Xem mẫu
Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
Nghiên cứu định lượng BERBERIN CHLORID trong
“viên nén đại tràng 105” bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hồ Cảnh Hậu*; Hoàng Văn Thêm*; Nguyễn Thị Lan Hương*
Nguyễn Văn Thuận**; Nguyễn Cẩm Vân***; Nguyễn Tuấn Quang***
Tóm tắt
Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng berbein chlorid trong “Viên nén đại tràng 105”
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng và phương pháp: “Viên nén đại tràng 105”
do Bệnh viện Quân y 105 sản xuất được tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC với cột: RP18
(150 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng 345 nm, tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, pha
động là hỗn hợp methanol-acetonitril-dung dịch axít phosphoric 0,1% (5:3:3). Kết quả: phương
pháp xây dựng đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính, độ đúng và độ lặp lại.
Giới hạn phát hiện của berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” là 0,02 µg/ml. Áp dụng
xác định hàm lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” là 37,65 ± 1,02 (mg/viên).
Kết luận: phương pháp xây dựng đảm bảo yêu cầu và có thể được dùng để định lượng
berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105”.
* Từ khóa: Berberin chlorid; “Viên nén đại tràng 105”; Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Quantitative Study on Berberin Chloride in “Vien nen dai trang 105”
by High Performace Liquid Chromatography
Summary
Objective: To establish the quantitative methodology measuring the amount of berberin
chloride in “Vien nen dai trang 105” by high performance liquid chromatography (HPLC). Subjects
and methodology: “Vien nen dai trang 105” produced by 105 Hospital is analysed using the
HPLC system with a column of RP18 (150 x 4.6 mm, 5 µm), the wave length of 345 nm, the flow
rate water of 1.2 ml/min, injection volume: 20 µl, a mixture of methanol- acetonitrile-acide
phosphoric 0.1% with ratio (5:3:3) as mobile phase. Results: This methodology ensures the
specificity, compatibility, linearity, preciseness and repeatability. The limitation of berberin
chlorid in “Vien nen dai trang 105” found is 0.02 µg/ml. As a result, the amount of berberin
chlorid measured in “Vien nen dai trang 105” is 37.65 ± 1.02 (mg/pill). Conclusion: The methodology
meets all the requirements and can be used to measure the amount of berberin chlorid in “Vien
nen dai trang 105”
* Key words: Berberin chlorid; “Vien nen dai trang 105”; High performance liquid chromatography.
* Bệnh viện Quân y 105
** Bệnh viện Quân y 7
*** Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (drquang2000@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 24/12/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 12/01/2015
Ngày bài báo được đăng: 26/01/2015
75
Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
Đặt vấn đề
“Viên nén đại tràng 105” là đề tài đang
được Bệnh viện Quân y 105, Tổng cục
Hậu cần nghiên cứu phát triển từ bài
thuốc y học cổ truyền để điều trị viêm đại
tràng cấp và mạn tính rất có hiệu quả.
Thành phần của “Viên nén đại tràng 105”
có sự kết hợp của các dược liệu và hoạt
chất từ dược liệu như Hoàng đằng, cao Bồ
giác, berberin chlorid…, trong đó, berberin
chlorid chiếm tỷ lệ khá cao và được coi là
thành phần chính của dược phẩm. Berberin
chlorid được chiết xuất từ các dược liệu
như Vàng đắng, Hoàng liên,… [1, 2, 5],
có tác dụng ức chế đối với vi khuẩn
Shigella, Bacillus cholerae, Staphylococus
aureus…, tác dụng chống vi khuẩn tả Vibrio
cholerae, tác dụng với lỵ amip. Đặc biệt,
dùng berberin điều trị nhiễm khuẩn đường
ruột không ảnh hưởng đến sự phát triển
của hệ vi khuẩn có ích ở ruột [3, 9].
Việc nghiên cứu định lượng berberin
chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” góp
phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản
phẩm, cũng như xây dựng công thức bào
chế. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu định lượng berberin trong “Viên nén
đại tràng 105” bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao.
Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp
nghiên cứu
1. Nguyên liệu và thiết bị.
- “Viên nén đại tràng 105” được sản
xuất tại Bệnh viện Quân y 105, Tổng cục
Hậu cần.
- Hóa chất: acetonitril, methanol, axít
phosphoric 0,1%, nước cất đạt tiêu chuẩn
cho HPLC; chất chuẩn berberin chlorid
77
(Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương,
99%); các hóa chất dung môi khác đạt
tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Shimadzu 10 Avp (Nhật Bản) gồm hệ bơm
4 kênh dung môi, autosampler, detector UV,
cột RP18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) và bảo vệ
cột cùng loại.
- Dụng cụ: cân phân tích Sartorius (độ
chính xác 0,1 mg) và các dụng cụ thí
nghiệm khác.
2. Phương pháp nghiên cứu.
- Điều kiện sắc ký:
+ Cột: RP18 (150 x 4,6 mm, 5 µm).
+ Bước sóng phát hiện: 345 nm.
+ Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.
+ Thể tích tiêm: 20 µl.
+ Pha động: hỗn hợp methanol-acetonitrildung dịch axít phosphoric 0,1% (5:3:3),
thêm vào mỗi 100 ml hỗn hợp 0,1 g natri
lauryl sulfat (TT) [4, 8, 9].
- Phương pháp xử lý mẫu:
+ Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn được
pha bằng cách hòa tan berberin chlorid
chuẩn trong pha động để có nồng độ 30
µg/ml, lọc qua màng 0,45 µm thu được
dung dịch thử.
+ Mẫu thử: cân chính lượng bột viên
tương đương khoảng 15 mg berberin
chlorid vào bình định mức 50 ml, hòa tan
và pha loãng vừa đủ bằng pha động
(dung dịch A). Hút chính xác 3 ml dung
dịch A, pha loãng vừa đủ thành 25 ml với
pha động, lọc qua màng 0,45 µm. Dịch
lọc dùng để tiêm mẫu.
+ Mẫu trắng: pha động, lọc qua màng
lọc 0,45 µm.
Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
- Thẩm định phương pháp: với các tiêu
chí về tính đặc hiệu, tính tương thích, tính
tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn
phát hiện [4, 7].
0.4
0.3
5.170
1. Tính đặc hiệu.
Volts
0.2
KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn
0.0
1
Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn,
mẫu thử và mẫu trắng. Kết quả trên sắc
ký đồ (SKĐ) cho thấy: mẫu thử cho pic có
thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu
của mẫu chuẩn berberin chlorid; pic của
berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng
105” ở mẫu thử rõ ràng, cân đối, tách
hoàn toàn khỏi pic tạp. Đồng thời, mẫu
trắng không thấy xuất hiện pic có thời
gian lưu tương ứng với mẫu chuẩn và
mẫu thử (hình 2, hình 3 và hình 4).
Berberin
0.1
0
1
2
3
4
5
6
7
Minutes
Hình 3: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của
mẫu thử.
2. Tính tương thích.
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch
mẫu chuẩn berberin chlorid có nồng độ
khoảng 30 µg/ml vào hệ thống sắc ký.
Bảng 1: Tính tương thích của hệ thống
sắc ký.
0.0100
0.0075
stt
Thêi gian l-u
(phót)
DiÖn tÝch pic
1
5,175
2498965
2
5,172
2515328
3
5,173
2516250
4
5,172
2515583
5
5,170
2516382
6
5,167
2516104
TB
5,172
2513102
SD
0,003
6937,51
RSD%
0,05
0,28
Volts
0.0050
(Berberin)
0.0025
(µAU*s)
0.0000
0
1
2
3
4
5
6
7
Minutes
Hình 1: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của
mẫu trắng.
0.3
Volts
0.2
Berberin
5.172
0.1
1
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
Minutes
Hình 2: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của
mẫu chuẩn berberin chlorid.
78
Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian
lưu và diện tích pic berberin chlorid lần
lượt là 0,05% và 0,28%. Như vậy, phương
pháp phân tích hoàn toàn phù hợp với hệ
thống sắc ký.
Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
3. Tính tuyến tính.
Pha một dãy các dung dịch chuẩn trong
pha động có nồng độ berberin chlorid từ
5 - 60 µg/ml. Tiến hành sắc ký các dung
dịch theo điều kiện sắc ký đã nêu, lặp lại
thí nghiệm 3 lần.
Bảng 2: Kết quả khảo sát tính tuyến
tính.
Nồng độ (àg/ml)
Diện tích pic (mAU.s)
5
472499
10
939110
20
1828049
30
2730267
40
3677890
50
4789210
60
nồng độ berberin chlorid và diện tích pic
với hệ số tương quan r ≈ 1.
4. Khảo sát độ đúng của phương pháp.
Tiến hành bằng phương pháp thêm
chuẩn vào mẫu trắng để thu được các
dung dịch mẫu tự tạo có nồng độ 20, 30,
40 µg/ml, mỗi nồng độ tiến hành trên 3 thí
nghiệm riêng biệt. Tiến hành định lượng
lại lượng chuẩn trong các mẫu trên, từ đó
tính toán được % thu hồi.
Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của
phương pháp.
Nồng độ
ban đầu
(àg/ml)
20,12
20,34
5586820
20,68
Phương trình hồi quy: y = 93990x - 26295.
Hệ số tương quan: r = 0,9995
29,82
Diện tích PIC
187606
2
187418
3
189298
1
275298
9
Diện tích pic (µAU.s)
Đường hồi quy tuyến tinh giữa diện tích pic của
Đường hồi quy
tuyếnchlorid
tính giữa
berberin
và diện
nồngtích
độ pic của
Berberin clorid và nồng độ
6000000
y = 93990x - 26295
5000000
R2 = 0.999
4000000
30,12
3000000
40,56
30,36
281596
3
284979
9
377560
1
2000000
40,90
1000000
373518
5
Nồng độ thu
hồi (àg/ml)
20,24
%
thu hồi
100,
2
20,22
99,3
20,42
98,4
29,57
98,7
30,24
30,60
100,
6
101,
2
40,45
40,02
99,6
100,
5
0
0
20
40
60
80
Nồng độ (µg/m l)
Hình 4: Đồ thị khảo sát sự tương quan
tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
pic berberin chlorid.
Trong khoảng nồng độ khảo sát có sự
tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa
79
40,23
371168
7
39,77
98,2
Trung bình
99,6
RSD (%)
1,07
Phương pháp có độ thu hồi berberin
chlorid từ 98,2 - 101,2% (nằm trong giới
hạn 98 -102%) với RSD là 1,07% (nằm
Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
trong giới hạn < 2%). Do đó, phương
pháp đạt yêu cầu về độ đúng.
Độ lặp lại của phương pháp được xác
định trên 6 mẫu thử khác nhau theo các
điều kiện sắc ký đã nêu.
5. Độ lặp lại.
Bảng 4: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp (n = 6).
Mẫu
Diện tích pic
Hàm lượng berberin
chlorid (mg)
Thử 1
Thử 2
Thử 3
Thử 4
Thử 5
Thử 6
3384720
3332455
3341579
3388796
3328205
3385202
15,12
14,89
14,93
15,14
14,87
15,12
Hàm lượng berberin chlorid trung bình = 15,01 (mg); RSD = 0,87
Hàm lượng berberin chlorid trong mẫu thử trung bình = 15,01 (mg), định lượng lặp
lại với n = 6 cho RSD% = 0,87% chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt.
6. Giới hạn phát hiện (LOD).
Pha loãng dần dung dịch chuẩn, tiêm vào hệ thống sắc ký. Tại nồng độ berberin
chlorid khoảng 0,02 µg/ml thì trên sắc ký đồ, pic của berberin chlorid thu được vẫn cân
đối, riêng biệt. Tỷ số S/N là 6. Như vậy, giá trị 0,02 µg/ml đáp ứng được yêu cầu là giới
186
35
hạn phát hiện của phương pháp.
3 .7 4 2
0 .0 0 0 2
213
V o lt s
1
0 .0 0 0 1
5 .1 1 0
1796
0 .0 0 0 0
B e r b e r in
- 0 .0 0 0 1
2
- 0 .0 0 0 2
0
1
2
3
4
5
6
M in u te s
Hình 6: Sắc ký đồ của berberin chlorid tại LOD.
7. Kết quả định lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105”.
80
7
nguon tai.lieu . vn
Nghiên cứu định lượng BERBERIN CHLORID trong
“viên nén đại tràng 105” bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hồ Cảnh Hậu*; Hoàng Văn Thêm*; Nguyễn Thị Lan Hương*
Nguyễn Văn Thuận**; Nguyễn Cẩm Vân***; Nguyễn Tuấn Quang***
Tóm tắt
Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng berbein chlorid trong “Viên nén đại tràng 105”
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng và phương pháp: “Viên nén đại tràng 105”
do Bệnh viện Quân y 105 sản xuất được tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC với cột: RP18
(150 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng 345 nm, tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, pha
động là hỗn hợp methanol-acetonitril-dung dịch axít phosphoric 0,1% (5:3:3). Kết quả: phương
pháp xây dựng đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính, độ đúng và độ lặp lại.
Giới hạn phát hiện của berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” là 0,02 µg/ml. Áp dụng
xác định hàm lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” là 37,65 ± 1,02 (mg/viên).
Kết luận: phương pháp xây dựng đảm bảo yêu cầu và có thể được dùng để định lượng
berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105”.
* Từ khóa: Berberin chlorid; “Viên nén đại tràng 105”; Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Quantitative Study on Berberin Chloride in “Vien nen dai trang 105”
by High Performace Liquid Chromatography
Summary
Objective: To establish the quantitative methodology measuring the amount of berberin
chloride in “Vien nen dai trang 105” by high performance liquid chromatography (HPLC). Subjects
and methodology: “Vien nen dai trang 105” produced by 105 Hospital is analysed using the
HPLC system with a column of RP18 (150 x 4.6 mm, 5 µm), the wave length of 345 nm, the flow
rate water of 1.2 ml/min, injection volume: 20 µl, a mixture of methanol- acetonitrile-acide
phosphoric 0.1% with ratio (5:3:3) as mobile phase. Results: This methodology ensures the
specificity, compatibility, linearity, preciseness and repeatability. The limitation of berberin
chlorid in “Vien nen dai trang 105” found is 0.02 µg/ml. As a result, the amount of berberin
chlorid measured in “Vien nen dai trang 105” is 37.65 ± 1.02 (mg/pill). Conclusion: The methodology
meets all the requirements and can be used to measure the amount of berberin chlorid in “Vien
nen dai trang 105”
* Key words: Berberin chlorid; “Vien nen dai trang 105”; High performance liquid chromatography.
* Bệnh viện Quân y 105
** Bệnh viện Quân y 7
*** Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (drquang2000@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 24/12/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 12/01/2015
Ngày bài báo được đăng: 26/01/2015
75
Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
Đặt vấn đề
“Viên nén đại tràng 105” là đề tài đang
được Bệnh viện Quân y 105, Tổng cục
Hậu cần nghiên cứu phát triển từ bài
thuốc y học cổ truyền để điều trị viêm đại
tràng cấp và mạn tính rất có hiệu quả.
Thành phần của “Viên nén đại tràng 105”
có sự kết hợp của các dược liệu và hoạt
chất từ dược liệu như Hoàng đằng, cao Bồ
giác, berberin chlorid…, trong đó, berberin
chlorid chiếm tỷ lệ khá cao và được coi là
thành phần chính của dược phẩm. Berberin
chlorid được chiết xuất từ các dược liệu
như Vàng đắng, Hoàng liên,… [1, 2, 5],
có tác dụng ức chế đối với vi khuẩn
Shigella, Bacillus cholerae, Staphylococus
aureus…, tác dụng chống vi khuẩn tả Vibrio
cholerae, tác dụng với lỵ amip. Đặc biệt,
dùng berberin điều trị nhiễm khuẩn đường
ruột không ảnh hưởng đến sự phát triển
của hệ vi khuẩn có ích ở ruột [3, 9].
Việc nghiên cứu định lượng berberin
chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” góp
phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản
phẩm, cũng như xây dựng công thức bào
chế. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu định lượng berberin trong “Viên nén
đại tràng 105” bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao.
Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp
nghiên cứu
1. Nguyên liệu và thiết bị.
- “Viên nén đại tràng 105” được sản
xuất tại Bệnh viện Quân y 105, Tổng cục
Hậu cần.
- Hóa chất: acetonitril, methanol, axít
phosphoric 0,1%, nước cất đạt tiêu chuẩn
cho HPLC; chất chuẩn berberin chlorid
77
(Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương,
99%); các hóa chất dung môi khác đạt
tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Shimadzu 10 Avp (Nhật Bản) gồm hệ bơm
4 kênh dung môi, autosampler, detector UV,
cột RP18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) và bảo vệ
cột cùng loại.
- Dụng cụ: cân phân tích Sartorius (độ
chính xác 0,1 mg) và các dụng cụ thí
nghiệm khác.
2. Phương pháp nghiên cứu.
- Điều kiện sắc ký:
+ Cột: RP18 (150 x 4,6 mm, 5 µm).
+ Bước sóng phát hiện: 345 nm.
+ Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.
+ Thể tích tiêm: 20 µl.
+ Pha động: hỗn hợp methanol-acetonitrildung dịch axít phosphoric 0,1% (5:3:3),
thêm vào mỗi 100 ml hỗn hợp 0,1 g natri
lauryl sulfat (TT) [4, 8, 9].
- Phương pháp xử lý mẫu:
+ Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn được
pha bằng cách hòa tan berberin chlorid
chuẩn trong pha động để có nồng độ 30
µg/ml, lọc qua màng 0,45 µm thu được
dung dịch thử.
+ Mẫu thử: cân chính lượng bột viên
tương đương khoảng 15 mg berberin
chlorid vào bình định mức 50 ml, hòa tan
và pha loãng vừa đủ bằng pha động
(dung dịch A). Hút chính xác 3 ml dung
dịch A, pha loãng vừa đủ thành 25 ml với
pha động, lọc qua màng 0,45 µm. Dịch
lọc dùng để tiêm mẫu.
+ Mẫu trắng: pha động, lọc qua màng
lọc 0,45 µm.
Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
- Thẩm định phương pháp: với các tiêu
chí về tính đặc hiệu, tính tương thích, tính
tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn
phát hiện [4, 7].
0.4
0.3
5.170
1. Tính đặc hiệu.
Volts
0.2
KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn
0.0
1
Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn,
mẫu thử và mẫu trắng. Kết quả trên sắc
ký đồ (SKĐ) cho thấy: mẫu thử cho pic có
thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu
của mẫu chuẩn berberin chlorid; pic của
berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng
105” ở mẫu thử rõ ràng, cân đối, tách
hoàn toàn khỏi pic tạp. Đồng thời, mẫu
trắng không thấy xuất hiện pic có thời
gian lưu tương ứng với mẫu chuẩn và
mẫu thử (hình 2, hình 3 và hình 4).
Berberin
0.1
0
1
2
3
4
5
6
7
Minutes
Hình 3: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của
mẫu thử.
2. Tính tương thích.
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch
mẫu chuẩn berberin chlorid có nồng độ
khoảng 30 µg/ml vào hệ thống sắc ký.
Bảng 1: Tính tương thích của hệ thống
sắc ký.
0.0100
0.0075
stt
Thêi gian l-u
(phót)
DiÖn tÝch pic
1
5,175
2498965
2
5,172
2515328
3
5,173
2516250
4
5,172
2515583
5
5,170
2516382
6
5,167
2516104
TB
5,172
2513102
SD
0,003
6937,51
RSD%
0,05
0,28
Volts
0.0050
(Berberin)
0.0025
(µAU*s)
0.0000
0
1
2
3
4
5
6
7
Minutes
Hình 1: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của
mẫu trắng.
0.3
Volts
0.2
Berberin
5.172
0.1
1
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
Minutes
Hình 2: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của
mẫu chuẩn berberin chlorid.
78
Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian
lưu và diện tích pic berberin chlorid lần
lượt là 0,05% và 0,28%. Như vậy, phương
pháp phân tích hoàn toàn phù hợp với hệ
thống sắc ký.
Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
3. Tính tuyến tính.
Pha một dãy các dung dịch chuẩn trong
pha động có nồng độ berberin chlorid từ
5 - 60 µg/ml. Tiến hành sắc ký các dung
dịch theo điều kiện sắc ký đã nêu, lặp lại
thí nghiệm 3 lần.
Bảng 2: Kết quả khảo sát tính tuyến
tính.
Nồng độ (àg/ml)
Diện tích pic (mAU.s)
5
472499
10
939110
20
1828049
30
2730267
40
3677890
50
4789210
60
nồng độ berberin chlorid và diện tích pic
với hệ số tương quan r ≈ 1.
4. Khảo sát độ đúng của phương pháp.
Tiến hành bằng phương pháp thêm
chuẩn vào mẫu trắng để thu được các
dung dịch mẫu tự tạo có nồng độ 20, 30,
40 µg/ml, mỗi nồng độ tiến hành trên 3 thí
nghiệm riêng biệt. Tiến hành định lượng
lại lượng chuẩn trong các mẫu trên, từ đó
tính toán được % thu hồi.
Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của
phương pháp.
Nồng độ
ban đầu
(àg/ml)
20,12
20,34
5586820
20,68
Phương trình hồi quy: y = 93990x - 26295.
Hệ số tương quan: r = 0,9995
29,82
Diện tích PIC
187606
2
187418
3
189298
1
275298
9
Diện tích pic (µAU.s)
Đường hồi quy tuyến tinh giữa diện tích pic của
Đường hồi quy
tuyếnchlorid
tính giữa
berberin
và diện
nồngtích
độ pic của
Berberin clorid và nồng độ
6000000
y = 93990x - 26295
5000000
R2 = 0.999
4000000
30,12
3000000
40,56
30,36
281596
3
284979
9
377560
1
2000000
40,90
1000000
373518
5
Nồng độ thu
hồi (àg/ml)
20,24
%
thu hồi
100,
2
20,22
99,3
20,42
98,4
29,57
98,7
30,24
30,60
100,
6
101,
2
40,45
40,02
99,6
100,
5
0
0
20
40
60
80
Nồng độ (µg/m l)
Hình 4: Đồ thị khảo sát sự tương quan
tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
pic berberin chlorid.
Trong khoảng nồng độ khảo sát có sự
tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa
79
40,23
371168
7
39,77
98,2
Trung bình
99,6
RSD (%)
1,07
Phương pháp có độ thu hồi berberin
chlorid từ 98,2 - 101,2% (nằm trong giới
hạn 98 -102%) với RSD là 1,07% (nằm
Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
trong giới hạn < 2%). Do đó, phương
pháp đạt yêu cầu về độ đúng.
Độ lặp lại của phương pháp được xác
định trên 6 mẫu thử khác nhau theo các
điều kiện sắc ký đã nêu.
5. Độ lặp lại.
Bảng 4: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp (n = 6).
Mẫu
Diện tích pic
Hàm lượng berberin
chlorid (mg)
Thử 1
Thử 2
Thử 3
Thử 4
Thử 5
Thử 6
3384720
3332455
3341579
3388796
3328205
3385202
15,12
14,89
14,93
15,14
14,87
15,12
Hàm lượng berberin chlorid trung bình = 15,01 (mg); RSD = 0,87
Hàm lượng berberin chlorid trong mẫu thử trung bình = 15,01 (mg), định lượng lặp
lại với n = 6 cho RSD% = 0,87% chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt.
6. Giới hạn phát hiện (LOD).
Pha loãng dần dung dịch chuẩn, tiêm vào hệ thống sắc ký. Tại nồng độ berberin
chlorid khoảng 0,02 µg/ml thì trên sắc ký đồ, pic của berberin chlorid thu được vẫn cân
đối, riêng biệt. Tỷ số S/N là 6. Như vậy, giá trị 0,02 µg/ml đáp ứng được yêu cầu là giới
186
35
hạn phát hiện của phương pháp.
3 .7 4 2
0 .0 0 0 2
213
V o lt s
1
0 .0 0 0 1
5 .1 1 0
1796
0 .0 0 0 0
B e r b e r in
- 0 .0 0 0 1
2
- 0 .0 0 0 2
0
1
2
3
4
5
6
M in u te s
Hình 6: Sắc ký đồ của berberin chlorid tại LOD.
7. Kết quả định lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105”.
80
7