- Trang Chủ
- Y khoa - Dược
- Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu các điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger
Xem mẫu
- ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
BÙI HỒNG SƠN
NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT
HOẠT CHẤT ỨC CHẾ -GLUCOSIDASE
TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC
HÀ NỘI - 2021
- ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
BÙI HỒNG SƠN
NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT
HOẠT CHẤT ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE
TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC
Khóa: QH.2016.Y
Người hướng dẫn: 1. TS. ĐỖ THỊ TUYÊN
2. ThS. ĐỖ THỊ QUỲNH
HÀ NỘI - 2021
- LỜI CẢM ƠN
Trước tiên em xin được cảm ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Tuyên, Trưởng phòng
Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, người thầy đã truyền cảm hứng, tận tình hướng dẫn, đưa ra
những góp ý và tạo mọi điều kiện thuận lợi cũng như kinh phí để thực hiện đề tài
khóa luận này.
Em xin được chân thành cảm ơn tới ThS. Đỗ Thị Quỳnh, Bộ môn Y Dược học
cơ sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã đưa ra những lời
khuyên quý báu, những kinh nghiệm nghiên cứu cũng như giúp đỡ em tận tình trong
thời gian làm khóa luận.
Tiếp đến em xin cảm ơn tập thể các anh chị, cán bộ Phòng Công nghệ sinh học
Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình cho em trong quá
trình thực nghiệm vừa qua, cũng như là chia sẻ những kinh nghiệm rất đáng quý, có
ứng dụng thực tế cao trong từng thí nghiệm.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô chủ nhiệm và các thầy cô bộ môn Y
Dược học cơ sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội trong suốt
khoảng thời gian 5 năm vừa rồi đã cung cấp cho bản thân em rất nhiều kiến thức và
kinh nghiệm quý báu, đã quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá
trình học tập.
Đồng thời em cũng xin cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè
đã luôn động viên và tiếp thêm sức mạnh cho tôi trong những lúc khó khăn nhất.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2021
Sinh viên
Bùi Hồng Sơn
- DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tên đầy đủ
ADA Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ
AGIs Các chất ức chế α-glucosidase
DC Đối chứng
DNJ 1-deoxynojirimycin
ĐTĐ Đái tháo đường
HPLC Sắc lý lỏng hiệu năng cao
IC50 Nồng độ ức chế 50%
IDF Hiệp hội Đái tháo đường thế giới
LC/MS Sắc ký lỏng khối phổi
Mật độ quang học của mẫu tại bước sóng
OD405
405nm
TLC Sắc ký lớp mỏng
UV Tia tử ngoại
- DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số hoạt chất ức chế α-glucosidase từ vi sinh vật ............................... 15
Bảng 2.1. Thiết bị thí nghiệm.................................................................................... 22
Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng ................................................................................ 23
Bảng 2.3. Thành phần các loại đệm và dung dịch .................................................... 24
Bảng 2.4. Tính chất đặc trưng của đầu dò hấp thụ UV và đầu dò khối phổ ............. 31
Bảng 3.1. Quá trình tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase bằng các dung môi
.................................................................................................................................. .33
Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch thu nhận hoạt chất ức chế α-glucosidase từ
chủng A. niger VTCC 031 ........................................................................................ 37
Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính tại các nồng độ khác nhau của dịch chiết n-butanol
................................................................................................................................... 40
Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính tại các nồng độ khác nhau của mẫu tinh sạch cuối
.................................................................................................................................. .42
- DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của các thuốc điều trị ĐTĐ tuýp 2 ................................... 6
Hình 1.2. Lược đồ lựa chọn thuốc và phương pháp điều trị ĐTĐ tuýp 2 ................... 7
Hình 1.3. Cấu trúc không gian 3D của enzyme α-glucosidase GH13 ...................... 10
Hình 1.4. Cấu trúc không gian 3D của enzyme α-glucosidase GH31 ...................... 11
Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của các chất ức chế enzyme α-glucosidase tại ruột non
................................................................................................................................... 12
Hình 1.6. Cấu trúc của acarbose, miglitol, voglibose và DNJ .................................. 13
Hình 1.7. Cấu trúc của các dẫn xuất monosaccharide .............................................. 14
Hình 1.8. Đặc điểm hình thái bào tử sau khi nuôi cấy 7 ngày chủng A. niger VTCC
031 trên đĩa thạch ...................................................................................................... 18
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu ....................................................................... 25
Hình 2.2. Các bước tiến hành tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A.
niger VTCC 031 ........................................................................................................ 27
Hình 3.1. Thu hoạch bình nuôi cấy chủng A. niger .................................................. 32
Hình 3.2. Khả năng tách các chất trong các mẫu dịch chiết khi sử dụng 9 hệ dung
môi khác nhau ........................................................................................................... 34
Hình 3.3. Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn qua cột silica gel
lần thứ nhất ................................................................................................................ 35
Hình 3.4. Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn từ 17 đến 21 sau khi
qua cột silica gel lần thứ nhất .................................................................................... 36
Hình 3.5. Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn qua cột silica gel
lần thứ hai .................................................................................................................. 37
Hình 3.6. Kiểm tra độ tinh sạch cả quá trình bằng TLC ........................................... 38
Hình 3.7. Kiểm tra độ tinh sạch bằng HPLC và LC/MS .......................................... 39
Hình 3.8. Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase của dịch chiết n-
butanol ....................................................................................................................... 41
Hình 3.9. Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase của acarbose tinh
khiết (Sigma) ............................................................................................................. 41
Hình 3.10. Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase của mẫu tinh sạch
cuối ............................................................................................................................ 42
- MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1. Bệnh đái tháo đường .......................................................................................... 2
1.1.1. Khái niệm .......................................................................................................... 2
1.1.2. Phân loại ............................................................................................................ 2
1.1.3. Cơ chế bệnh sinh và biến chứng ....................................................................... 3
1.1.4. Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường .................................................... 5
1.2. Enzyme α-glucosidase ........................................................................................ 9
1.2.1. Giới thiệu chung về -glucosidase ................................................................... 9
1.2.2. Cấu trúc của -glucosidase ............................................................................. 10
1.2.3. Cơ chế hoạt động của enzyme trong cơ thể .................................................... 11
1.3. Chất ức chế α-glucosidase ............................................................................... 12
1.3.1. Giới thiệu và cơ chế hoạt động của chất ức chế enzyme α-glucosidase ......... 12
1.3.2. Phân loại chất ức chế enzyme α-glucosidase .................................................. 14
1.3.3. Nguồn gốc chất ức chế enzyme α-glucosidase ............................................... 15
1.4. Giới thiệu về chủng nấm sợi Aspergillus niger .............................................. 18
1.5. Tình hình nghiên cứu hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng
Aspergillus trong nước và quốc tế .......................................................................... 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 22
2.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................... 22
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 22
2.3. Thiết bị phòng thí nghiệm và hóa chất ........................................................... 22
2.4. Môi trường nuôi cấy......................................................................................... 24
2.5. Quy trình tiến hành nghiên cứu ...................................................................... 24
2.6. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 25
2.6.1. Xác định hoạt tính chất ức chế α-glucosidase ................................................. 25
2.6.2. Tách chiết, tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ dịch nuôi cấy
................................................................................................................................... 26
- 2.6.3. Xác định giá trị IC50 ........................................................................................ 30
2.6.4. Kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lỏng khối phổ
................................................................................................................................... 30
2.6.5. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 32
3.1. Kết quả tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng A. niger
VTCC 031 ................................................................................................................ 32
3.1.1. Kết quả quá trình tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase với các dung môi
................................................................................................................................... 32
3.1.2. Nghiên cứu chọn lựa các hệ dung môi pha động chạy sắc ký cột .................. 34
3.1.3. Kết quả tinh sạch bằng cột sắc ký silica gel 60 ............................................... 35
3.2. Xác định IC50 của dịch chiết n-butanol và của mẫu tinh sạch cuối cùng ... 40
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 44
ĐỀ XUẤT ................................................................................................................. 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 46
- ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, bệnh đái tháo đường đang được coi là một trong những vấn đề sức
khỏe toàn cầu. Theo báo cáo của Liên đoàn Đái tháo đường quốc tế (IDF), số lượng
bệnh nhân đái tháo đường trên toàn thế giới dự kiến có thể gần 700 triệu người vào
năm 2045. Tại Việt Nam, theo ước tính của Bộ Y tế, đối với người tuổi từ 20 - 79,
bệnh đái tháo đường sẽ tăng khoảng 78,5% trong giai đoạn 2017 - 2045 (từ 3,53 triệu
bệnh nhân năm 2017 có thể tăng lên 6,3 triệu người mắc đái tháo đường vào năm
2045). Không những thế, dưới ảnh hưởng nghiêm trọng của đại dịch toàn cầu
COVID-19, quá trình điều trị cho những bệnh nhân đái tháo đường càng trở nên khó
khăn hơn. Các nghiên cứu gần đây cho thấy bệnh nhân đái tháo đường kiểm soát
đường huyết kém hơn khi mắc COVID-19 có tỷ lệ tử vong cao hơn khoảng 4 lần và
thời gian nằm viện lâu hơn so với bệnh nhân không bị đái tháo đường [14, 64]. Một
trong các nhóm thuốc đang được sử dụng để điều trị đái tháo đường hiện nay là nhóm
chất ức chế α-glucosidase, được sử dụng phổ biến trên lâm sàng điển hình như:
acarbose, voglibose, miglitol. Nhóm thuốc này thường được sử dụng phối hợp với
các thuốc đầu tay khác như metformine, nhóm đồng vận thụ thể GLP-1 ,… cho kết
quả điều trị tốt tuy nhiên chúng vẫn được ghi nhận những tác dụng không mong muốn
như: đau đầu, mất ngủ, buồn nôn, đầy hơi và tiêu chảy [15]. Vì vậy việc tìm kiếm
một hợp chất an toàn và thuận tiện cho việc sản xuất đang được nhiều nhà nghiên cứu
quan tâm. Hiện nay, một trong các nguồn nguyên liệu phong phú nhất là nguồn từ
các chủng vi sinh vật do chúng có một quần thể vô cùng rộng lớn, có thể phát triển
mạnh và không gây ô nhiễm môi trường xung quanh. Đặc biệt là chủng nấm
Aspergillus với nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy ứng dụng của chúng đối với việc
tổng hợp các hoạt chất thứ cấp do hoạt tính sinh học dùng để điều trị bệnh [16, 31,
39]. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với đề tài: “Nghiên cứu các điều
kiện tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger” với
các mục tiêu sau:
- Mô tả kết quả tách chiết, tinh sạch hoạt chất chất ức chế α-glucosidase từ chủng
Aspergillus niger;
- Xác định độ tinh sạch và giá trị IC50 của dịch chiết và sản phẩm cuối tinh sạch
chứa hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger.
1
- CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Bệnh đái tháo đường
1.1.1. Khái niệm
Đái tháo đường (ĐTĐ) là hội chứng các rối loạn chuyển hóa mãn tính, phức
tạp được đặc trưng bởi sự tăng glucose máu do tụy không sản xuất đủ insulin hoặc do
cơ thể sử dụng insulin không hiệu quả hoặc cả hai [43]. Bệnh lý này có thể gây ra
những tổn thương lâu dài trong nhiều hệ cơ quan như: tổn thương võng mạc, tim,
thận, não và hệ thống mạch máu với các bệnh điển hình như bệnh thận do tiểu đường,
bệnh võng mạc đái tháo đường, suy gan, tổn thương hệ thần kinh... nếu bệnh nhân
không phát hiện, điều trị và tuân thủ điều trị nghiêm ngặt [15].
1.1.2. Phân loại
Theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) năm 2021, ĐTĐ có các loại
sau: ĐTĐ tuýp 1, ĐTĐ tuýp 2, ĐTĐ thai kỳ, ĐTĐ do các nguyên nhân khác [11].
Đái tháo đường tuýp 1
ĐTĐ tuýp 1, trước đó được gọi là ĐTĐ tuổi vị thành niên, được gây ra bởi quá
trình tự miễn làm tổn thương tế bào beta (β) đảo tụy dẫn đến tình trạng giảm sản xuất
tuyệt đối insulin. Về mặt dịch tễ học, nó chiếm 5-10% số người mắc ĐTĐ.
Đái tháo đường tuýp 2
ĐTĐ tuýp 2, hay còn gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin, ĐTĐ người lớn,
chiếm khoảng 90-95% số người mắc ĐTĐ. Bệnh được gây ra trên nền tảng cơ thể
giảm tiết insulin tương đối ở tế bào β tuyến tụy và hình thành sự kháng insulin ở tế
bào. Hầu như bệnh nhân không cần điều trị bằng liệu pháp insulin trong cả cuộc đời.
Đái tháo đường do các nguyên nhân khác
ĐTĐ do các nguyên nhân khác, hay còn gọi là đái tháo đường thứ cấp, gồm:
hội chứng đái tháo đường đơn gen (gồm đái tháo đường khởi phát ở trẻ nhỏ và đái
tháo đường sơ sinh), do bệnh tụy ngoại tiết, do bệnh nội tiết, do cảm ứng thuốc, đái
tháo đường qua trung gian miễn dịch và đái tháo đường do các hội chứng di truyền.
Đái tháo đường thai kỳ
ĐTĐ thai kỳ - một loại rối loạn chuyển hóa phổ biến nhất ở phụ nữ mang thai
- được định nghĩa là hiện tượng rối loạn dung nạp glucose, được phát hiện vào giai
2
- đoạn thứ hai hoặc thứ ba của thai kỳ mà trước thời kỳ mang thai không có dấu hiệu
rõ ràng của bệnh đái tháo đường.
Một trong những hậu quả của tình trạng béo phì ngày càng phổ biến cũng như
trường hợp khi thai phụ đã lớn tuổi là sự tăng lên về tỷ lệ ĐTĐ thai kỳ trên thế giới,
đặt ra một gánh nặng lớn lên hệ thống y tế công [11, 65]. Thực tế cho thấy ĐTĐ thai
kỳ có nguy cơ gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng cho mẹ và thai nhi như phải
sinh mổ, đẻ khó do kẹt vai, hội chứng macrosomia ở thai nhi … [21]. Hơn nữa, thai
phụ mắc ĐTĐ thai kỳ dễ mắc ĐTĐ tuýp 2 hoặc các bệnh về tim mạch sau mang thai
[12, 53]; trong khi thai nhi dễ phát triển mắc béo phì hoặc ĐTĐ tuýp 2 sớm trong khi
lớn [20].
1.1.3. Cơ chế bệnh sinh và biến chứng
1.1.3.1. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ tuýp 1
ĐTĐ tuýp 1 được đặc trưng bởi sự tấn công qua trung gian miễn dịch và phá
hủy các tế bào β đảo tụy - sản xuất insulin. Quá trình bệnh sinh được điều phối bởi
các tế bào T-CD4 và T-CD8 đặc hiệu của tiểu đảo Langerhans, cũng như các tế bào
B, và liên quan đến việc phá hủy các tế bào beta của tiểu đảo Langerhans. Trước tiên,
các tế bào lympho (bạch huyết) bao quanh đảo nhỏ (viêm xung quanh tiểu đảo tụy),
và sau đó xâm nhập vào vùng trung tâm của tiểu đảo, gây ra sự hủy hoại tế bào beta
và cuối cùng là gây ra ĐTĐ tuýp 1. Bệnh phát sinh ở những người rối loạn về mặt di
truyền, khởi phát trung bình lúc 10 – 14 tuổi. Tỷ lệ mắc bệnh ở các cặp song sinh là
khoảng 60%, cho thấy các yếu tố môi trường cũng làm tăng nguy cơ mắc bệnh [38].
Trong số các yếu tố trên, các nghiên cứu cho thấy đặc điểm di truyền đóng vai
trò quan trọng trong cơ chế phát sinh ĐTĐ tuýp 1, đặc biệt là những người mang
kháng nguyên HLA DR3 và HLA DR4 vì chúng liên quan tới việc sản xuất các tự
kháng thể như kháng thể kháng đảo tụy (ICA); kháng thể kháng acid glutamic
decarboxylase 65 (GAD 65) và kháng thể kháng insulin (IAA: Insulin auto
antibodies),…[27].
Những cá nhân có rối loạn về di truyền sẽ tăng nguy cơ bị ĐTĐ tuýp 1 khi bị
tấn công bởi yếu tố môi trường bên ngoài như virus quai bị, rubella, virus coxsackie
B4. Các tự kháng thể IAA và GAD sẽ tấn công tế bào β đảo tụy khiến nó bị phá hủy,
mất khả năng sản xuất insulin và hậu quả là gây ra ĐTĐ tuýp 1 [27].
3
- 1.1.3.2. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ tuýp 2
Yếu tố di truyền kết hợp với môi trường tác động lên cơ thể gây ra tình trạng
kháng insulin và giảm bài tiết insulin, dần gây ra ĐTĐ tuýp 2. Kháng insulin là sự
hoạt động kém hiệu quả trong quá trình truyền tín hiệu của insulin từ receptor tới đích
phân tử cuối cùng, dẫn tới giảm tác dụng của insulin. Gen mã hóa các enzyme và
protein tham gia vào quá trình truyền tín hiệu của insulin như: insulin receptor
substrate, phosphatidyl inositol-3-kinase hay tham gia vào quá trình bài tiết insulin
như capain 10, yếu tố phiên mã 7-like 2 (the transcription factor 7-like 2) có liên quan
tới bệnh ĐTĐ tuýp 2 [48].
Bên cạnh đó các yếu tố môi trường có thể làm tăng tiến triển của bệnh như lối
sống không lành mạnh gồm việc giảm các hoạt động thể lực; thay đổi chế độ ăn uống
theo hướng tăng tinh, giảm chất xơ gây dư thừa năng lượng. Ngoài ra chất lượng thực
phẩm, các stress trong cuộc sống cũng tác động đến tình trạng bệnh. Tuổi thọ càng
tăng, nguy cơ mắc bệnh càng cao, đây là yếu tố không thể can thiệp được. Hầu hết
bệnh nhân béo phì hoặc thừa cân và béo phì vùng bụng với vòng eo to trong khi đó
béo phì vùng bụng có liên quan với tăng acid béo trong máu, mô mỡ cũng tiết ra một
số hormon làm giảm tác dụng của insulin ở các cơ quan đích như gan, tế bào mỡ, tế
bào cơ (kháng insulin tại các cơ quan đích). Do hiện tượng kháng insulin, ở giai đoạn
đầu xảy ra sự “bù” của các tế bào β đảo tụy khiến nó tăng tiết insulin nhiều hơn và
dần dẫn đến sự suy kiệt tế bào β đảo tụy khiến tăng đường huyết và cuối cùng là bệnh
nhân bắt đầu có những triệu chứng lâm sàng của ĐTĐ tuýp 2 [5].
1.1.3.3. Biến chứng của ĐTĐ
Bệnh ĐTĐ, cả tuýp 1 và 2, đều có thể gây ra những biến chứng từ nhẹ đến
nghiêm trọng cho người bệnh với các biểu hiện cấp tính và mãn tính, đây là hậu quả
từ tình trạng tăng glucose kéo dài. Các biểu hiện cấp tính như: nhiễm khuẩn do đường
máu cao và suy giảm hệ miễn dịch; hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu, nhiễm toan thể
ceton. Các biến chứng mạn tính như: biến chứng võng mạc, thận, xơ vữa động mạch.
Các biến chứng cấp tính có thể đe dọa tính mạng của bệnh nhân nếu không được xử
lý kịp thời còn các biến chứng mạn tính có thể gây ra hậu quả ở các mức độ khác
nhau từ giảm chất lượng cuộc sống của bệnh nhân tới khiến cho bệnh nhân tử vong.
Biến chứng cấp tính thường gặp đối với ĐTĐ tuýp 1 còn biến chứng mạn tính thường
gặp hơn ở các bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2.
Một trong những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng 25% bệnh thận ĐTĐ có thể
mắc các biến chứng về thận, gây ảnh hưởng lớn đến chức năng lọc của cầu thận, và
4
- cuối cùng có thể dẫn đến suy thận nếu không điều trị kịp thời và đúng cách [2]. Ở
Việt Nam, ước tính xấp xỉ 6% người lớn tuổi mắc ĐTĐ lâu ngày có nguy cơ mất thị
lực do các biến chứng đáy mắt của bệnh lí võng mạc ĐTĐ. Phát hiện sớm và điều trị
kịp thời võng mạc đái tháo đường có thể làm giảm nguy cơ ảnh hưởng tới thị lực của
bệnh nhân ĐTĐ[1].
1.1.4. Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường
Nguyên tắc điều trị chung đối với bệnh nhân ĐTĐ tập trung ở hai mục tiêu
kép là kiểm soát tốt glucose máu, đặc biệt là lượng glucose máu khi đói và glucose
máu sau ăn gần đạt khoảng sinh lý (
- Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của các thuốc điều trị ĐTĐ tuýp 2 [56]
Chú thích: AGI (α-glucosidase inhibitors): chất ức chế -glucose, DPP-4i
(Dipeptidyl peptidase-4-inhibitors): chất ức chế enzyme DPP-4, GLP-1 RA
(Glucagon-like peptide-1 receptor agonists): chất đồng vận thụ thể GLP-1, TZD:
Thiazolidinediones, SGL-T2i (sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor): chất ức
chế kênh đồng vận chuyển natri-glucose, MET: Metformim
Căn cứ vào hiệu quả điều trị trên lâm sàng, sự phối hợp của các nhóm thuốc
trong điều trị để đạt được mục tiêu theo Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo
đường do Bộ Y tế (2020) được trình bày cụ thể trong Hình 1.2 [5]:
6
- 7
Hình 1.2. Lược đồ lựa chọn thuốc và phương pháp điều trị ĐTĐ tuýp 2 [5]
- Trong quá trình điều trị và theo dõi bệnh nhân, các nghiên cứu cũng đưa ra
khuyến cáo về một số yếu tố cần xem xét khi chọn lựa thuốc điều trị cho bệnh nhân
ĐTĐ gồm [5]:
a) Hiệu quả giảm glucose huyết
b) Nguy cơ hạ glucose máu: sulfonylurea, insulin
c) Tăng cân: Pioglitazon, insulin, sulfonylurea
d) Giảm cân: GLP-1 RA, ức chế SGLT2, ức chế DPP-4 (giảm cân ít)
e) Không ảnh hưởng nhiều lên cân nặng: ức chế enzyme DPP-4, metformin, ức chế
enzyme α-glucosidase
f) Ảnh hưởng lên bệnh lý tim mạch do xơ vữa:
- Hiệu quả có lợi (bằng chứng rõ ràng: GLP-1 RA và ức chế SGLT-2 trừ
lixisenatide trung tính).
- Có thể có lợi pioglitazone và metformin
g) Ảnh hưởng lên các vấn đề về tim mạch, đặc biệt suy tim có phân suất tống máu
giảm LVEF 65 tuổi): Không cần chỉnh liều GLP-1 RA, SGLT-2i
- Suy thận: Không cần chỉnh liều GLP-1 RA, linaglipin đối với suy thận nhẹ,
trung bình hay nặng. SGLT-2i được ưu tiên trên BN có eGFR 30-60
mL/phút/1,73m2 da hoặc albumin niệu > 30mg/g creatinin để giảm tiến triển
bệnh thận mạn
8
- - Suy gan: Không cần chỉnh liều GLP-1 RA, SGLT-2i đối với suy gan nhẹ
hoặc trung bình. Ở BN suy gan nặng, dapagliflozin có thể khởi trị với liều 5
mg, nếu dung nạp có thể tăng lên 10 mg. Empagliflozin không khuyến cáo trên
bệnh nhân suy gan nặng.
j) Giá thuốc, tính sẵn có, sự dung nạp và khả năng chi trả của bệnh nhân
k) Phác đồ sử dụng dễ nhớ, dễ thực hiện và khả năng tuân thủ điều trị của người bệnh
1.2. Enzyme α-glucosidase
1.2.1. Giới thiệu chung về α-glucosidase
Enzyme -glucosidase (E.C.3.2.1.20) là một nhóm các enzyme xúc tác thủy
phân liên kết α-1,4-glycoside bao gồm một số loại như
maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, α-
glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosid hydrolase, α-
1,4-glucosidase, α-D-glucosid glucohydrolase. Đáng chú ý, các enzyme này thủy
phân oligosaccharide nhanh hơn so với polysaccharide.
Enzyme α-glucosidase là một enzyme họ exohydrolysis, có hoạt tính thủy
phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của carbohydrate giải phóng
các phân tử α-D-glucose. Cơ chất phổ biến của enzyme -glucosidase là
oligosaccharide, disaccharide, các aryl- và akyl-α-glucopyranoside, …[41]. Enzyme
-glucosidase là một trong những enzyme thuộc lớp glycoside hydrolase (GH), một
lớp gồm các enzyme thường tách các liên kết glycoside giữa hai phân tử carbohydrate
– một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy trong các polymer tự nhiên. Tốc
độ phân cắt các liên kết glycoside được tăng lên gấp 1017 lần so với phản ứng thông
thường không có enzyme xúc tác [63]. Enzyme α-glucosidase phân bố trong các
họ GH khác nhau như GH4, GH3, GH31, GH63, GH97 [25, 26], trong đó GH3 và
GH31 là hai nhóm chủ yếu của enzyme α-glucosidase. Những enzyme α-glucosidase
thuộc nhóm GH13 được phát hiện nhiều ở vi khuẩn, còn những sinh vật bậc cao hơn
thường có enzyme α-glucosidase thuộc nhóm GH31.
Enzyme α-glucosidase có nguồn gốc đa dạng, từ nhiều loài sinh vật (vi khuẩn,
nấm mốc, động vật và thực vật). Chính nhờ đó, tính đặc hiệu cơ chất của enzyme
cũng đa dạng hơn, và enzyme α-glucosidase được phân chia thành 3 loại dựa trên tính
đa dạng này. Loại 1 là các enzyme α-glucosidase ưu tiên thủy phân các liên kết
heteroside (glycoside) chẳng hạn sucrose và các aryl α-glucoside (ví dụ như p-
9
- nitrophenyl α-D-glucopyranoside - pNPG), hơn là các liên kết holoside, chẳng hạn
như các α-glucobiose, malto-oligosaccharide, and α-glucan). Enzyme loại II và III thì
ngược lại, hoạt động mạnh hơn trên các holoside và có hoạt tính thấp đối với các
heteroside. Enzyme loại III giống loại II, nhưng khác nhau trong quá trình thủy phân
polysaccharide: enzyme loại II có hoạt tính khá thấp trên α-glucan, trong khi loại III
lại có hoạt tính cao [41].
Trong công nghiệp ứng dụng, sinh vật sản xuất chính enzyme α-glucosidase
là vi khuẩn và nấm (Lactobacillus, Bacillus và Aspergillus) [22, 58]. Vi khuẩn ưa
nhiệt tạo ra các chất có hoạt tính α-glucosidase hoạt động ngay cả ở các môi trường
pH trung tính và kiềm, và ở nhiệt độ từ 20- 40°C [32].
1.2.2. Cấu trúc của α-glucosidase
Enzyme α-glucosidase nhóm GH13 và GH31 có những đặc điểm về cấu trúc,
hình thái không gian và hoạt tính sinh học khác nhau, do chúng có sự khác biệt về
nguồn gốc và tính đặc hiệu cơ chất.
Đối với các enzyme -glucosidase GH13, chúng có cấu trúc tương đối giống
với oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10; O16G) và dextran glucosidase (glucan 1,6-
α-glucosidase; EC 3.2.1.70; DG). Cho đến nay, cấu trúc không gian của enzyme α-
glucosidase GH13 đã được xác định qua nhiều nghiên cứu, và cấu trúc tổng thể của
chúng tương tự nhau, chủ yếu được hình thành từ 3 domain A, B và C [41] (Hình
1.3a, b).
Hình 1.3. Cấu trúc không gian 3D của enzym α-glucosidase GH13 [41]
Chú thích: A. Cấu trúc tổng quan của phức hợp Halomonas sp. α-glucosidase và
maltose, B. Cấu trúc tổng quan của phức hợp Streptococcus mutans DG và
isomaltotriose
10
- Đối với các enzyme - glucosidase nhóm GH31, hầu hết chúng phổ biến ở các
sinh vật phụ thuộc vào tinh bột như một nguồn năng lượng chính trong cơ thể. Ví dụ,
sucrase–isomaltase (SI) và maltase – glucoamylase (MGAM), được tiết ra tại ruột
non của động vật có vú, có liên quan đến sự phân hủy tinh bột trong khẩu phần ăn. SI
và MGAM chịu trách nhiệm thủy phân các oligo-saccharide thu được thành glucose.
Mỗi polypeptit MGAM và SI bao gồm 2 thành phần enzyme khác nhau, tạo ra tổng
số 4 α-glucosidase trong cấu trúc 2 enzyme này. Bốn enzyme có cấu trúc liên quan
chặt chẽ với nhau do phát triển từ một nguồn gốc chung, đều được xếp vào họ
glycoside hydrolase GH31 và có quan hệ mật thiết với nhau theo cấu trúc nếp gấp.
Về danh pháp, vùng maltase của MGAM được gọi là NtMGAM và vùng
glucoamylase được gọi là CtMGAM. Đối với SI, vùng isomaltase là NtSI và vùng
sucrase là CtSI [46]. NtMGAM và CtMGAM giống nhau đều chịu trách nhiệm chính
trong việc thủy phân các liên kết α-(1→4) nhưng khác nhau ở chỗ chúng thể hiện các
ưu tiên khác nhau đối với các cơ chất có mức độ polyme hóa (DP) khác nhau:
CtMGAM thích thủy phân các cơ chất có giá trị DP cao hơn NtMGAM [45]. NtSI có
xu hướng thủy phân của các liên kết α-(1→6)-glucosidic [51]. CtSI có thể thủy phân
các liên kết α- (12) trong sucrose [29].
Hình 1.4. Cấu trúc không gian 3D của enzyme α-glucosidase GH31 [41] (A.
Mô hình cấu trúc của NtMGAM; B. Vùng hoạt động của NtMGAM)
1.2.3. Cơ chế hoạt động của enzyme α-glucosidase trong cơ thể
Khi con người đưa thức ăn vào đường tiêu hóa, các phân tử cacbohydrate trong
thức ăn sẽ được thủy phân, chia cắt thành các phân tử nhỏ bởi hệ enzyme trong ruột
11
- non. Cụ thể, các sản phảm giàu tinh bột, dạng glucid chính trong khẩu phần ăn sau
khi qua dạ dày sẽ được enzyme α-amylase tiết từ tuyến tụy và nước bọt thủy phân
thành các malto-oligosaccharid, chẳng hạn như maltose, maltotriose, và các malto-
oligosaccharid mạch ngắn có các nhánh α-(1-6) [41]. Enzyme α-glucosidase được tiết
ra từ diềm bàn chải tế bào ruột non, lại tiếp tục phân hóa các oligosaccharide thành
các phân tử đường glucose nhỏ hơn rồi mới thẩm thấu qua màng ruột vào mạch bạch
huyết rồi cuối cùng đổ về hệ tuần hoàn.
Chính nhờ cơ chế này, việc ức chế hoạt động của enzyme α-glucosidase có thể
làm hạn chế quá trình thủy phân carbohydrate và làm giảm, làm chậm sự thẩm thấu
glucose vào máu [3, 8].
1.3. Chất ức chế α-glucosidase
1.3.1. Giới thiệu và cơ chế hoạt động của chất ức chế enzyme α-glucosidase
Chất ức chế enzyme α-glucosidase (α-glucosidase inhibitors-AGIs) là các chất
làm giảm hoạt tính của enzyme α-glucosidase dẫn đến làm chậm quá trình tiêu hóa
các chất carbohydrate thành đường đơn glucose ở ruột non, từ đó ngăn hiện tượng
tăng đường huyết sau ăn.
Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của các chất ức chế enzyme α-glucosidase tại
ruột non (AG: α-glucosidase; AGI: chất ức chế enzyme α-glucosidase)
Phần lớn AGIs có khả năng gắn vào vùng liên kết với carbohydrate của
enzyme -glucosidase vì chúng có cấu trúc tương tự với các disaccharide hoặc
oligosaccharide. Các phức hợp này có ái lực lớn hơn phức hợp thông thường
12
nguon tai.lieu . vn