Xem mẫu
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN VÀ GÂY MIỄN DỊCH TẠO KHÁNG
HUYẾT THANH NGỰA ĐƠN ĐẶC HIỆU KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Naja
siamensis) TẠI VIỆT NAM
Lê Khắc Quyến*; Trịnh Xuân Kiếm**; Hoàng Anh Tuấn***
TÓM TẮT
Mục tiêu: nghiên cứu chế tạo kháng nguyên (KN) nọc rắn Hổ mèo (RHM) đơn giá và gây
miễn dịch cho ngựa tạo kháng thể (KT) đơn đặc hiệu đóng vai trò quyết định trong sản xuất
huyết thanh kháng nọc (HTKN) RHM. Phương pháp: chế tạo KN nọc RHM từ nọc tổng số theo
phương pháp giảm độc lực, gây miễn dịch cho ngựa theo phương pháp tiêm dưới da nhiều mũi
liều thấp nhắc lại nhiều lần. Kết quả: tạo được 300 ml KN chuẩn, xác lập lịch trình gây miễn
dịch thành công cho ngựa và thu được huyết tương có KT đặc hiệu làm nguyên liệu chế tạo
HTKN RHM đơn đặc hiệu. Kết luận: đã tạo được KN chuẩn và gây miễn dịch thành công cho
ngựa thu được huyết tương có KT đặc hiệu.
* Từ khóa: Rắn Hổ mèo (Naja siamensis); Kháng nguyên nọc rắn Hổ mèo; Huyết thanh kháng
nọc rắn Hổ mèo.
Study of Antigen Production and Immunization Created Horse
Monospecific Antiserum Against Indochinese Spitting Cobra (Naja
siamensis) Venom in Vietnam
Summary
Objectives: To prepare Naja siamensis (NS) monovalent antigen and to immunize horse for the
production of NS monospecific antibody. Methods: NS monovalent venom antigen was prepared
from whole venom by detoxification method; horse hyper-immunization was done by subcutaneous
multiple site and repeated low dose injections. Results: 300 ml of standard antigen was prepared,
immunization for horse against NS venom and collected hyperimmune was established
succesfully. Horse plasma containing specific antibody has been obtained as a material for NS
monospecific antivenom production. Conclusion: NS standard antigen has been succesfully
prepared and used for immunization of horse to produce specific antibody in horse plasma.
* Key words: Naja siamensis; Naja siamensis antigen; Naja siamensis antivenom.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Rắn độc cắn vẫn là mối hiểm họa cho
các quốc gia đang phát triển vùng nhiệt
đới ở châu Phi, châu Á và Mỹ Latinh, trong
đó có Việt Nam. Năm 2008, Tổ chức Y tế
Thế giới (WHO) xếp bệnh lý rắn độc cắn
vào các bệnh lý “Nhiệt đới bị lãng quên” [8].
* Bệnh viện FV
** Viện Nghiên cứu Công nghệ Phát triển Nông thôn
*** Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Lª Kh¾c QuyÕn (lekhacquyen@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/01/2015
Ngày bài báo được đăng: 29/01/2015
43
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
Việt Nam là quốc gia đầu tiên trên thế giới
sản xuất và điều trị HTKN rắn Hổ từ nghiên
cứu của A. Calmette tại Viện Pasteur Sài
Gòn năm 1894 [5]. Hơn 100 năm sau,
Việt Nam vẫn chưa tự sản xuất được
HTKN rắn. Ước tính có đến 30.000
trường hợp bị rắn cắn mỗi năm. Từ năm
1990, Trịnh Xuân Kiếm và CS đã nghiên
cứu phát triển kỹ thuật sản xuất HTKN
rắn [2, 4]. Hiện nay chúng ta có được các
loại HTKN rắn Chàm quạp, Hổ đất, rắn
Lục, Cạp nia và Hổ chúa. Tỷ lệ tử vong
đã giảm từ 19,5% lúc chưa có huyết thanh
xuống còn 3,1% sau điều trị HTKN đơn
đặc hiệu [4].
Rắn Hổ mèo thường gây tai nạn cho
bệnh nhân (BN) sinh sống ở vùng Đông
Nam Bộ, nhiều trường hợp tử vong hoặc
để lại thương tật nặng nề như cắt cụt chi
hoặc mất da rộng gây sẹo co rút mất khả
năng lao động. Việc điều trị hiện nay chủ
yếu là điều trị triệu chứng do chưa có
HTKN đặc hiệu [6]. Nghiên cứu sản xuất
HTKN RHM là cần thiết và yêu cầu cấp
bách trong vấn đề cứu chữa người bị
RHM cắn. Do đó, yêu cầu đặt ra là chế
tạo được KN, xác lập quy trình lịch gây
miễn dịch cho động vật lớn như ngựa để
tạo huyết thanh ngựa có KT kháng nọc
RHM với hiệu giá cao, làm nguyên liệu
tiến tới sản xuất HTKN RHM đầu tiên tại
Việt Nam.
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
- Rắn Hổ mèo: 50 cá thể thu nhận
trong điều kiện tự nhiên tại khu vực miền
Đông Nam Bộ, kích thước từ 0,2 - 1,5 m,
44
nặng từ 100 g - 2,5 kg, màu vàng nhạt
oliu hoặc màu vàng nhạt trắng. Rắn có
thể bạnh mang và phun nọc độc xa tới 2
m. Mặt lưng cổ phình mang có 2 vòng
tròn nối với nhau theo hình chữ U hoặc V:
2 mắt kính nhưng không có gọng kính,
phía mang vùng bụng có 2 đốm đen và
1 - 2 khoang đen.
Hình 1: Rắn Hổ mèo (Naja siamensis).
- Ngựa gây miễn dịch: 02 ngựa đực 5
tuổi khỏe mạnh, trọng lượng 300 kg, dùng
để gây miễn dịch.
2. Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu.
- Dung dịch PBS 10%, glutaraldehyd 20%,
methanol, thạch agarose, thuốc nhuộm
coomasie blue 0,025%, axit acetic, máy
đo pH, bộ lọc vô khuẩn, lọ vô khuẩn, tủ
ấm, phiến kính, nước cất vô trùng, kim
tiêm vô trùng.
- Môi trường cấy vi khuẩn Sabouraud,
thioglycolat và nấm.
- Tá chất Freund hoàn chỉnh (Complete
Freund Adjuvant - CFA) và tá chất Freund
không hoàn chỉnh (Incomplete Freund
Adjuvant - IFA) (Hãng Sigma, Mỹ).
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
3. Phƣơng pháp nghiên cứu.
Nghiên cứu thực nghiệm trong phòng
thí nghiệm và trên động vật.
* Thu nhận nọc rắn:
Thu nhận nọc RHM theo hướng dẫn
của Tổ chức Y tế Thế giới bằng phương
pháp kích thích cơ học vào hai bên tuyến
nọc để rắn nhả nọc vào đĩa petri vô trùng.
Trộn đều hỗn hợp nọc của 50 cá thể rắn
để bảo đảm tính đại diện loài và địa
phương phân bố của rắn [8]. Ly tâm bỏ
cặn hỗn hợp nọc, sau đó bảo quản ở
-20ºC liên tục đến khi sử dụng.
* Chế tạo KN:
Chế tạo KN nọc RHM đơn giá theo kỹ
thuật khử nọc rắn độc bằng dung dịch
glutaraldehyd, sau đó dùng phương pháp
nhiệt để tạo KN đặc hiệu [8]. Kiểm định
tính vô trùng KN nọc RHM bằng các xét
nghiệm vi sinh thường quy.
* Gây miễn dịch cho ngựa:
Được thực hiện theo kinh nghiệm trong
sản xuất HTKN rắn Hổ đất của Trịnh
Xuân Kiếm và CS (1997) [4] và hướng
dẫn của WHO (2010) [8]. Ngựa được gây
miễn dịch bằng cách tiêm dưới da lặp lại
nhiều lần liều thấp KN nọc RHM đơn giá
phối trộn với tá chất miễn dịch Freund
hoàn chỉnh và không hoàn chỉnh, tăng
dần theo mỗi tháng. Xác định KT đặc hiệu
kháng nọc RHM trong máu ngựa gây
miễn dịch bằng kỹ thuật khuếch tán miễn
dịch đơn [1].
Bảng 1: Lịch trình miễn dịch, liều lượng KN phối hợp tá chất.
Liều KN (ml)
CFA (ml)
IFA (ml)
1
1
0
3
3
0
5
5
0
5
0
5
5
0
5
5
0
5
5
0
5
5
0
5
5
0
5
Tổng số (KN + tá chất) (ml)
2
6
10
10
10
10
10
10
10
* Địa điểm nghiên cứu:
- Bộ môn Độc học và Phóng xạ Quân sự,
Học viện Quân y.
- Trung tâm Nghiên cứu sản xuất thuốc,
Học viện Quân y (Hoà Lạc).
- Bộ môn - Khoa Huyết học - Truyền máu,
Bệnh viện Quân y 103.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Kết quả thu nhận nọc rắn và chế
tạo KN.
Pha 30 gr nọc RHM thu nhận từ 50 cá
thể rắn trong dung dịch PBS 10% tạo
thành 300 ml dung dịch nọc RHM. Khử độc
45
dung dịch nọc này bằng glutheraldehyd
20%, sau đó ủ nhiệt, ly tâm, bỏ cặn, lọc
vô trùng, thu được 270 ml sản phẩm. Sau
khi lấy mẫu cấy khuẩn kiểm tra độ vô
khuẩn, chia nhỏ 100 ml sản phẩm sau
lọc, đóng lọ nắp cao su với thể tích 1 ml,
3 ml và 5 ml. Sản phẩm được đánh số
thứ tự, dán nhãn, ghi ngày sản xuất, tên
KN, điều kiện và thời gian bảo quản. Bảo
quản thành phẩm KN đóng lọ và sản
phẩm còn lại trong tủ lạnh -20ºC liên tục
đến khi sử dụng.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
Hình 2: KN nọc RHM.
Kết quả cấy khuẩn và nấm trong các môi trường Sabouraund, thioglycolat theo dõi
trong 7 ngày không thấy vi khuẩn và nấm mọc, cho thấy sản phẩm KN nọc RHM đạt
tiêu chuẩn vô khuẩn.
2. Kết quả gây miễn dịch ngựa.
Sau khi tiêm KN + CFA với tỷ lệ 1:1 (V/V), lần 1 đến lần 3 thấy ngựa mệt mỏi, yếu,
nằm, bỏ ăn. Tại chỗ có biểu hiện viêm, sưng tấy tạo áp xe. Tiêm lần 2, 3, tại chỗ xuất
hiện vết loét, chảy mủ, dịch. Tiêm KN từ lần thứ 4 đến lần thứ 9, ngựa vận động và ăn
uống bình thường, tại chỗ vẫn bị viêm, loét và chảy mủ.
Trong tất cả các lần tiêm gây miễn dịch, không thấy ngựa có biểu hiện rối loạn đông
máu toàn thân hoặc suy hô hấp, nhưng có tổn thương tại chỗ tiêm.
Bảng 2: Theo dõi ngựa sau mỗi lần miễn dịch.
L Ç n
m iÔ n
d Þ c h Vận động
N g ù
1 a
Toàn thân
Hô hấp
Tiêu hóa
Tại chỗ
Toàn thân
Vận động
Hô hấp
Tiêu hóa
Tại
chỗ
1
Yếu
BT
Bỏ ăn
Viêm
Yếu
BT
Bỏ ăn
Viêm
2
Yếu
BT
Bỏ ăn
Loét
Yếu
BT
Bỏ ăn
Loét
3
Yếu
BT
Bỏ ăn
Loét
Yếu
BT
Bỏ ăn
Viêm
4
BT
BT
BT
Loét
Yếu
BT
BT
Viêm
5
BT
BT
BT
Loét
BT
BT
BT
Loét
6
BT
BT
BT
Loét
BT
BT
BT
Loét
7
BT
BT
BT
Loét
BT
BT
BT
Loét
8
BT
BT
BT
Loét
BT
BT
BT
Loét
9
BT
BT
BT
Loét
BT
BT
BT
Loét
(BT: bình thường).
46
N g ù
2 a
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
3. Kết quả xác định KT đặc hiệu với
KN nọc RHM trong huyết thanh ngựa.
ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống
[6]. Sinh hóa học về nọc rắn Hổ đã được
Trong quá trình gây miễn dịch theo lịch
nghiên cứu khá kỹ trên thế giới và trong
trình, theo dõi khả năng sinh KT đặc hiệu với
nước [9]. Sự khác biệt loài rắn (Hổ đất, Hổ
KN nọc RHM bằng kỹ thuật Ouchterlony cho
mèo và Hổ mang bành) về phân bố địa lý
thấy đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với KN nọc
rắn rất khả quan. KT đặc hiệu xuất hiện sau
2 lần gây miễn dịch và những lần gây miễn
dịch nhắc lại tiếp theo.
cũng như khác biệt về trình tự sắp xếp
aminoaxit trên mtADN đã được Wüster và
Thorpe chứng minh [10]. Vì vậy, nhu cầu cần
thiết cấp bách chế tạo HTKN RHM phục vụ
điều trị trên lâm sàng. Nghiên cứu này đã
chế tạo thành công KN nọc RHM theo
hướng dẫn của WHO. Sản phẩm KN nọc
RHM tạo ra đảm bảo tiêu chuẩn vô khuẩn và
sinh KT tốt trên ngựa, đảm bảo hiệu lực và
an toàn theo các tiêu chuẩn yêu cầu [8].
- Cùng với việc chế tạo KN nọc RHM,
việc gây miễn dịch cho ngựa tạo huyết
thanh ngựa có hiệu giá KT đặc hiệu cao,
làm nguyên liệu sản xuất HTKN là khâu rất
Hình 3: Vết tủa KN nọc RHM và KT từ huyết
quan trọng. Việc tính toán liều lượng KN, tá
thanh ngựa đã gây miễn dịch
chất và khoảng cách giữa hai lần tiêm sao
trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony).
cho hợp lý, đảm bảo sinh KT tốt mà không
gây nguy hiểm cho ngựa, giảm chi phí trong
BÀN LUẬN
- Rắn Hổ mèo với đặc tính và hình dạng
khác biệt: màu vàng nhạt oliu, hai mắt kính
không gọng kính, đặc biệt có khả năng phun
nọc rắn rất xa (> 2 m) [6, 9]. Các triệu chứng
nghiên cứu. Đây là lần đầu tiên xác định lịch
miễn dịch cho ngựa đối với KN nọc RHM
được áp dụng tại Việt Nam và trên thế giới.
Lịch trình gây miễn dịch dựa trên kinh
nghiệm trong sản xuất HTKN rắn Hổ đất [4]
và hướng dẫn của WHO (2010) [8]. Tuy
lâm sàng trên BN bị loài này cắn rất khác
nhiên, nọc RHM gây hoại tử tại chỗ và độc
biệt với BN bị rắn Hổ đất cắn: không có hội
tố toàn thân, nhất là trên tim mạch rất nặng
chứng nhiễm độc thần kinh, nhưng có các
nề [3]. Vì vậy, nghiên cứu đề ra quy trình
hội chứng nhiễm độc tế bào và rối loạn đông
khẳng định lịch miễn dịch, liều lượng KN, tá
cầm máu nhẹ. BN không đáp ứng điều trị
chất phù hợp, ngựa đáp ứng sinh KT tốt và
với huyết thanh kháng nọc rắn Hổ đất làm
an toàn. Trong đó:
tăng tỷ lệ tử vong, hoặc để lại di chứng
nặng nề,
47
+ Thời gian miễn dịch cần 8 - 9 tháng để
có KT tốt.
nguon tai.lieu . vn
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN VÀ GÂY MIỄN DỊCH TẠO KHÁNG
HUYẾT THANH NGỰA ĐƠN ĐẶC HIỆU KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Naja
siamensis) TẠI VIỆT NAM
Lê Khắc Quyến*; Trịnh Xuân Kiếm**; Hoàng Anh Tuấn***
TÓM TẮT
Mục tiêu: nghiên cứu chế tạo kháng nguyên (KN) nọc rắn Hổ mèo (RHM) đơn giá và gây
miễn dịch cho ngựa tạo kháng thể (KT) đơn đặc hiệu đóng vai trò quyết định trong sản xuất
huyết thanh kháng nọc (HTKN) RHM. Phương pháp: chế tạo KN nọc RHM từ nọc tổng số theo
phương pháp giảm độc lực, gây miễn dịch cho ngựa theo phương pháp tiêm dưới da nhiều mũi
liều thấp nhắc lại nhiều lần. Kết quả: tạo được 300 ml KN chuẩn, xác lập lịch trình gây miễn
dịch thành công cho ngựa và thu được huyết tương có KT đặc hiệu làm nguyên liệu chế tạo
HTKN RHM đơn đặc hiệu. Kết luận: đã tạo được KN chuẩn và gây miễn dịch thành công cho
ngựa thu được huyết tương có KT đặc hiệu.
* Từ khóa: Rắn Hổ mèo (Naja siamensis); Kháng nguyên nọc rắn Hổ mèo; Huyết thanh kháng
nọc rắn Hổ mèo.
Study of Antigen Production and Immunization Created Horse
Monospecific Antiserum Against Indochinese Spitting Cobra (Naja
siamensis) Venom in Vietnam
Summary
Objectives: To prepare Naja siamensis (NS) monovalent antigen and to immunize horse for the
production of NS monospecific antibody. Methods: NS monovalent venom antigen was prepared
from whole venom by detoxification method; horse hyper-immunization was done by subcutaneous
multiple site and repeated low dose injections. Results: 300 ml of standard antigen was prepared,
immunization for horse against NS venom and collected hyperimmune was established
succesfully. Horse plasma containing specific antibody has been obtained as a material for NS
monospecific antivenom production. Conclusion: NS standard antigen has been succesfully
prepared and used for immunization of horse to produce specific antibody in horse plasma.
* Key words: Naja siamensis; Naja siamensis antigen; Naja siamensis antivenom.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Rắn độc cắn vẫn là mối hiểm họa cho
các quốc gia đang phát triển vùng nhiệt
đới ở châu Phi, châu Á và Mỹ Latinh, trong
đó có Việt Nam. Năm 2008, Tổ chức Y tế
Thế giới (WHO) xếp bệnh lý rắn độc cắn
vào các bệnh lý “Nhiệt đới bị lãng quên” [8].
* Bệnh viện FV
** Viện Nghiên cứu Công nghệ Phát triển Nông thôn
*** Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Lª Kh¾c QuyÕn (lekhacquyen@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/01/2015
Ngày bài báo được đăng: 29/01/2015
43
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
Việt Nam là quốc gia đầu tiên trên thế giới
sản xuất và điều trị HTKN rắn Hổ từ nghiên
cứu của A. Calmette tại Viện Pasteur Sài
Gòn năm 1894 [5]. Hơn 100 năm sau,
Việt Nam vẫn chưa tự sản xuất được
HTKN rắn. Ước tính có đến 30.000
trường hợp bị rắn cắn mỗi năm. Từ năm
1990, Trịnh Xuân Kiếm và CS đã nghiên
cứu phát triển kỹ thuật sản xuất HTKN
rắn [2, 4]. Hiện nay chúng ta có được các
loại HTKN rắn Chàm quạp, Hổ đất, rắn
Lục, Cạp nia và Hổ chúa. Tỷ lệ tử vong
đã giảm từ 19,5% lúc chưa có huyết thanh
xuống còn 3,1% sau điều trị HTKN đơn
đặc hiệu [4].
Rắn Hổ mèo thường gây tai nạn cho
bệnh nhân (BN) sinh sống ở vùng Đông
Nam Bộ, nhiều trường hợp tử vong hoặc
để lại thương tật nặng nề như cắt cụt chi
hoặc mất da rộng gây sẹo co rút mất khả
năng lao động. Việc điều trị hiện nay chủ
yếu là điều trị triệu chứng do chưa có
HTKN đặc hiệu [6]. Nghiên cứu sản xuất
HTKN RHM là cần thiết và yêu cầu cấp
bách trong vấn đề cứu chữa người bị
RHM cắn. Do đó, yêu cầu đặt ra là chế
tạo được KN, xác lập quy trình lịch gây
miễn dịch cho động vật lớn như ngựa để
tạo huyết thanh ngựa có KT kháng nọc
RHM với hiệu giá cao, làm nguyên liệu
tiến tới sản xuất HTKN RHM đầu tiên tại
Việt Nam.
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
- Rắn Hổ mèo: 50 cá thể thu nhận
trong điều kiện tự nhiên tại khu vực miền
Đông Nam Bộ, kích thước từ 0,2 - 1,5 m,
44
nặng từ 100 g - 2,5 kg, màu vàng nhạt
oliu hoặc màu vàng nhạt trắng. Rắn có
thể bạnh mang và phun nọc độc xa tới 2
m. Mặt lưng cổ phình mang có 2 vòng
tròn nối với nhau theo hình chữ U hoặc V:
2 mắt kính nhưng không có gọng kính,
phía mang vùng bụng có 2 đốm đen và
1 - 2 khoang đen.
Hình 1: Rắn Hổ mèo (Naja siamensis).
- Ngựa gây miễn dịch: 02 ngựa đực 5
tuổi khỏe mạnh, trọng lượng 300 kg, dùng
để gây miễn dịch.
2. Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu.
- Dung dịch PBS 10%, glutaraldehyd 20%,
methanol, thạch agarose, thuốc nhuộm
coomasie blue 0,025%, axit acetic, máy
đo pH, bộ lọc vô khuẩn, lọ vô khuẩn, tủ
ấm, phiến kính, nước cất vô trùng, kim
tiêm vô trùng.
- Môi trường cấy vi khuẩn Sabouraud,
thioglycolat và nấm.
- Tá chất Freund hoàn chỉnh (Complete
Freund Adjuvant - CFA) và tá chất Freund
không hoàn chỉnh (Incomplete Freund
Adjuvant - IFA) (Hãng Sigma, Mỹ).
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
3. Phƣơng pháp nghiên cứu.
Nghiên cứu thực nghiệm trong phòng
thí nghiệm và trên động vật.
* Thu nhận nọc rắn:
Thu nhận nọc RHM theo hướng dẫn
của Tổ chức Y tế Thế giới bằng phương
pháp kích thích cơ học vào hai bên tuyến
nọc để rắn nhả nọc vào đĩa petri vô trùng.
Trộn đều hỗn hợp nọc của 50 cá thể rắn
để bảo đảm tính đại diện loài và địa
phương phân bố của rắn [8]. Ly tâm bỏ
cặn hỗn hợp nọc, sau đó bảo quản ở
-20ºC liên tục đến khi sử dụng.
* Chế tạo KN:
Chế tạo KN nọc RHM đơn giá theo kỹ
thuật khử nọc rắn độc bằng dung dịch
glutaraldehyd, sau đó dùng phương pháp
nhiệt để tạo KN đặc hiệu [8]. Kiểm định
tính vô trùng KN nọc RHM bằng các xét
nghiệm vi sinh thường quy.
* Gây miễn dịch cho ngựa:
Được thực hiện theo kinh nghiệm trong
sản xuất HTKN rắn Hổ đất của Trịnh
Xuân Kiếm và CS (1997) [4] và hướng
dẫn của WHO (2010) [8]. Ngựa được gây
miễn dịch bằng cách tiêm dưới da lặp lại
nhiều lần liều thấp KN nọc RHM đơn giá
phối trộn với tá chất miễn dịch Freund
hoàn chỉnh và không hoàn chỉnh, tăng
dần theo mỗi tháng. Xác định KT đặc hiệu
kháng nọc RHM trong máu ngựa gây
miễn dịch bằng kỹ thuật khuếch tán miễn
dịch đơn [1].
Bảng 1: Lịch trình miễn dịch, liều lượng KN phối hợp tá chất.
Liều KN (ml)
CFA (ml)
IFA (ml)
1
1
0
3
3
0
5
5
0
5
0
5
5
0
5
5
0
5
5
0
5
5
0
5
5
0
5
Tổng số (KN + tá chất) (ml)
2
6
10
10
10
10
10
10
10
* Địa điểm nghiên cứu:
- Bộ môn Độc học và Phóng xạ Quân sự,
Học viện Quân y.
- Trung tâm Nghiên cứu sản xuất thuốc,
Học viện Quân y (Hoà Lạc).
- Bộ môn - Khoa Huyết học - Truyền máu,
Bệnh viện Quân y 103.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Kết quả thu nhận nọc rắn và chế
tạo KN.
Pha 30 gr nọc RHM thu nhận từ 50 cá
thể rắn trong dung dịch PBS 10% tạo
thành 300 ml dung dịch nọc RHM. Khử độc
45
dung dịch nọc này bằng glutheraldehyd
20%, sau đó ủ nhiệt, ly tâm, bỏ cặn, lọc
vô trùng, thu được 270 ml sản phẩm. Sau
khi lấy mẫu cấy khuẩn kiểm tra độ vô
khuẩn, chia nhỏ 100 ml sản phẩm sau
lọc, đóng lọ nắp cao su với thể tích 1 ml,
3 ml và 5 ml. Sản phẩm được đánh số
thứ tự, dán nhãn, ghi ngày sản xuất, tên
KN, điều kiện và thời gian bảo quản. Bảo
quản thành phẩm KN đóng lọ và sản
phẩm còn lại trong tủ lạnh -20ºC liên tục
đến khi sử dụng.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
Hình 2: KN nọc RHM.
Kết quả cấy khuẩn và nấm trong các môi trường Sabouraund, thioglycolat theo dõi
trong 7 ngày không thấy vi khuẩn và nấm mọc, cho thấy sản phẩm KN nọc RHM đạt
tiêu chuẩn vô khuẩn.
2. Kết quả gây miễn dịch ngựa.
Sau khi tiêm KN + CFA với tỷ lệ 1:1 (V/V), lần 1 đến lần 3 thấy ngựa mệt mỏi, yếu,
nằm, bỏ ăn. Tại chỗ có biểu hiện viêm, sưng tấy tạo áp xe. Tiêm lần 2, 3, tại chỗ xuất
hiện vết loét, chảy mủ, dịch. Tiêm KN từ lần thứ 4 đến lần thứ 9, ngựa vận động và ăn
uống bình thường, tại chỗ vẫn bị viêm, loét và chảy mủ.
Trong tất cả các lần tiêm gây miễn dịch, không thấy ngựa có biểu hiện rối loạn đông
máu toàn thân hoặc suy hô hấp, nhưng có tổn thương tại chỗ tiêm.
Bảng 2: Theo dõi ngựa sau mỗi lần miễn dịch.
L Ç n
m iÔ n
d Þ c h Vận động
N g ù
1 a
Toàn thân
Hô hấp
Tiêu hóa
Tại chỗ
Toàn thân
Vận động
Hô hấp
Tiêu hóa
Tại
chỗ
1
Yếu
BT
Bỏ ăn
Viêm
Yếu
BT
Bỏ ăn
Viêm
2
Yếu
BT
Bỏ ăn
Loét
Yếu
BT
Bỏ ăn
Loét
3
Yếu
BT
Bỏ ăn
Loét
Yếu
BT
Bỏ ăn
Viêm
4
BT
BT
BT
Loét
Yếu
BT
BT
Viêm
5
BT
BT
BT
Loét
BT
BT
BT
Loét
6
BT
BT
BT
Loét
BT
BT
BT
Loét
7
BT
BT
BT
Loét
BT
BT
BT
Loét
8
BT
BT
BT
Loét
BT
BT
BT
Loét
9
BT
BT
BT
Loét
BT
BT
BT
Loét
(BT: bình thường).
46
N g ù
2 a
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015
3. Kết quả xác định KT đặc hiệu với
KN nọc RHM trong huyết thanh ngựa.
ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống
[6]. Sinh hóa học về nọc rắn Hổ đã được
Trong quá trình gây miễn dịch theo lịch
nghiên cứu khá kỹ trên thế giới và trong
trình, theo dõi khả năng sinh KT đặc hiệu với
nước [9]. Sự khác biệt loài rắn (Hổ đất, Hổ
KN nọc RHM bằng kỹ thuật Ouchterlony cho
mèo và Hổ mang bành) về phân bố địa lý
thấy đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với KN nọc
rắn rất khả quan. KT đặc hiệu xuất hiện sau
2 lần gây miễn dịch và những lần gây miễn
dịch nhắc lại tiếp theo.
cũng như khác biệt về trình tự sắp xếp
aminoaxit trên mtADN đã được Wüster và
Thorpe chứng minh [10]. Vì vậy, nhu cầu cần
thiết cấp bách chế tạo HTKN RHM phục vụ
điều trị trên lâm sàng. Nghiên cứu này đã
chế tạo thành công KN nọc RHM theo
hướng dẫn của WHO. Sản phẩm KN nọc
RHM tạo ra đảm bảo tiêu chuẩn vô khuẩn và
sinh KT tốt trên ngựa, đảm bảo hiệu lực và
an toàn theo các tiêu chuẩn yêu cầu [8].
- Cùng với việc chế tạo KN nọc RHM,
việc gây miễn dịch cho ngựa tạo huyết
thanh ngựa có hiệu giá KT đặc hiệu cao,
làm nguyên liệu sản xuất HTKN là khâu rất
Hình 3: Vết tủa KN nọc RHM và KT từ huyết
quan trọng. Việc tính toán liều lượng KN, tá
thanh ngựa đã gây miễn dịch
chất và khoảng cách giữa hai lần tiêm sao
trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony).
cho hợp lý, đảm bảo sinh KT tốt mà không
gây nguy hiểm cho ngựa, giảm chi phí trong
BÀN LUẬN
- Rắn Hổ mèo với đặc tính và hình dạng
khác biệt: màu vàng nhạt oliu, hai mắt kính
không gọng kính, đặc biệt có khả năng phun
nọc rắn rất xa (> 2 m) [6, 9]. Các triệu chứng
nghiên cứu. Đây là lần đầu tiên xác định lịch
miễn dịch cho ngựa đối với KN nọc RHM
được áp dụng tại Việt Nam và trên thế giới.
Lịch trình gây miễn dịch dựa trên kinh
nghiệm trong sản xuất HTKN rắn Hổ đất [4]
và hướng dẫn của WHO (2010) [8]. Tuy
lâm sàng trên BN bị loài này cắn rất khác
nhiên, nọc RHM gây hoại tử tại chỗ và độc
biệt với BN bị rắn Hổ đất cắn: không có hội
tố toàn thân, nhất là trên tim mạch rất nặng
chứng nhiễm độc thần kinh, nhưng có các
nề [3]. Vì vậy, nghiên cứu đề ra quy trình
hội chứng nhiễm độc tế bào và rối loạn đông
khẳng định lịch miễn dịch, liều lượng KN, tá
cầm máu nhẹ. BN không đáp ứng điều trị
chất phù hợp, ngựa đáp ứng sinh KT tốt và
với huyết thanh kháng nọc rắn Hổ đất làm
an toàn. Trong đó:
tăng tỷ lệ tử vong, hoặc để lại di chứng
nặng nề,
47
+ Thời gian miễn dịch cần 8 - 9 tháng để
có KT tốt.