Xem mẫu
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
MỐI LIÊN QUAN GIỮA SNP72 GEN P53 VÀ SNP309 GEN MDM2
VỚI NGUY CƠ UNG THƯ PHỔI
Trần Khánh Chi, Trần Huy Thịnh
Trường Đại học Y Hà Nội
Đa hình thái nucleotid đơn (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) tại vị trí codon 72 trên exon 4 gen
p53 với sự biến đổi nucleotid G > C làm thay đổi acid amin Arg > Pro và SNP 309 T > G gen MDM2 đã được
công bố có mối liên quan với ung thư phổi. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu trên Thế giới vẫn chưa được
khẳng định nhất quán trên các quần thể nghiên cứu khác nhau. Đề tài được thực hiện nhằm xác định nguy
cơ mắc ung thư phổi liên quan đến SNP Arg72Pro gen p53 và SNP 309 T ˃ G gen MDM2. 208 bệnh nhân
được chẩn đoán xác định ung thư phổi nguyên phát tại Trung tâm Hô hấp, Trung tâm Y học Hạt nhân và
Ung bướu – Bệnh viện Bạch Mai và 173 người không mắc ung thư phổi được lựa chọn nghiên cứu; tiến
hành phân tích một số đặc điểm về lâm sàng và xác định SNP Arg72Pro gen p53, SNP 309 T ˃ G gen
MDM2 liên quan đến nguy cơ gây ung thư phổi. Kết quả ghi nhận kiểu gen SNP309 GG của gen MDM2 làm
gia tăng nguy cơ ung thư phổi 1,7 lần với OR = 1,7; 95%CI = 1,4 - 2,7 và 1,8 lần ở nam giới với OR = 1,8;
95%CI = 1,02 - 3,2 theo mô hình gen lặn; không ghi nhận được mối liên quan giữa SNP Arg72Pro gen p53
với nguy cơ mắc ung thư phổi (OR = 0,79; 95%CI = 0,45 - 1,36). Kiểu gen GG của gen MDM2 làm tăng nguy
cơ ung thư theo mô hình gen lặn. Chưa thấy được sự tương quan giữa SNP Arg72Pro gen p53 với nguy cơ
mắc ung thư phổi.
Từ khóa: SNP Arg72Pro gen p53, gen MDM2, SNP 309 T ˃ G gen MDM2, ung thư phổi
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư phổi là nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu trên Thế giới và Việt Nam [1]. Bên
cạnh yếu tố nguy cơ chính là hút thuốc lá, các
nhà khoa học hiện nay tập trung vào nghiên
cứu vai trò của kiểu gen trong việc xác định
những cá thể nhạy cảm với ung thư, trong đó
có ung thư phổi. Kiểu gen nhạy cảm với ung
thư có thể được hình thành từ tính đa hình
của các gen mã hoá tổng hợp nên các phân
tử protein tham gia vào quá trình chuyển hoá
các hợp chất gây ung thư, kiểm soát chu kỳ tế
bào, sửa chữa các tổn thương DNA và chết
theo chương trình của tế bào [2].
Gen p53 là gen áp chế ung thư nằm tại vị
trí p13.3 của nhiễm sắc thể (NST) số 17, mã
hóa protein p53 có trọng lượng phân tử 53kDa
- một protein trong nhóm điều hòa chu kỳ tế
bào. Con đường tín hiệu p53 có vai trò trung
tâm trong quá trình ngăn chặn sự phát sinh
ung thư nhờ khả năng dừng chu kỳ tế bào và
gây chết theo chương trình của tế bào
(apoptosis) khi có sự tổn thương DNA không
được sửa chữa hay xuất hiện sự hoạt hoá các
oncogen. Đột biến gen p53 gặp khá phổ biến
trong nhiều loại ung thư trong đó có ung thư
phổi và được nhiều nghiên cứu trên thế giới
cũng như tại Việt Nam đề cập đến [3].
Gen MDM2 nằm trên nhánh dài của nhiễm
Địa chỉ liên hệ: Trần Khánh Chi, Bộ môn Hóa sinh,
Trường Đại học Y Hà Nội
sắc thể số 12 giữa vị trí vùng 14 băng 3 đến
Email: chibish@gmail.com
vùng 15. MDM2 là yếu tố điều hoà âm tính
Ngày nhận: 23/12/2016
trong con đường tín hiệu p53 do có thể gắn
Ngày được chấp thuận: 26/2/2017
trực tiếp với protein p53 và ức chế hoạt tính
TCNCYH 106 (1) - 2017
1
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
của chúng. Đồng thời MDM2 còn thúc đẩy quá
tâm Y học hạt nhân và Ung bướu - Bệnh viện
trình giáng hoá protein p53 trong tế bào thông
Bạch Mai được chẩn đoán xác định bằng mô
qua con đường ubiquitin hoá [4].
bệnh học.
Đa hình Arg72Pro trên exon 4 của gen p53
- 173 mẫu máu của nhóm chứng không
nằm trong vùng giàu prolin, có vai trò quan
mắc các loại ung thư, tương ứng về tuổi và
trọng đối với chức năng apoptosis của protein
giới với nhóm bệnh.
p53. Sự thay thế nucleotid G > C tại codon 72
dẫn đến bộ ba CGC mã hóa cho arginin bị
2. Phương pháp
thay đổi thành bộ ba CCC mã hóa cho prolin
- Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu máu
[5]. Biến thể Arg tăng cường quá trình apop-
theo phương pháp sử dụng enzyme protease
tosis và ức chế sự biến đổi của tế bào. Ngược
K và phenol: chloroform: isoamyl alcohol.
lại, biến thể Pro tăng cường quá trình phiên
- Xác định kiểu gen SNP Arg72Pro gen
mã của các gen sửa chữa DNA. Nhiều nghiên
p53
cứu cho thấy, đa hình Arg72Pro có tương
(Restriction Fragment Length Polymorphism -
bằng
phương
pháp
RFLP
-
PCR
quan với nguy cơ mắc và tiến triển của một số
PCR).
bệnh lý ung thư như ung thư vú, đại tràng,
+ Khuếch đại vùng gen chứa SNP
phổi, gan và cổ tử cung. Bên cạnh đó, nhiều
Arg72Pro của gen p53 bằng phương pháp
nghiên cứu về tính đa hình thái của gen
PCR, sử dụng cặp mồi đặc hiệu:
MDM2 ghi nhận SNP quan trọng nhất nằm ở
F: 5’ - CTG GTA AGG ACA AGG GTT GG - 3’.
vị trí 309 - SNP309 (rs2279744), trong đó sự
R: 5’ - ACT GAC CGT GCA AGT CAC AG - 3’.
biến đổi từ nucleotid T thành nucleotid G đã
được chứng minh làm tăng ái lực của sự hoạt
hóa phiên mã Sp1 dẫn đến sự biểu hiện ở
mức độ cao hơn mRNA và protein của MDM2
gây ức chế con đường tín hiệu p53 [6 - 8]. Đa
hình thái này được chỉ ra liên quan đến nhiều
loại ung thư trong đó có ung thư phổi. Tuy
nhiên, các kết quả nghiên cứu trên thế giới
vẫn chưa được khẳng định nhất quán trên các
quần thể nghiên cứu khác nhau.
Đề tài được tiến hành nhằm xác định nguy
cơ mắc ung thư phổi liên quan đến SNP
Arg72Pro trên exon 4 gen p53 và SNP 309 T
˃ G gen MDM2.
+ Phân tích RFLP: đoạn gen được nghiên
cứu chứa trình tự nhận biết của enzyme BstUI
(CGCG) tại vị trí codon 72. Khi BstUI cắt
đoạn gen sẽ tạo ra các đoạn DNA có kích
thước 165 bp và 231 bp, tương ứng với kiểu
allele Arg (wild type - GG). Khi base G bị thay
thế bởi base C sẽ làm mất trình tự nhận biết
của enzyme BstUI, do đó đoạn gen sẽ không
bị cắt, tương ứng với kiểu allele Pro (mutant
type - CC).
- Xác định kiểu gen SNP 309 của gen
MDM2 bằng phương pháp RFLP - PCR:
+ Khuếch đại vùng gen SNP309 của gen
MDM2 bằng phương pháp PCR, sử dụng cặp
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
mồi đặc hiệu:
1. Đối tượng
F: 5’ - CGCGGGAGTTCAGGGTAAAG - 3’.
- 208 mẫu máu của bệnh nhân ung thư
R: 5’ - CTGAGTCAACCTGCCCACTG - 3’.
phổi nguyên phát tại Trung tâm Hô hấp, Trung
+ Phân tích RFLP: đoạn gen được nghiên
2
TCNCYH 106 (1) - 2017
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
cứu chứa trình tự nhận biết của enzym
CI, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, p < 0,05.
MspA1i (CCG ↓ CTG) tại vị trí SNP309. Bình
3. Đạo đức trong nghiên cứu
thường vị trí SNP309 của gen MDM2 là T,
không chứa vị trí nhận biết của enzym
Đề tài đã được thông qua Hội đồng đạo
MspA1i, đoạn gen được khuếch đại không bị
đức của Trường Đại học Y Hà Nội theo quyết
cắt và giữ nguyên kích thước 157bp, tương
định số 118/HĐĐĐ-ĐHYHN ngày 31/11/2013.
ứng với kiểu allele T (wild type - TT). Khi có
Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào
đột biến thay thế base T bởi base G sẽ xuất
nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi
hiện trình tự nhận biết của enzym MspA1i, do
nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia
đó đoạn gen bị cắt và tạo ra các đoạn DNA có
vào nghiên cứu. Các thông tin cá nhân được
kích thước 48 bp và 109 bp, tương ứng với
đảm bảo bí mật.
kiểu allele G (mutant type - GG).
III. KẾT QUẢ
Xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm SPSS
1. Đặc điểm chung của đối tượng
nghiên cứu
16.0, tính toán tỷ suất chênh OR, 95%.
Bảng 1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu
Nhóm ung thư phổi
Nhóm chứng
Đặc điểm
p
n
%
n
%
Nam
158
76
110
63,6
Nữ
50
24
63
36,4
Giới
Tuổi (năm)
60,27 ± 9,07
K biểu mô tuyến
158
75,9
K biểu mô vảy
14
6,7
K biểu mô tế bào nhỏ
20
9,6
K biểu mô loại khác
16
7,8
61,73 ± 11,99
0,18
Mô bệnh học
+ Tuổi trung bình của nhóm bệnh là 60,27 ± 9,07 không khác biệt với tuổi của nhóm chứng là
61,17 ± 11,99, tỷ lệ nam/nữ là 3,16/1.
+ Ung thư biểu mô tuyến gặp nhiều nhất chiếm 75,9%.
2. Kết quả phân tích RFLP - PCR của SNP Arg72Pro gen p53 và SNP309 T ˃ G gen
MDM2
2.1. Kết quả phân tích RFLP-PCR của SNP Arg72Pro gen p53
Sản phẩm cắt của đoạn gen SNP Arg72Pro bởi enzyme BstUI gồm các đoạn DNA có kích
thước khác nhau, phù hợp với tính toán lý thuyết. Mẫu mang kiểu gen Arg/Arg gồm 2 băng DNA
có kích thước 165 bp và 231 bp (giếng 2, 3, 8). Mẫu mang kiểu gen Pro/Pro gồm 1 băng DNA có
kích thước 396 bp (giếng 1, 5, 6, 10). Mẫu mang kiểu gen dị hợp tử Arg/Pro gồm 3 băng DNA có
kích thước 165bp, 231bp và 396bp (giếng 4, 7, 9, 11, 12) (hình 1).
TCNCYH 106 (1) - 2017
3
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
MK
396bp
400bp
231bp
165bp
200bp
Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen p53 mang SNP Arg72Pro
bằng enzym BstUI
M: Thang chuẩn 100bp; Giếng 2, 3, 8: kiểu gen đồng hợp tử Arg/Arg; Giếng 1, 5, 6,10: kiểu
gen đồng hợp tử Pro/Pro; Giếng 4, 7, 9, 11, 12: kiểu gen dị hợp tử Arg/Pro.
2.2. Kết quả phân tích RFLP - PCR của SNP309 T ˃ G gen MDM2
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
200bp
157bp
109bp
100bp
48bp
Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen MDM2 mang SNP309 T ˃ G
bằng enzym MspA1i
M: Thang chuẩn 100bp. Giếng 1, 5, 8: kiểu gen đồng hợp tử TT; Giếng 2 ,4 ,6, 7, 10, 11: kiểu
gen đồng hợp tử GG; Giếng 3, 9: kiểu gen dị hợp tử TG.
Sản phẩm cắt gen MDM2 mang SNP309 bởi enzym MspA1i gồm các đoạn DNA có kích
thước khác nhau, phù hợp với tính toán lý thuyết. Mẫu mang kiểu gen đồng hợp tử T/T gồm 1
băng DNA có kích thước 157bp (giếng 1, 5, 8). Mẫu mang kiểu gen đồng hợp tử G/G gồm 2 băng
DNA có kích thước 109 bp và 48 bp (giếng 2 ,4 ,6, 7, 10, 11 ). Mẫu mang kiểu gen dị hợp tử T/G
gồm 3 băng DNA có kích thước 157bp, 109 bp và 48 bp (giếng 3, 9).
4
TCNCYH 106 (1) - 2017
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Bảng 2. Tần số các kiểu gen SNP Arg72Pro gen p53 và SNP309 T ˃ G gen MDM2
ở nhóm ung thư phổi và nhóm chứng
Kiểu gen
Ung thư phổi (n = 208)
Nhóm chứng (n = 173)
OR (95%CI)
n
%
n
%
Arg/Arg (GG)
53
25,5
44
25,4
1,00 (Reference)
Arg/Pro (GC)
102
49
73
42,2
1,16 (0,7 - 1,9)
Pro/Pro (CC)
53
25,5
56
32,4
0,79 (0,45 - 1,36)
TT
59
28,4
43
24,9
1,00 (Reference)
TG
90
43,2
97
56,1
0,68 (0,42 - 1,1)
GG
59
28,4
33
19
1,31 (0,73 - 2,33)
TT + TG
149
71,6
140
80,9
1,00 (Reference)
GG
59
28,4
33
19,1
1,7(1,04 - 2,73)
SNP Arg72Pro
SNP309 T ˃ G
GG với TT + TG
Kiểu gen dị hợp tử Arg/Pro codon 72 gen p53 và SNP 309TG đều chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả
nhóm bệnh và nhóm chứng. SNP 309GG làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi 1,7 lần theo mô
hình gen lặn. Chưa ghi nhận được mối liên quan có ý nghĩa giữa SNP Arg72Pro gen p53 với
nguy cơ mắc ung thư phổi.
Bảng 3. Tần số các kiểu gen SNP Arg72Pro gen p53 và SNP 309 T ˃ G gen MDM2
theo giới tính
Giới
Kiểu gen
Ung thư phổi
(n = 208)
n
%
Nhóm chứng
(n = 173)
n
OR (95% CI)
%
SNP Arg72Pro
158
Nam
110
Arg/Arg (GG)
40
25,3
30
27,2
1,00 (Reference)
Arg/Pro (GC)
76
48,1
45
41
1,27 (0,7 - 2,3)
Pro/Pro (CC)
42
25,6
35
31,8
0,9 (0,47 - 1,73)
50
63
Arg/Arg (GG)
13
14
1,00 (Reference)
Arg/Pro (GC)
26
28
(0,44 - 6,66)
Nữ
TCNCYH 106 (1) - 2017
5
nguon tai.lieu . vn
MỐI LIÊN QUAN GIỮA SNP72 GEN P53 VÀ SNP309 GEN MDM2
VỚI NGUY CƠ UNG THƯ PHỔI
Trần Khánh Chi, Trần Huy Thịnh
Trường Đại học Y Hà Nội
Đa hình thái nucleotid đơn (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) tại vị trí codon 72 trên exon 4 gen
p53 với sự biến đổi nucleotid G > C làm thay đổi acid amin Arg > Pro và SNP 309 T > G gen MDM2 đã được
công bố có mối liên quan với ung thư phổi. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu trên Thế giới vẫn chưa được
khẳng định nhất quán trên các quần thể nghiên cứu khác nhau. Đề tài được thực hiện nhằm xác định nguy
cơ mắc ung thư phổi liên quan đến SNP Arg72Pro gen p53 và SNP 309 T ˃ G gen MDM2. 208 bệnh nhân
được chẩn đoán xác định ung thư phổi nguyên phát tại Trung tâm Hô hấp, Trung tâm Y học Hạt nhân và
Ung bướu – Bệnh viện Bạch Mai và 173 người không mắc ung thư phổi được lựa chọn nghiên cứu; tiến
hành phân tích một số đặc điểm về lâm sàng và xác định SNP Arg72Pro gen p53, SNP 309 T ˃ G gen
MDM2 liên quan đến nguy cơ gây ung thư phổi. Kết quả ghi nhận kiểu gen SNP309 GG của gen MDM2 làm
gia tăng nguy cơ ung thư phổi 1,7 lần với OR = 1,7; 95%CI = 1,4 - 2,7 và 1,8 lần ở nam giới với OR = 1,8;
95%CI = 1,02 - 3,2 theo mô hình gen lặn; không ghi nhận được mối liên quan giữa SNP Arg72Pro gen p53
với nguy cơ mắc ung thư phổi (OR = 0,79; 95%CI = 0,45 - 1,36). Kiểu gen GG của gen MDM2 làm tăng nguy
cơ ung thư theo mô hình gen lặn. Chưa thấy được sự tương quan giữa SNP Arg72Pro gen p53 với nguy cơ
mắc ung thư phổi.
Từ khóa: SNP Arg72Pro gen p53, gen MDM2, SNP 309 T ˃ G gen MDM2, ung thư phổi
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư phổi là nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu trên Thế giới và Việt Nam [1]. Bên
cạnh yếu tố nguy cơ chính là hút thuốc lá, các
nhà khoa học hiện nay tập trung vào nghiên
cứu vai trò của kiểu gen trong việc xác định
những cá thể nhạy cảm với ung thư, trong đó
có ung thư phổi. Kiểu gen nhạy cảm với ung
thư có thể được hình thành từ tính đa hình
của các gen mã hoá tổng hợp nên các phân
tử protein tham gia vào quá trình chuyển hoá
các hợp chất gây ung thư, kiểm soát chu kỳ tế
bào, sửa chữa các tổn thương DNA và chết
theo chương trình của tế bào [2].
Gen p53 là gen áp chế ung thư nằm tại vị
trí p13.3 của nhiễm sắc thể (NST) số 17, mã
hóa protein p53 có trọng lượng phân tử 53kDa
- một protein trong nhóm điều hòa chu kỳ tế
bào. Con đường tín hiệu p53 có vai trò trung
tâm trong quá trình ngăn chặn sự phát sinh
ung thư nhờ khả năng dừng chu kỳ tế bào và
gây chết theo chương trình của tế bào
(apoptosis) khi có sự tổn thương DNA không
được sửa chữa hay xuất hiện sự hoạt hoá các
oncogen. Đột biến gen p53 gặp khá phổ biến
trong nhiều loại ung thư trong đó có ung thư
phổi và được nhiều nghiên cứu trên thế giới
cũng như tại Việt Nam đề cập đến [3].
Gen MDM2 nằm trên nhánh dài của nhiễm
Địa chỉ liên hệ: Trần Khánh Chi, Bộ môn Hóa sinh,
Trường Đại học Y Hà Nội
sắc thể số 12 giữa vị trí vùng 14 băng 3 đến
Email: chibish@gmail.com
vùng 15. MDM2 là yếu tố điều hoà âm tính
Ngày nhận: 23/12/2016
trong con đường tín hiệu p53 do có thể gắn
Ngày được chấp thuận: 26/2/2017
trực tiếp với protein p53 và ức chế hoạt tính
TCNCYH 106 (1) - 2017
1
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
của chúng. Đồng thời MDM2 còn thúc đẩy quá
tâm Y học hạt nhân và Ung bướu - Bệnh viện
trình giáng hoá protein p53 trong tế bào thông
Bạch Mai được chẩn đoán xác định bằng mô
qua con đường ubiquitin hoá [4].
bệnh học.
Đa hình Arg72Pro trên exon 4 của gen p53
- 173 mẫu máu của nhóm chứng không
nằm trong vùng giàu prolin, có vai trò quan
mắc các loại ung thư, tương ứng về tuổi và
trọng đối với chức năng apoptosis của protein
giới với nhóm bệnh.
p53. Sự thay thế nucleotid G > C tại codon 72
dẫn đến bộ ba CGC mã hóa cho arginin bị
2. Phương pháp
thay đổi thành bộ ba CCC mã hóa cho prolin
- Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu máu
[5]. Biến thể Arg tăng cường quá trình apop-
theo phương pháp sử dụng enzyme protease
tosis và ức chế sự biến đổi của tế bào. Ngược
K và phenol: chloroform: isoamyl alcohol.
lại, biến thể Pro tăng cường quá trình phiên
- Xác định kiểu gen SNP Arg72Pro gen
mã của các gen sửa chữa DNA. Nhiều nghiên
p53
cứu cho thấy, đa hình Arg72Pro có tương
(Restriction Fragment Length Polymorphism -
bằng
phương
pháp
RFLP
-
PCR
quan với nguy cơ mắc và tiến triển của một số
PCR).
bệnh lý ung thư như ung thư vú, đại tràng,
+ Khuếch đại vùng gen chứa SNP
phổi, gan và cổ tử cung. Bên cạnh đó, nhiều
Arg72Pro của gen p53 bằng phương pháp
nghiên cứu về tính đa hình thái của gen
PCR, sử dụng cặp mồi đặc hiệu:
MDM2 ghi nhận SNP quan trọng nhất nằm ở
F: 5’ - CTG GTA AGG ACA AGG GTT GG - 3’.
vị trí 309 - SNP309 (rs2279744), trong đó sự
R: 5’ - ACT GAC CGT GCA AGT CAC AG - 3’.
biến đổi từ nucleotid T thành nucleotid G đã
được chứng minh làm tăng ái lực của sự hoạt
hóa phiên mã Sp1 dẫn đến sự biểu hiện ở
mức độ cao hơn mRNA và protein của MDM2
gây ức chế con đường tín hiệu p53 [6 - 8]. Đa
hình thái này được chỉ ra liên quan đến nhiều
loại ung thư trong đó có ung thư phổi. Tuy
nhiên, các kết quả nghiên cứu trên thế giới
vẫn chưa được khẳng định nhất quán trên các
quần thể nghiên cứu khác nhau.
Đề tài được tiến hành nhằm xác định nguy
cơ mắc ung thư phổi liên quan đến SNP
Arg72Pro trên exon 4 gen p53 và SNP 309 T
˃ G gen MDM2.
+ Phân tích RFLP: đoạn gen được nghiên
cứu chứa trình tự nhận biết của enzyme BstUI
(CGCG) tại vị trí codon 72. Khi BstUI cắt
đoạn gen sẽ tạo ra các đoạn DNA có kích
thước 165 bp và 231 bp, tương ứng với kiểu
allele Arg (wild type - GG). Khi base G bị thay
thế bởi base C sẽ làm mất trình tự nhận biết
của enzyme BstUI, do đó đoạn gen sẽ không
bị cắt, tương ứng với kiểu allele Pro (mutant
type - CC).
- Xác định kiểu gen SNP 309 của gen
MDM2 bằng phương pháp RFLP - PCR:
+ Khuếch đại vùng gen SNP309 của gen
MDM2 bằng phương pháp PCR, sử dụng cặp
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
mồi đặc hiệu:
1. Đối tượng
F: 5’ - CGCGGGAGTTCAGGGTAAAG - 3’.
- 208 mẫu máu của bệnh nhân ung thư
R: 5’ - CTGAGTCAACCTGCCCACTG - 3’.
phổi nguyên phát tại Trung tâm Hô hấp, Trung
+ Phân tích RFLP: đoạn gen được nghiên
2
TCNCYH 106 (1) - 2017
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
cứu chứa trình tự nhận biết của enzym
CI, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, p < 0,05.
MspA1i (CCG ↓ CTG) tại vị trí SNP309. Bình
3. Đạo đức trong nghiên cứu
thường vị trí SNP309 của gen MDM2 là T,
không chứa vị trí nhận biết của enzym
Đề tài đã được thông qua Hội đồng đạo
MspA1i, đoạn gen được khuếch đại không bị
đức của Trường Đại học Y Hà Nội theo quyết
cắt và giữ nguyên kích thước 157bp, tương
định số 118/HĐĐĐ-ĐHYHN ngày 31/11/2013.
ứng với kiểu allele T (wild type - TT). Khi có
Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào
đột biến thay thế base T bởi base G sẽ xuất
nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi
hiện trình tự nhận biết của enzym MspA1i, do
nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia
đó đoạn gen bị cắt và tạo ra các đoạn DNA có
vào nghiên cứu. Các thông tin cá nhân được
kích thước 48 bp và 109 bp, tương ứng với
đảm bảo bí mật.
kiểu allele G (mutant type - GG).
III. KẾT QUẢ
Xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm SPSS
1. Đặc điểm chung của đối tượng
nghiên cứu
16.0, tính toán tỷ suất chênh OR, 95%.
Bảng 1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu
Nhóm ung thư phổi
Nhóm chứng
Đặc điểm
p
n
%
n
%
Nam
158
76
110
63,6
Nữ
50
24
63
36,4
Giới
Tuổi (năm)
60,27 ± 9,07
K biểu mô tuyến
158
75,9
K biểu mô vảy
14
6,7
K biểu mô tế bào nhỏ
20
9,6
K biểu mô loại khác
16
7,8
61,73 ± 11,99
0,18
Mô bệnh học
+ Tuổi trung bình của nhóm bệnh là 60,27 ± 9,07 không khác biệt với tuổi của nhóm chứng là
61,17 ± 11,99, tỷ lệ nam/nữ là 3,16/1.
+ Ung thư biểu mô tuyến gặp nhiều nhất chiếm 75,9%.
2. Kết quả phân tích RFLP - PCR của SNP Arg72Pro gen p53 và SNP309 T ˃ G gen
MDM2
2.1. Kết quả phân tích RFLP-PCR của SNP Arg72Pro gen p53
Sản phẩm cắt của đoạn gen SNP Arg72Pro bởi enzyme BstUI gồm các đoạn DNA có kích
thước khác nhau, phù hợp với tính toán lý thuyết. Mẫu mang kiểu gen Arg/Arg gồm 2 băng DNA
có kích thước 165 bp và 231 bp (giếng 2, 3, 8). Mẫu mang kiểu gen Pro/Pro gồm 1 băng DNA có
kích thước 396 bp (giếng 1, 5, 6, 10). Mẫu mang kiểu gen dị hợp tử Arg/Pro gồm 3 băng DNA có
kích thước 165bp, 231bp và 396bp (giếng 4, 7, 9, 11, 12) (hình 1).
TCNCYH 106 (1) - 2017
3
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
MK
396bp
400bp
231bp
165bp
200bp
Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen p53 mang SNP Arg72Pro
bằng enzym BstUI
M: Thang chuẩn 100bp; Giếng 2, 3, 8: kiểu gen đồng hợp tử Arg/Arg; Giếng 1, 5, 6,10: kiểu
gen đồng hợp tử Pro/Pro; Giếng 4, 7, 9, 11, 12: kiểu gen dị hợp tử Arg/Pro.
2.2. Kết quả phân tích RFLP - PCR của SNP309 T ˃ G gen MDM2
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
200bp
157bp
109bp
100bp
48bp
Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen MDM2 mang SNP309 T ˃ G
bằng enzym MspA1i
M: Thang chuẩn 100bp. Giếng 1, 5, 8: kiểu gen đồng hợp tử TT; Giếng 2 ,4 ,6, 7, 10, 11: kiểu
gen đồng hợp tử GG; Giếng 3, 9: kiểu gen dị hợp tử TG.
Sản phẩm cắt gen MDM2 mang SNP309 bởi enzym MspA1i gồm các đoạn DNA có kích
thước khác nhau, phù hợp với tính toán lý thuyết. Mẫu mang kiểu gen đồng hợp tử T/T gồm 1
băng DNA có kích thước 157bp (giếng 1, 5, 8). Mẫu mang kiểu gen đồng hợp tử G/G gồm 2 băng
DNA có kích thước 109 bp và 48 bp (giếng 2 ,4 ,6, 7, 10, 11 ). Mẫu mang kiểu gen dị hợp tử T/G
gồm 3 băng DNA có kích thước 157bp, 109 bp và 48 bp (giếng 3, 9).
4
TCNCYH 106 (1) - 2017
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Bảng 2. Tần số các kiểu gen SNP Arg72Pro gen p53 và SNP309 T ˃ G gen MDM2
ở nhóm ung thư phổi và nhóm chứng
Kiểu gen
Ung thư phổi (n = 208)
Nhóm chứng (n = 173)
OR (95%CI)
n
%
n
%
Arg/Arg (GG)
53
25,5
44
25,4
1,00 (Reference)
Arg/Pro (GC)
102
49
73
42,2
1,16 (0,7 - 1,9)
Pro/Pro (CC)
53
25,5
56
32,4
0,79 (0,45 - 1,36)
TT
59
28,4
43
24,9
1,00 (Reference)
TG
90
43,2
97
56,1
0,68 (0,42 - 1,1)
GG
59
28,4
33
19
1,31 (0,73 - 2,33)
TT + TG
149
71,6
140
80,9
1,00 (Reference)
GG
59
28,4
33
19,1
1,7(1,04 - 2,73)
SNP Arg72Pro
SNP309 T ˃ G
GG với TT + TG
Kiểu gen dị hợp tử Arg/Pro codon 72 gen p53 và SNP 309TG đều chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả
nhóm bệnh và nhóm chứng. SNP 309GG làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi 1,7 lần theo mô
hình gen lặn. Chưa ghi nhận được mối liên quan có ý nghĩa giữa SNP Arg72Pro gen p53 với
nguy cơ mắc ung thư phổi.
Bảng 3. Tần số các kiểu gen SNP Arg72Pro gen p53 và SNP 309 T ˃ G gen MDM2
theo giới tính
Giới
Kiểu gen
Ung thư phổi
(n = 208)
n
%
Nhóm chứng
(n = 173)
n
OR (95% CI)
%
SNP Arg72Pro
158
Nam
110
Arg/Arg (GG)
40
25,3
30
27,2
1,00 (Reference)
Arg/Pro (GC)
76
48,1
45
41
1,27 (0,7 - 2,3)
Pro/Pro (CC)
42
25,6
35
31,8
0,9 (0,47 - 1,73)
50
63
Arg/Arg (GG)
13
14
1,00 (Reference)
Arg/Pro (GC)
26
28
(0,44 - 6,66)
Nữ
TCNCYH 106 (1) - 2017
5