
t h iª n
(
® é
® Þn h
(
1
15
14,93 ± 0,38
2,12
97,88
2
45
44,18 ± 0,62
1,4
98,6
3
75
74,15 ± 1,67
2,25
97,75
1,92
98,1
Trung bình
Độ ổn định được thể hiện bằng hệ số
biến thiên giữa các lần thực hiện phản ứng
với mẫu nọc rắn chuẩn. Trong nghiên cứu
này, chúng tôi xác định hệ số biến thiên (CV:
coefficient of variation) sau khi thực hiện lặp
lại phản ứng 6 lần trên cùng một khay phản
ứng ELISA, bằng cách sử dụng công thức
tính toán: CV = SD/M x 100 (%), trong đó, M
Từ mật độ quang của mẫu chứng âm, độ
nhạy của phản ứng được tính toán và trình
bày ở bảng 1.
41
là giá trị nồng độ đo được dựa vào đường
chuẩn, SD là độ lệch chuẩn.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
Bảng 3: Tỷ lệ phục hồi trên mẫu chuẩn.
M
T û
M É u
Mo (ng/ml)
c ñ a
h å i
o
x
t h ö
t h ù c (ng/ml)
1
1
15
14,68 ± 1,16
97,8
2
45
44,5 ± 2,7
98,88
3
75
73,48 ± 3,58
97,97
Trung bình
TÀI LIỆU THAM KHẢO
đúng của phương pháp, được tính theo
công thức: M/Mo x 100, trong đó M là giá trị
đo được dựa vào đường chuẩn, Mo là giá trị
thực (nồng độ mẫu chuẩn đã biết trước). Để
xác định tỷ lệ phục hồi và độ lặp lại giữa các
lần thực hiện độc lập nhau (cùng một quy
trình và do 3 người khác nhau thực hiện,
mỗi người lặp lại 3 lần), mẫu nọc rắn chuẩn
được pha ở 3 nồng độ 15 ng/ml; 45 ng/ml và
75 ng/ml (trong dung dịch FBS).
Với tỷ lệ phục hồi 98,22% và hệ số biến
thiên trung bình trong cùng lần thực hiện
phản ứng là 1,92% cho thấy phương pháp
42
Đã phát triển được bộ kít ELISA định
lượng nọc rắn Hổ mang miền Bắc Naja atra
sử dụng hai nguồn kháng thể đặc hiệu nọc
rắn Hổ mang Naja atra từ thỏ và ngựa. Bộ
kít đạt được các chỉ tiêu về độ nhạy, độ ổn
định và độ đúng.
98,22
Tỷ lệ phục hồi là đại lượng đánh giá độ
đạt độ đúng và độ ổn định cao.
KẾT LUẬN
1. Lê Văn Đông và CS. Nghiên cứu chế tạo
bộ xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán rắn độc cắn
ở Việt Nam. Báo cáo kết quả đề tài. Học viện
Quân y, Bộ Quốc phòng. 2010.
2. Nguyễn Văn Cường và CS. Phát triển
phương pháp xác định tồn dư 2,4-D trong hoa
quả bằng kỹ thuật ELISA. Nông nghiệp-Nông
thôn-Môi trường. 2005, số 1, tr.69-71.
3. Christiane K. Fæste, Christin Plassen.
Quantitative
sandwich
ELISA
for
the
determination of fish in foods. Journal of
Immunological Methods. 2008, (329), pp.45-55.
4. Jeffre C. Johnson, Jeanette M. Van Emon,
Ann N. Clarke, Brad N. Wamsley. Quantitative
ELISA of polychlorinated biphenyls in an oily soil
matrix using supercritical fluid extraction.
Analytica Chimica Acta. 2001, 428, pp.191-199.
nguon tai.lieu . vn
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT ELISA
ĐỊNH LƢỢNG NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA
Hà Thị Hải*; Nguyễn Ngọc Tuấn**; Nguyễn Trung Nguyên***
Phùng Thế Hải**; Nguyễn Đặng Dũng**
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn Hổ mang miền Bắc Việt Nam
(Naja atra). Đối tượng và phương pháp: bộ xét nghiệm ELISA sử dụng huyết thanh kháng nọc
rắn N.atra đặc hiệu từ ngựa và thỏ; tiến hành tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, xác định
ngưỡng phát hiện và giới hạn định lượng của bộ xét nghiệm. Kết quả: ngưỡng phát hiện (LOD)
của bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn Hổ mang N.atra là 0,87 ng/ml, giới hạn định lượng
(LOQ) là 1,27 ng/ml; bộ kít đạt yêu cầu về độ nhạy, độ ổn định và độ đúng.
* Từ khóa: Nọc rắn; Naja atra; ELISA.
Development of Quantitative ELISA Test Kit for the Detection of
Chinese Cobra (Naja atra) Venom
Summary
Objective: To develop an ELISA test for venom quantitation in clinical samples of snakebite
victims by Chinese cobra (Naja atra). Materials and methods: An ELISA testkit (developed using
horse and rabbit sera specific to N.atra venom) was optimized for reaction conditions, as well as
limit of detection (LoD), limit of quantitation (LoQ). Results: LoD and LoQ values of the test for
were 0.87 ng/ml and 1.27 ng/ml, respectively; the test was primarily qualified for analytical
sensitivity, reproducibility and accuracy.
* Key words: Venom; Naja atra; ELISA.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Với nạn nhân rắn độc cắn, việc đánh
giá mức độ nhiễm độc có giá trị hỗ trợ
cho việc theo dõi tiến triển bệnh nhân
(BN), chỉ định điều trị bằng huyết thanh
kháng nọc đặc hiệu và tiên lượng bệnh.
Tuy nhiên, việc phân mức độ nhiễm độc
đối với nạn nhân rắn độc cắn nói chung,
với rắn Hổ mang nói riêng chủ yếu dựa
vào kinh nghiệm lâm sàng của bác sỹ
điều trị nạn nhân rắn độc cắn. Do vậy,
có sự khác nhau giữa các trung tâm
điều trị nạn nhận rắn độc cắn. Xét nghiệm
xác định nọc rắn định tính và định lượng
được xem là cơ sở khoa học khách quan,
* §¹i häc Y Th¸i B×nh
** Häc viÖn Qu©n y
*** BÖnh viÖn B¹ch Mai
Người phản hồi (Corresponding): NguyÔn §Æng Dòng (dzungmd@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/01/2015
Ngày bài báo được đăng: 28/01/2015
38
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
giúp phân loại mức độ nhiễm độc nọc rắn
trên lâm sàng. Dựa trên kết quả định lượng
nồng độ nọc rắn trong máu nạn nhân, đối
chiếu với sự xuất hiện và mức độ biểu hiện
của một số triệu chứng, bác sỹ điều trị có
thể đánh giá một cách khách quan hơn
mức độ nhiễm độc nọc rắn và đặc biệt, có
thể chỉ định và/hoặc điều chỉnh liều sử
dụng huyết thanh kháng nọc đặc hiệu
cho nạn nhân. Kỹ thuật ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay) là phương
pháp phân tích miễn dịch dựa trên tương
tác giữa kháng nguyên và kháng thể, với
một số ưu điểm đáng kể là độ nhạy phân
tích cao, tương đối dễ thực hiện, thời gian
thực hiện không kéo dài, có thể thực hiện
đồng thời với nhiều mẫu hoặc thực hiện
từng mẫu thử. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi tiến hành xây dựng và tối ưu
hóa những điều kiện chủ yếu cho một hệ
thống kít ELISA sử dụng lượng nọc rắn
Hổ mang Naja atra trên in vitro.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu.
* Sinh phẩm, hóa chất:
- Nọc rắn Hổ mang miền Bắc (Naja atra).
- Kháng thể IgG ngựa kháng nọc rắn
Hổ mang Naja atra (Đài Loan), kháng thể
IgG thỏ kháng nọc rắn Hổ mang Naja atra
(Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y),
kháng thể kháng IgG thỏ gắn enzym (Thermo).
- Các hóa chất: OPD, gelatin, PBS...
(Hãng Sigma và Merck).
* Dụng cụ, thiết bị:
- Micropipette và đầu côn các loại: 2 µl,
10 µl, 20 µl, 200 µl, 1.000 µl.
- Pipet đa kênh loại 100 - 300 µl.
- Phiến ELISA 96 giếng (Corning).
- Tủ ấm.
- Máy đo mật độ quang DTX 880
(Beckman Coulter).
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Nguyên lý phản ứng:
Hình 1: Sơ đồ thiết kế và các bước tiến hành phản ứng ELISA.
39
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
Thiết kế phản ứng dựa dựa trên
nguyên lý của kỹ thuật ELISA sandwich
(hình 1), trong đó kháng thể thứ nhất (KT1)
là kháng thể IgG đặc hiệu với nọc rắn Hổ
1. Xác định các điều kiện tối ƣu của
phản ứng.
mang Naja atra (sử dụng làm kháng thể bắt
giữ), gắn cố định trên bề mặt giếng phản
ứng (pha rắn - solid phase); kháng thể thứ
hai (KT2 - kháng thể phát hiện) là kháng thể
đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn, nhưng
có nguồn gốc khác với kháng thể bắt giữ;
kháng thể thứ ba (KT3) kháng thể kháng lại
kháng thể phát hiện, được gắn enzym
horse-radish peoxidase (HRP).
* Xây dựng và tối ưu hóa hệ thống ELISA
định lượng nọc rắn:
- Xác định các điều kiện tối ưu của phản
ứng.
- Xây dựng đường chuẩn tương quan
tuyến tính giữa mật độ quang (OD) của
dung dịch phản ứng và nồng độ nọc rắn
chuẩn.
- Xác định ngưỡng phát hiện của bộ kít.
- Xác định độ ổn định của bộ kít bằng
cách tính toán hệ số biến thiên (CV) giữa
các lần thực hiện phản ứng độc lập nhau.
- Xác định độ đúng của kỹ thuật bằng
cách tính toán tỷ lệ phục hồi (%) sau khi tiến
hành định lượng trên mẫu chuẩn với nồng
Nhằm đạt độ nhạy và độ chính xác cao
nhất khi phân tích bằng phương pháp
ELISA, tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết
quả phân tích cần được khảo sát. Dưới đây
là một số thông số để phản ứng đạt được
mật độ quang (OD) tối ưu và phù hợp nhất
cho phản ứng bao gồm:
- Nọc rắn chuẩn pha trong dung dịch FBS.
- Nồng độ kháng thể gắn bản (IgG ngựa
kháng nọc rắn) 10 µg/ml.
- Nồng độ kháng thể phát hiện (IgG thỏ
kháng nọc rắn) 5 µg/ml.
- Kháng thể gắn enzym pha loãng ở tỷ lệ
thể tích 1:10.000 trong dung dịch PBS-T
(0,05% Tween).
- Dung dịch blocking: gelatin 1%.
- Nồng độ cơ chất 0,5 mg/ml OPD pha
trong đệm citrate có bổ sung 0,006% H2O2.
- Thời gian ủ mẫu 60 phút, ủ kháng thể
phát hiện 30 phút, ủ kháng thể gắn enzym
30 phút và ủ cơ chất 10 phút.
- Nhiệt độ áp dụng 37oC.
2. Xây dựng đƣờng chuẩn.
lượng nọc rắn Hổ mang Naja atra trên nạn
Tổng số nọc rắn 1 mg/ml, pha thành các
nồng độ: 100 ng/ml; 31,6 ng/ml; 10 ng/ml; 3
ng/ml; 1 ng/ml và 0,3 ng/ml (pha trong dung
dịch FBS). Qua nghiên cứu, chúng tôi đã
nhân đã được chẩn đoán xác định là bị rắn
xây dựng được khoảng tuyến tính từ 0,3 -
Hổ mang Naja atra cắn. Do đó, trong nghiên
31,6 ng/ml có OD từ 0,06 - 0,6 (R2 = 0,999;
cứu này, chúng tôi không tiến hành khảo sát
hình 2).
độ nọc rắn đã biết.
Mục đích phát triển bộ kít là nhằm định
độ đặc hiệu chẩn đoán của bộ kít đã xây
dựng.
40
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
Nång ®é näc r¾n chuÈn
Bảng 1: Độ nhạy của bộ kít ELISA (LOD
và LOQ).
L O D
L O Q
O D
S è
c h ø n Sg D
g iÕ n g
© m
Nồng
Nồng
độ
OD
MËt ®é quang OD
24
0,073
0,001 0,075
độ
OD
(ng/ml)
0,82
(ng/ml)
0,083
1,27
Như vậy, LOD của phản ứng có mật độ
Hình 2: Đồ thị đường chuẩn của
phản ứng.
quang 0,075 và LOQ là 0,083. Dựa theo
đường chuẩn, LOD, tính theo nồng độ của
nọc rắn tổng số là 0,87 ng/ml và LOQ tương
ứng là 1,27 ng/ml.
4. Kết quả xác định độ ổn định và độ
đúng của phƣơng pháp.
Bảng 2: Hệ số biến thiên.
M
M É u
Mo (ng/ml)
t h ö
H Ö
c ñ a
l Ë p
Hình 3: Phản ứng ELISA với mẫu
nọc rắn chuẩn.
3. Xác định ngƣỡng phát hiện của bộ
kít.
Độ nhạy của phản ứng được đại diện bởi
giới hạn phát hiện (LOD: Limit of Detection)
và giới hạn định lượng (LOQ: Limit of
Quantification). LOD là lượng thấp nhất chất
cần thử trong mẫu thử còn có thể phát hiện
được mà không nhất thiết phải xác định
chính xác hàm lượng. LOQ là lượng thấp
nhất chất cần thử có trong mẫu thử còn có
thể xác định được với mức độ đúng và
chính xác thích hợp.
(ng/ml)
t h iª n
(
® é
® Þn h
(
1
15
14,93 ± 0,38
2,12
97,88
2
45
44,18 ± 0,62
1,4
98,6
3
75
74,15 ± 1,67
2,25
97,75
1,92
98,1
Trung bình
Độ ổn định được thể hiện bằng hệ số
biến thiên giữa các lần thực hiện phản ứng
với mẫu nọc rắn chuẩn. Trong nghiên cứu
này, chúng tôi xác định hệ số biến thiên (CV:
coefficient of variation) sau khi thực hiện lặp
lại phản ứng 6 lần trên cùng một khay phản
ứng ELISA, bằng cách sử dụng công thức
tính toán: CV = SD/M x 100 (%), trong đó, M
Từ mật độ quang của mẫu chứng âm, độ
nhạy của phản ứng được tính toán và trình
bày ở bảng 1.
41
là giá trị nồng độ đo được dựa vào đường
chuẩn, SD là độ lệch chuẩn.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
Bảng 3: Tỷ lệ phục hồi trên mẫu chuẩn.
M
T û
M É u
Mo (ng/ml)
c ñ a
h å i
o
x
t h ö
t h ù c (ng/ml)
1
1
15
14,68 ± 1,16
97,8
2
45
44,5 ± 2,7
98,88
3
75
73,48 ± 3,58
97,97
Trung bình
TÀI LIỆU THAM KHẢO
đúng của phương pháp, được tính theo
công thức: M/Mo x 100, trong đó M là giá trị
đo được dựa vào đường chuẩn, Mo là giá trị
thực (nồng độ mẫu chuẩn đã biết trước). Để
xác định tỷ lệ phục hồi và độ lặp lại giữa các
lần thực hiện độc lập nhau (cùng một quy
trình và do 3 người khác nhau thực hiện,
mỗi người lặp lại 3 lần), mẫu nọc rắn chuẩn
được pha ở 3 nồng độ 15 ng/ml; 45 ng/ml và
75 ng/ml (trong dung dịch FBS).
Với tỷ lệ phục hồi 98,22% và hệ số biến
thiên trung bình trong cùng lần thực hiện
phản ứng là 1,92% cho thấy phương pháp
42
Đã phát triển được bộ kít ELISA định
lượng nọc rắn Hổ mang miền Bắc Naja atra
sử dụng hai nguồn kháng thể đặc hiệu nọc
rắn Hổ mang Naja atra từ thỏ và ngựa. Bộ
kít đạt được các chỉ tiêu về độ nhạy, độ ổn
định và độ đúng.
98,22
Tỷ lệ phục hồi là đại lượng đánh giá độ
đạt độ đúng và độ ổn định cao.
KẾT LUẬN
1. Lê Văn Đông và CS. Nghiên cứu chế tạo
bộ xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán rắn độc cắn
ở Việt Nam. Báo cáo kết quả đề tài. Học viện
Quân y, Bộ Quốc phòng. 2010.
2. Nguyễn Văn Cường và CS. Phát triển
phương pháp xác định tồn dư 2,4-D trong hoa
quả bằng kỹ thuật ELISA. Nông nghiệp-Nông
thôn-Môi trường. 2005, số 1, tr.69-71.
3. Christiane K. Fæste, Christin Plassen.
Quantitative
sandwich
ELISA
for
the
determination of fish in foods. Journal of
Immunological Methods. 2008, (329), pp.45-55.
4. Jeffre C. Johnson, Jeanette M. Van Emon,
Ann N. Clarke, Brad N. Wamsley. Quantitative
ELISA of polychlorinated biphenyls in an oily soil
matrix using supercritical fluid extraction.
Analytica Chimica Acta. 2001, 428, pp.191-199.