Xem mẫu
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH THÁI ĐƠN GEN ADH1C
VÀ CÁC YẾU TỐ NGUY CƠ TRONG UNG THƯ TẾ BÀO GAN
NGUYÊN PHÁT
Uông Thị Thu Hương1, Trần Huy Thịnh1,
Trần Vân Khánh1, Nguyễn Thanh Bình1, Vũ Trường Khanh2
1
Trường Đại Học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Bạch Mai
Đa hình thái đơn gen ADH1C có liên quan đến sự phát triển của các loại hình ung thư trong đó có ung
thư gan nguyên phát. Mục tiêu của nghiên cứu nhằm đánh giá mối liên quan giữa đa hình thái đơn gen
ADH1C với yếu tố nguy ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm viêm gan B và lượng rượu tiêu thụ rượu.
Xác định kiểu gen ADH1C bằng phương pháp PCR - RFLP trên 150 bệnh nhân ung thư gan nguyên phát và
150 đối tượng nhóm chứng. Kết quả nghiên cứu cho thấy nhóm đối tượng nghiện rượu và uống vừa mang
kiểu gen ADH1C*1/*1 có nguy cơ mắc ung thư gan nguyên phát cao hơn nhóm mang kiểu gen ADH1C khác
với OR 3,33; (95% CI, 1,03 - 11), OR 2,92 (95% CI, 1,02 - 8,36). Bên cạnh đó, kiểu gen ADH1C*1/*1 làm
tăng nguy cơ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát cho những người nhiễm virus viêm gan B với OR = 2,78 (CI,
1,22 - 6,34).
Từ khóa: gen ADH1C, đa hình kiểu gen, ung thư gan tế bào gan nguyên phát
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
etaldehyde còn là chất gây ung thư do gắn với
Nghiện rượu mạn tính có liên quan đến
DNA tạo sản phẩm DNA “adduct” (sản phẩm
hình thành khối u. Một bằng chứng rõ ràng là
cộng) làm cho khối u phát triển. Quá trình tạo
nghiện rượu nặng có liên quan đến ung thư
ra acetaldehyde từ ethanol được xúc tác bởi
gan và nhiều loại ung thư khác [1; 2]. Bản
enzym alcohol dehydrogenase (ADH), đây là
thân rượu không phải là yếu tố trực tiếp
enzym có nhiều biến thể (được gọi isoen-
nhưng là yếu tố thúc đẩy quá trình hình thành
zym) trong đó các isoenzym ADH nhóm I
ung thư gan [3; 4]. Tuy nhiên, một số điều còn
chuyển hóa > 92% lượng ethanol tại gan [4;
đang bàn cãi là chỉ một nhóm người nghiện
5]. Một trong những gen mã hóa cho enzym
rượu nặng tiến triển thành ung thư, số đông
ADH nhóm 1 là gen ADH1C [6 - 8]. Nhiều
còn lại thì không mắc bệnh. Gần đây nhiều ý
nghiên cứu đã chứng minh rằng đa hình thái
kiến đưa ra phải chăng yếu tố gen là yếu tố
đơn gen ADH1C có liên quan đến ung thư [9
nguy cơ của từng cá thể đối với ung thư.
- 11]. Nghiên cứu trước của chúng tôi đã
Khi rượu vào cơ thể, ethanol sẽ được
khẳng định kiểu gen ADH1C*1/*1 và alen
chuyển hóa và tạo thành acetaldehyde, đây là
ADH1C*1 là yếu tố nguy cơ độc lập với ung
chất gây độc và làm hủy hoại tế bào gan. Ac-
thư gan nguyên phát có sử dụng rượu, tuy
nhiên vẫn chưa thấy rõ được mối liên quan
giữa mức độ tiêu thụ rượu, yếu tố tác động
Địa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường
Đại học Y Hà Nội
virus viêm gan B với gen ADH1C trong bệnh
Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn
ung thư gan nguyên phát. Vì vậy, nghiên cứu
Ngày nhận: 26/9/2017
này thực hiện với mục tiêu khảo sát mối liên
Ngày được chấp thuận: 26/11/2017
quan giữa gen ADH1C với một số yếu tố
TCNCYH 109 (4) - 2017
9
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
nguy cơ hay gặp trên bệnh nhân ung gan
nguyên phát.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
Nhóm bệnh: 150 bệnh nhân được chẩn
đoán xác định và được theo dõi điều trị ung
thư gan nguyên phát tại Bệnh viện K Trung
ương từ tháng 1/2014 đến tháng 9/2014.
Nhóm chứng: 150 người mắc một số bệnh
mạn tính khám tại phòng khám Nội Bệnh viện
Xanh Pôn Hà Nội. Đối tượng này được lựa
chọn có sử dụng rượu được khám kết luận
không mắc ung thư gan nguyên phát hay bất
kỳ ung thư nào khác, tình nguyện tham gia
nghiên cứu, được phỏng vấn và lấy mẫu cùng
thời điểm thực hiện nghiên cứu.
Các đối tượng nghiên cứu đều được khai
thác tiền sử sử dụng rượu. Phương pháp đo
lượng rượu tiêu thụ là hỏi trực tiếp bằng bảng
câu hỏi QF [12].
2.1. Thu thập mẫu
- Thu thập mẫu máu của bệnh nhân ung
thư tế bào gan nguyên phát và mẫu chứng.
2.2. Tách chiết DNA
- DNA được tách chiết theo phương pháp
phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi
của bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên
phát và người lành đối chứng.
- Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ của
DNA được tách chiết bằng phương pháp đo
quang trên máy Nanodrop, dựa vào tỷ lệ
A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0.
2.3. Kỹ thuật PCR-RFLP (PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism)
Khuếch đại đoạn gen ADH1C bằng máy
PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Mồi xuôi: ADH3ex8F: AAT AAT TAT TTT
TCA GGC TTT AAG AGT AAA TAT TCT GT.
Mồi ngược: ADH3ex8R: AAT CTA CCT
CTT TCC AGA GC.
Dựa vào số lần sử dụng rượu trong tháng,
thể tích cốc sử dụng, số gram rượu quy đổi
Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích
của từng loại rượu sẽ tính được lượng rượu
20μl gồm: 10 μl Taq polymerase, 1μl mồi xuôi,
tiêu thụ trong tháng và theo ngày.
1μl mồi ngược, 2μl DNA và 6μl H2O. Chu trình
Mức độ tiêu thụ rượu được phân loại theo
hàm lượng tiêu thụ trong ngày: uống ít (nam ≤
40g, nữ ≤ 20g), uống vừa (nam 41 - 60g, nữ
21 - 40g), nghiện rượu (nam ≥ 61g, nữ ≥ 41g).
Nhiễm virus viêm gan B: Que thử test
HbsAg +.
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm
Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y
Hà Nội.
2. Phương pháp
Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu bệnh
chứng.
10
nhiệt của phản ứng PCR: [94oC/30 giây,
54oC/30 giây, 72oC/30 giây] 37 chu kỳ. Bảo
quản mẫu ở 15oC.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel
agarose 3% kiểm tra, sau đó được tiến hành
giải trình tự theo quy trình thường quy. Kết
quả được so với trình tự Genebank.
Đoạn gen được khuếch đại với cặp mồi
đặc hiệu ADH3ex8F và ADH3ex8R là một
đoạn dài 162 bp trên exon 8 của gen ADH1C,
chứa SNP rs698. Vị trí SNP rs698 cách đầu 5'
một đoạn 99 bp, cách đầu 3' một đoạn 62bp
và cách vị trí cắt đối chứng của enzym SspI
TCNCYH 109 (4) - 2017
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
một đoạn 68 bp.Sản phẩm PCR sau khi enzym
thư gan. Sử dụng kiểm định trung vị (Median
SspI cho hình ảnh đoạn gen trên điện di.
Test) để so sánh trung vị của tuổi phát hiện
Alen ADH1C*2: 2 đoạn gen kích thước
bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát. Tính tỷ
31bp và 131bp. Alen ADH1C*1: 3 đoạn gen
suất chênh (Odds Ratio: OR) với độ tin cậy
kích thước 31bp và 68bp, 63bp, trong đó đoạn
95% (Confidence Interval: CI) về tương quan
68bp và 63bp trùng nhau cho hình ảnh 1 băng
giữa tính đa hình thái của đoạn gen ADH1C
điện di.
và ung thư gan nguyên phát và một số các
Kiểu gen ADH1C*1/*1: 2 băng tương ứng
đoạn gen 63bp, 68bp, và 31bp. Kiểu gen
yếu tố nguy cơ được tính toán theo phương
pháp hồi quy.
ADH1C*1/*2: 3 băng tương ứng đoạn gen
3. Đạo đức trong nghiên cứu
63bp, 68bp và 31bp, 131bp. Kiểu gen
Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức
ADH1C*2/*2:
2 băng tương ứng đoạn gen
131bp và 31bp.
nghiên
định
cứu
số
trong
Y
học
188/HĐĐĐ-
theo
Quyết
ĐHYHN,
ngày
31/01/2013 của Hội đồng Đạo đức Y học
2.4. Phân tích số liệu
Trường Đại học Y Hà Nội. Đối tượng tham gia
Phương pháp thống kê và kiểm định Chi-
nghiên cứu hoàn toàn tự nguyện và có quyền
Square (χ2) trên phần mềm SPSS 16.0 được
rút khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục
sử dụng để đánh giá tỷ lệ các alen, các kiểu
tham gia. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm
gen và mối tương quan giữa chúng với ung
bảo bí mật.
III. KẾT QUẢ
1. Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu
Bảng 1. Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu
Bệnh
Chứng
Đặc điểm
p
n
%
n
%
Nam
121
80,7
131
87,3
Nữ
29
19,3
19
12,7
≤ 40
20
13,3
11
7,3
40 - 60
93
62,0
86
57,3
≥ 60
37
24,7
53
35,3
Nghiện
54
36,0
57
38,0
Uống vừa
60
40,0
53
35,3
Uống ít
36
24,0
40
26,7
99
66,0
84
56,0
Giới
Tuổi
Sử dụng rượu
0,12
Nhiễm HBV
TCNCYH 109 (4) - 2017
0,06
0,69
0,08
11
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Trong nhóm bệnh, độ tuổi mắc bệnh thay
dụng bộ câu hỏi của Tổ chức Y tế Thế giới
đổi rộng, cao nhất độ tuổi 40 - 60 chiếm tới
62%, giảm dần từ tuổi 60. Nói chung tần suất
(2000), đây là bộ câu hỏi đã được áp dụng ở
nhiều cuộc điều tra và ở nhiều các quốc gia
mắc bệnh tăng theo tuổi và giảm nhẹ ở tuổi
già. Tỷ lệ mắc bệnh của nam cao hơn nhiều so
khác nhau, giúp phân loại 3 nhóm nghiện rượu,
uống vừa, uống ít dựa vào hàm lượng rượu
với nữ (4,18/1). Viêm gan B được coi là nguyên
nhân hàng đầu gây ung thư gan nguyên phát.
trung bình trong một ngày. Nhóm nghiện rượu
và uống vừa chiếm tỉ lệ cao trong nhóm bệnh
Tỷ lệ nhiễm HBV của nghiên cứu chiếm khá
(tương ứng 40,0%, 36,0%). Nhóm chứng, hàm
cao tới 66%, cho thấy Việt Nam là vùng nằm
trong vùng nhiễm HBV và ung thư gan cao
lượng rượu sử dụng trong ngày cũng khá cao,
nhóm nghiện rượu và nhóm uống vừa chiếm
nhất thế giới. Bên cạnh những yếu tố nguy cơ
trên, nhóm nghiên cứu tập trung khai thác tiền
đa số. Như vậy, không có sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê (p > 0,05) cả về độ tuổi, giới,
sử uống rượu và mức độ sử dụng rượu của
từng đối tượng nghiên cứu. Nghiên cứu đã sử
nhiễm virus HBV, mức độ sử dụng rượu giữa 2
nhóm bệnh và nhóm chứng.
2. Mối liên quan giữa gen ADH1C với một số yếu tố nguy cơ trong ung thư tế bào gan
nguyên phát
K21 K22
K21
K22 K23
K23 K24
K24 K25
K25 K26
K26 K27
K27 K28
K28 K29
K29 K30
K30 K31
K31 M
M
131bp
131bp
63 63-68bp
- 68bp
31pb31bp
K61
K70 K71
K71 MM
K61 K62
K62 K63
K63 K64
K64 K65
K65 K66
K66 K67
K67 K68
K68 K69
K69 K70
131bp
131bp
6363-68bp
- 68bp
31pb31bp
Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen ADH1C bằng enzym SspI
mẫu bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát
M: Marker 100bp; kiểu gen ADH1C*1/*1(K21-K29 và K31, K61, K64 - K71), kiểu gen
ADH1C*1/*2 (K30), kiểu gen ADH1C*2/*2 (K63).
Sản phẩm của đoạn gen ADH1C bằng enzym cắt SspI cho thấy các băng rõ nét và phân tách
rõ ràng, kích thước phù hợp với đoạn các đoạn gen bị cắt và kết quả kiểm tra lại bằng giải trình
tự trên GeneBank.
12
TCNCYH 109 (4) - 2017
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
2.1. Gen ADH1C và độ tuổi phát hiện bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát của các
kiểu gen
Bảng 2. Gen ADH1C và trung vị tuổi phát hiện bệnh của các kiểu gen
Kiểu gen
Trung vị của tuổi phát hiện bệnh
ADH1C*1/*1
p
55 [28 - 80]
0,78
ADH1C*1/*2 và ADH1C*2/*2
[25 - 71]
Theo bảng trên, trung vị của tuổi phát hiện bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát ở kiểu gen
ADH1C*1/*1 là 55 [28 - 80], của kiểu gen ADH1C*1/*2 và ADH1C*2/*2 là 52 [25 - 71]. Giữa các
kiểu gen trung vị của tuổi phát hiện bệnh không có sự khác biệt với p = 0,78 (kiểm định Median
test).
2.2. Mối liên quan của gen ADH1C với giới tính trong nhóm ung thư gan nguyên phát
Bảng 3. Gen ADH1C và giới trong nhóm bệnh
Giới tính
Nam (n = 121)
Nữ (n = 29)
p
CI 95%
ADH1C*1/*1
107 (88,4%)
28 (96,6%)
0,19
0,03 - 2,16
ADH1C*1/*2 và ADH1C*2/*2
14 (11,6%)
1 (3,4%)
Kiểu gen
Trong 150 bệnh nhân có 107 nam (88,4%) và 28 nữ (96,6%) mang kiểu gen đồng hợp
ADH1C*1/*1 và chỉ có 14 nam (11,6%) và 1 nữ (3,4%) mang kiểu gen dị hợp tử ADH1C*1/*2 và
đồng hợp tử ADH1C*2/*2. Tỷ lệ kiểu gen ADH1C ở nam và nữ trong nhóm bệnh không có sự
khác biệt (p > 0,05).
2.3. Mối liên quan của gen ADH1C vớí nhiễm virut HBV
Bảng 4. Gen ADH1C với nhiễm virut HBV
Tình trạng
Viêm gan
HBV (+)
HBV(-)
Kiểu gen
Nhóm bệnh
Nhóm chứng
ADH1C*1/*1
89 (89,9%)
64 (76,2%)
ADH1C*1/*2 và
ADH1C*2/*2
10 (10,1%)
20 (23,8%)
Tổng
99 (100%)
84 (100%)
ADH1C*1/*1
46 (90,2%)
55 (83,3%)
5 (9,8%)
11 (16,7%)
51 (100%)
66 (100%)
ADH1C*1/*2 và
ADH1C*2/*2
Tổng
TCNCYH 109 (4) - 2017
p
OR
CI 95%
2,78
0,01
1,22 - 6,34
1,00
1,84
0,28
0,59 - 5,68
1,00
13
nguon tai.lieu . vn
MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH THÁI ĐƠN GEN ADH1C
VÀ CÁC YẾU TỐ NGUY CƠ TRONG UNG THƯ TẾ BÀO GAN
NGUYÊN PHÁT
Uông Thị Thu Hương1, Trần Huy Thịnh1,
Trần Vân Khánh1, Nguyễn Thanh Bình1, Vũ Trường Khanh2
1
Trường Đại Học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Bạch Mai
Đa hình thái đơn gen ADH1C có liên quan đến sự phát triển của các loại hình ung thư trong đó có ung
thư gan nguyên phát. Mục tiêu của nghiên cứu nhằm đánh giá mối liên quan giữa đa hình thái đơn gen
ADH1C với yếu tố nguy ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm viêm gan B và lượng rượu tiêu thụ rượu.
Xác định kiểu gen ADH1C bằng phương pháp PCR - RFLP trên 150 bệnh nhân ung thư gan nguyên phát và
150 đối tượng nhóm chứng. Kết quả nghiên cứu cho thấy nhóm đối tượng nghiện rượu và uống vừa mang
kiểu gen ADH1C*1/*1 có nguy cơ mắc ung thư gan nguyên phát cao hơn nhóm mang kiểu gen ADH1C khác
với OR 3,33; (95% CI, 1,03 - 11), OR 2,92 (95% CI, 1,02 - 8,36). Bên cạnh đó, kiểu gen ADH1C*1/*1 làm
tăng nguy cơ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát cho những người nhiễm virus viêm gan B với OR = 2,78 (CI,
1,22 - 6,34).
Từ khóa: gen ADH1C, đa hình kiểu gen, ung thư gan tế bào gan nguyên phát
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
etaldehyde còn là chất gây ung thư do gắn với
Nghiện rượu mạn tính có liên quan đến
DNA tạo sản phẩm DNA “adduct” (sản phẩm
hình thành khối u. Một bằng chứng rõ ràng là
cộng) làm cho khối u phát triển. Quá trình tạo
nghiện rượu nặng có liên quan đến ung thư
ra acetaldehyde từ ethanol được xúc tác bởi
gan và nhiều loại ung thư khác [1; 2]. Bản
enzym alcohol dehydrogenase (ADH), đây là
thân rượu không phải là yếu tố trực tiếp
enzym có nhiều biến thể (được gọi isoen-
nhưng là yếu tố thúc đẩy quá trình hình thành
zym) trong đó các isoenzym ADH nhóm I
ung thư gan [3; 4]. Tuy nhiên, một số điều còn
chuyển hóa > 92% lượng ethanol tại gan [4;
đang bàn cãi là chỉ một nhóm người nghiện
5]. Một trong những gen mã hóa cho enzym
rượu nặng tiến triển thành ung thư, số đông
ADH nhóm 1 là gen ADH1C [6 - 8]. Nhiều
còn lại thì không mắc bệnh. Gần đây nhiều ý
nghiên cứu đã chứng minh rằng đa hình thái
kiến đưa ra phải chăng yếu tố gen là yếu tố
đơn gen ADH1C có liên quan đến ung thư [9
nguy cơ của từng cá thể đối với ung thư.
- 11]. Nghiên cứu trước của chúng tôi đã
Khi rượu vào cơ thể, ethanol sẽ được
khẳng định kiểu gen ADH1C*1/*1 và alen
chuyển hóa và tạo thành acetaldehyde, đây là
ADH1C*1 là yếu tố nguy cơ độc lập với ung
chất gây độc và làm hủy hoại tế bào gan. Ac-
thư gan nguyên phát có sử dụng rượu, tuy
nhiên vẫn chưa thấy rõ được mối liên quan
giữa mức độ tiêu thụ rượu, yếu tố tác động
Địa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường
Đại học Y Hà Nội
virus viêm gan B với gen ADH1C trong bệnh
Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn
ung thư gan nguyên phát. Vì vậy, nghiên cứu
Ngày nhận: 26/9/2017
này thực hiện với mục tiêu khảo sát mối liên
Ngày được chấp thuận: 26/11/2017
quan giữa gen ADH1C với một số yếu tố
TCNCYH 109 (4) - 2017
9
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
nguy cơ hay gặp trên bệnh nhân ung gan
nguyên phát.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
Nhóm bệnh: 150 bệnh nhân được chẩn
đoán xác định và được theo dõi điều trị ung
thư gan nguyên phát tại Bệnh viện K Trung
ương từ tháng 1/2014 đến tháng 9/2014.
Nhóm chứng: 150 người mắc một số bệnh
mạn tính khám tại phòng khám Nội Bệnh viện
Xanh Pôn Hà Nội. Đối tượng này được lựa
chọn có sử dụng rượu được khám kết luận
không mắc ung thư gan nguyên phát hay bất
kỳ ung thư nào khác, tình nguyện tham gia
nghiên cứu, được phỏng vấn và lấy mẫu cùng
thời điểm thực hiện nghiên cứu.
Các đối tượng nghiên cứu đều được khai
thác tiền sử sử dụng rượu. Phương pháp đo
lượng rượu tiêu thụ là hỏi trực tiếp bằng bảng
câu hỏi QF [12].
2.1. Thu thập mẫu
- Thu thập mẫu máu của bệnh nhân ung
thư tế bào gan nguyên phát và mẫu chứng.
2.2. Tách chiết DNA
- DNA được tách chiết theo phương pháp
phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi
của bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên
phát và người lành đối chứng.
- Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ của
DNA được tách chiết bằng phương pháp đo
quang trên máy Nanodrop, dựa vào tỷ lệ
A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0.
2.3. Kỹ thuật PCR-RFLP (PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism)
Khuếch đại đoạn gen ADH1C bằng máy
PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Mồi xuôi: ADH3ex8F: AAT AAT TAT TTT
TCA GGC TTT AAG AGT AAA TAT TCT GT.
Mồi ngược: ADH3ex8R: AAT CTA CCT
CTT TCC AGA GC.
Dựa vào số lần sử dụng rượu trong tháng,
thể tích cốc sử dụng, số gram rượu quy đổi
Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích
của từng loại rượu sẽ tính được lượng rượu
20μl gồm: 10 μl Taq polymerase, 1μl mồi xuôi,
tiêu thụ trong tháng và theo ngày.
1μl mồi ngược, 2μl DNA và 6μl H2O. Chu trình
Mức độ tiêu thụ rượu được phân loại theo
hàm lượng tiêu thụ trong ngày: uống ít (nam ≤
40g, nữ ≤ 20g), uống vừa (nam 41 - 60g, nữ
21 - 40g), nghiện rượu (nam ≥ 61g, nữ ≥ 41g).
Nhiễm virus viêm gan B: Que thử test
HbsAg +.
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm
Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y
Hà Nội.
2. Phương pháp
Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu bệnh
chứng.
10
nhiệt của phản ứng PCR: [94oC/30 giây,
54oC/30 giây, 72oC/30 giây] 37 chu kỳ. Bảo
quản mẫu ở 15oC.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel
agarose 3% kiểm tra, sau đó được tiến hành
giải trình tự theo quy trình thường quy. Kết
quả được so với trình tự Genebank.
Đoạn gen được khuếch đại với cặp mồi
đặc hiệu ADH3ex8F và ADH3ex8R là một
đoạn dài 162 bp trên exon 8 của gen ADH1C,
chứa SNP rs698. Vị trí SNP rs698 cách đầu 5'
một đoạn 99 bp, cách đầu 3' một đoạn 62bp
và cách vị trí cắt đối chứng của enzym SspI
TCNCYH 109 (4) - 2017
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
một đoạn 68 bp.Sản phẩm PCR sau khi enzym
thư gan. Sử dụng kiểm định trung vị (Median
SspI cho hình ảnh đoạn gen trên điện di.
Test) để so sánh trung vị của tuổi phát hiện
Alen ADH1C*2: 2 đoạn gen kích thước
bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát. Tính tỷ
31bp và 131bp. Alen ADH1C*1: 3 đoạn gen
suất chênh (Odds Ratio: OR) với độ tin cậy
kích thước 31bp và 68bp, 63bp, trong đó đoạn
95% (Confidence Interval: CI) về tương quan
68bp và 63bp trùng nhau cho hình ảnh 1 băng
giữa tính đa hình thái của đoạn gen ADH1C
điện di.
và ung thư gan nguyên phát và một số các
Kiểu gen ADH1C*1/*1: 2 băng tương ứng
đoạn gen 63bp, 68bp, và 31bp. Kiểu gen
yếu tố nguy cơ được tính toán theo phương
pháp hồi quy.
ADH1C*1/*2: 3 băng tương ứng đoạn gen
3. Đạo đức trong nghiên cứu
63bp, 68bp và 31bp, 131bp. Kiểu gen
Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức
ADH1C*2/*2:
2 băng tương ứng đoạn gen
131bp và 31bp.
nghiên
định
cứu
số
trong
Y
học
188/HĐĐĐ-
theo
Quyết
ĐHYHN,
ngày
31/01/2013 của Hội đồng Đạo đức Y học
2.4. Phân tích số liệu
Trường Đại học Y Hà Nội. Đối tượng tham gia
Phương pháp thống kê và kiểm định Chi-
nghiên cứu hoàn toàn tự nguyện và có quyền
Square (χ2) trên phần mềm SPSS 16.0 được
rút khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục
sử dụng để đánh giá tỷ lệ các alen, các kiểu
tham gia. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm
gen và mối tương quan giữa chúng với ung
bảo bí mật.
III. KẾT QUẢ
1. Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu
Bảng 1. Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu
Bệnh
Chứng
Đặc điểm
p
n
%
n
%
Nam
121
80,7
131
87,3
Nữ
29
19,3
19
12,7
≤ 40
20
13,3
11
7,3
40 - 60
93
62,0
86
57,3
≥ 60
37
24,7
53
35,3
Nghiện
54
36,0
57
38,0
Uống vừa
60
40,0
53
35,3
Uống ít
36
24,0
40
26,7
99
66,0
84
56,0
Giới
Tuổi
Sử dụng rượu
0,12
Nhiễm HBV
TCNCYH 109 (4) - 2017
0,06
0,69
0,08
11
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Trong nhóm bệnh, độ tuổi mắc bệnh thay
dụng bộ câu hỏi của Tổ chức Y tế Thế giới
đổi rộng, cao nhất độ tuổi 40 - 60 chiếm tới
62%, giảm dần từ tuổi 60. Nói chung tần suất
(2000), đây là bộ câu hỏi đã được áp dụng ở
nhiều cuộc điều tra và ở nhiều các quốc gia
mắc bệnh tăng theo tuổi và giảm nhẹ ở tuổi
già. Tỷ lệ mắc bệnh của nam cao hơn nhiều so
khác nhau, giúp phân loại 3 nhóm nghiện rượu,
uống vừa, uống ít dựa vào hàm lượng rượu
với nữ (4,18/1). Viêm gan B được coi là nguyên
nhân hàng đầu gây ung thư gan nguyên phát.
trung bình trong một ngày. Nhóm nghiện rượu
và uống vừa chiếm tỉ lệ cao trong nhóm bệnh
Tỷ lệ nhiễm HBV của nghiên cứu chiếm khá
(tương ứng 40,0%, 36,0%). Nhóm chứng, hàm
cao tới 66%, cho thấy Việt Nam là vùng nằm
trong vùng nhiễm HBV và ung thư gan cao
lượng rượu sử dụng trong ngày cũng khá cao,
nhóm nghiện rượu và nhóm uống vừa chiếm
nhất thế giới. Bên cạnh những yếu tố nguy cơ
trên, nhóm nghiên cứu tập trung khai thác tiền
đa số. Như vậy, không có sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê (p > 0,05) cả về độ tuổi, giới,
sử uống rượu và mức độ sử dụng rượu của
từng đối tượng nghiên cứu. Nghiên cứu đã sử
nhiễm virus HBV, mức độ sử dụng rượu giữa 2
nhóm bệnh và nhóm chứng.
2. Mối liên quan giữa gen ADH1C với một số yếu tố nguy cơ trong ung thư tế bào gan
nguyên phát
K21 K22
K21
K22 K23
K23 K24
K24 K25
K25 K26
K26 K27
K27 K28
K28 K29
K29 K30
K30 K31
K31 M
M
131bp
131bp
63 63-68bp
- 68bp
31pb31bp
K61
K70 K71
K71 MM
K61 K62
K62 K63
K63 K64
K64 K65
K65 K66
K66 K67
K67 K68
K68 K69
K69 K70
131bp
131bp
6363-68bp
- 68bp
31pb31bp
Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen ADH1C bằng enzym SspI
mẫu bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát
M: Marker 100bp; kiểu gen ADH1C*1/*1(K21-K29 và K31, K61, K64 - K71), kiểu gen
ADH1C*1/*2 (K30), kiểu gen ADH1C*2/*2 (K63).
Sản phẩm của đoạn gen ADH1C bằng enzym cắt SspI cho thấy các băng rõ nét và phân tách
rõ ràng, kích thước phù hợp với đoạn các đoạn gen bị cắt và kết quả kiểm tra lại bằng giải trình
tự trên GeneBank.
12
TCNCYH 109 (4) - 2017
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
2.1. Gen ADH1C và độ tuổi phát hiện bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát của các
kiểu gen
Bảng 2. Gen ADH1C và trung vị tuổi phát hiện bệnh của các kiểu gen
Kiểu gen
Trung vị của tuổi phát hiện bệnh
ADH1C*1/*1
p
55 [28 - 80]
0,78
ADH1C*1/*2 và ADH1C*2/*2
[25 - 71]
Theo bảng trên, trung vị của tuổi phát hiện bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát ở kiểu gen
ADH1C*1/*1 là 55 [28 - 80], của kiểu gen ADH1C*1/*2 và ADH1C*2/*2 là 52 [25 - 71]. Giữa các
kiểu gen trung vị của tuổi phát hiện bệnh không có sự khác biệt với p = 0,78 (kiểm định Median
test).
2.2. Mối liên quan của gen ADH1C với giới tính trong nhóm ung thư gan nguyên phát
Bảng 3. Gen ADH1C và giới trong nhóm bệnh
Giới tính
Nam (n = 121)
Nữ (n = 29)
p
CI 95%
ADH1C*1/*1
107 (88,4%)
28 (96,6%)
0,19
0,03 - 2,16
ADH1C*1/*2 và ADH1C*2/*2
14 (11,6%)
1 (3,4%)
Kiểu gen
Trong 150 bệnh nhân có 107 nam (88,4%) và 28 nữ (96,6%) mang kiểu gen đồng hợp
ADH1C*1/*1 và chỉ có 14 nam (11,6%) và 1 nữ (3,4%) mang kiểu gen dị hợp tử ADH1C*1/*2 và
đồng hợp tử ADH1C*2/*2. Tỷ lệ kiểu gen ADH1C ở nam và nữ trong nhóm bệnh không có sự
khác biệt (p > 0,05).
2.3. Mối liên quan của gen ADH1C vớí nhiễm virut HBV
Bảng 4. Gen ADH1C với nhiễm virut HBV
Tình trạng
Viêm gan
HBV (+)
HBV(-)
Kiểu gen
Nhóm bệnh
Nhóm chứng
ADH1C*1/*1
89 (89,9%)
64 (76,2%)
ADH1C*1/*2 và
ADH1C*2/*2
10 (10,1%)
20 (23,8%)
Tổng
99 (100%)
84 (100%)
ADH1C*1/*1
46 (90,2%)
55 (83,3%)
5 (9,8%)
11 (16,7%)
51 (100%)
66 (100%)
ADH1C*1/*2 và
ADH1C*2/*2
Tổng
TCNCYH 109 (4) - 2017
p
OR
CI 95%
2,78
0,01
1,22 - 6,34
1,00
1,84
0,28
0,59 - 5,68
1,00
13