- Trang Chủ
- Y khoa - Dược
- Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng ở Tây Bắc
Xem mẫu
- ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC
ĐẶNG THỊ THUỲ
CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN
SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP
(PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.)
THU HÁI Ở TÂY BẮC
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC
HÀ NỘI - 2018
- U
VN
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC
c y,
ma
ĐẶNG THỊ THUỲ
r
ha
dP
CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN
an
SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP
(PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.)
ne
THU HÁI Ở TÂY BẮC
ici
ed
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC
M
of
Khoá: QH.2013.Y
ol
Ngƣời hƣớng dẫn:
ho
Sc
1. TS. NGUYỄN HỮU TÙNG
2. ThS. NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH
t@
gh
p yri
Co
HÀ NỘI - 2018
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- U
LỜI CẢM ƠN
VN
Trong quá trình thực hiện khoá luận tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ từ
các thầy cô, bạn bè và gia đình.
y,
Lời đầu tiên, với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời
c
ma
cảm ơn đến TS. Nguyễn Hữu Tùng, giảng viên bộ môn Hoá dƣợc và Kiểm nghiệm
thuốc Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời thầy đã hết lòng chỉ bảo,
r
hƣớng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
ha
Tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn chân thành đến các thầy cô trong Khoa Y
dP
Dƣợc Đại học Quốc gia Hà Nội, nhất là Ths. Nguyễn Thị Hoàng Anh, đã tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và làm khoá luận.
an
Và tôi cũng xin cảm ơn chị Thuỷ- Khoa Dƣợc trƣờng Đại học y dƣợc Thái
ne
Nguyên, chị Huệ và các bạn Phƣợng, Chuyên, Phƣơng- Khoa Y Dƣợc trƣờng Đại
học Quốc gia Hà Nội đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua.
ici
ed
Lời cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên tôi giúp đỡ
động viên tôi trong học tập và cuộc sống.
M
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể tránh khỏi những thiếu
of
sót. Tôi rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn.
ol
Tôi xin chân thành cảm ơn!
ho
Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2018
Sc
Sinh viên
t@
Đặng Thị Thuỳ
gh
p yri
Co
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- U
MỤC LỤC
VN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
y,
ĐẶT VẤN ĐỀ ...........................................................................................................1
c
ma
Chƣơng 1 - Tổng quan ..............................................................................................2
1.1. Tổng quan chung về sâm vũ diệp ...............................................................2
1.1.3. Đặc điểm thực vật, bộ phận dùng ...........................................................2
r
ha
1.1.4. Phân bố và sinh thái ................................................................................3
1.1.5. Tác dụng dƣợc lý ....................................................................................3
dP
1.1.7. Thành phần hoá học ................................................................................4
1.2. Tổng quan các phƣơng pháp sắc ký ..........................................................6
an
1.2.1. Sắc ký cột ................................................................................................6
1.2.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ..........................................................................7
1.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................................................8
ne
1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc...................................9
ici
1.3.1. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ................................9
1.3.2. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS) .................................................10
ed
Chƣơng 2 - Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu ............................................11
M
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................11
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ............................................................................11
of
2.2.1. Dung môi, hoá chất ...............................................................................11
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................12
ol
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................12
2.3.1. Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu ..........................................................12
ho
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hoá học .....................12
Sc
2.3.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất ..........................12
2.3.4. Phƣơng pháp phân tích định tính các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu
t@
năng cao ..............................................................................................................13
Chƣơng 3- Kết quả thực nghiệm và bàn luận ......................................................13
gh
3.1. Chiết xuất và tinh chế các hợp chất saponin từ thân rễ SVD ...............13
3.1.1. Chiết xuất và phân lập ..........................................................................13
yri
3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết hai chất phân lập đƣợc bằng SKLM .................15
3.2. Xác định cấu trúc của 2 saponin phân lập đƣợc.....................................16
p
3.2.1. Hợp chất số 1 ........................................................................................16
Co
3.2.2. Hợp chất số 2 ........................................................................................19
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- U
3.3. Phân tích định tính và dấu vân tay hoá học của các hợp chất bằng sắc
VN
ký lỏng hiệu năng cao ..........................................................................................22
Chƣơng 4 - Bàn luận ...............................................................................................23
4.1. Về xử lý chiết mẫu và phân lập chất tinh khiết ......................................23
y,
4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất ................................................................24
4.3. Xây dựng dấu vân tay sắc ký dƣợc liệu SVD bằng HPLC ....................24
c
ma
Chƣơng 5 - Kết luận và kiến nghị ..........................................................................25
5.1. Kết luận ......................................................................................................25
r
5.2. Kiến nghị ....................................................................................................26
ha
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
dP
an
ne
ici
M ed
of
ol
ho
Sc
t@
gh
p yri
Co
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- U
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
VN
13
C-NMR Carbon 13 nuclear magnetic resonance
DEPT DEPT
y,
IR Infrared
c
HPLC High performance liquid chromatography
ma
1
H-NMR Proton nuclear magnetic resonance
r
MS Mass spectrum
ha
NMR Nuclear magnetic resonance
dP
Rf Retardation factor
RP18 Reversed Phase 18
an
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TLC Thin layer chromatography
ne
UV Ultra violet
VIS Visible
ici
Med
of
ol
ho
Sc
t@
gh
p yri
Co
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- U
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
VN
Tên hình Trang
Hình 1. Cấu trúc hoá học của 10 saponin tách đƣợc từ thân rễ 5
y,
SVD
c
Hình 2. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại 11
ma
Sapa, Lào Cai 15/07/2016
r
Hình 3. Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng 14
ha
Hình 4. Sơ đồ phân lập sắc ký 2 hợp chất tinh khiết từ phân 15
dP
đoạn BuOH
Hình 5. Sắc ký đồ của chất số 1 và số 2 phân lập đƣợc sau khi 15
an
phun thuốc thử H2SO4 10% /EtOH
Hình 6. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 1 19
ne
Hình 7. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 2 22
ici
Hình 8. Sắc ký đồ HPLC của hai saponin phân lập đƣợc 1 23
(A), 2 (B) và cao butanol của SVD
M ed
of
ol
ho
Sc
t@
gh
p yri
Co
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- U
DANH MỤC CÁC BẢNG
VN
Tên bảng Trang
Bảng 1. Các hợp chất saponin đã phân lập từ SVD 5
y,
Bảng 2. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR, DEPT của hợp chất 16
c
số 1
ma
Bảng 3. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất số 2 19
r
ha
dP
an
ne
ici
M ed
of
ol
ho
Sc
t@
gh
p yri
Co
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- ĐẶT VẤN ĐỀ
U
Việt Nam là vùng đất của nhiều các loài thảo dƣợc quý đặc biệt là các loài
VN
thuộc chi sâm. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một cây thuốc quý
thuộc chi Sâm (Panax) đang đƣợc sử dụng trong các bài thuốc truyền thống và có
y,
tiềm năng để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe nhƣ các loài khác cùng
c
chi. Gần đây sâm vũ diệp đƣợc thuần hoá và bƣớc đầu đƣợc trồng thử nghiệm ở một
ma
số địa phƣơng nhƣ Hà Giang và Lào Cai [1; 13]. Về mặt y học, thân rễ sâm vũ diệp
đã đƣợc sử dụng làm thuốc bổ và có mặt trong một số bài thuốc truyền thống của
r
ha
các dân tộc vùng núi Tây Bắc.
Ở Việt Nam và thế giới, tổng quan tài liệu thấy rằng không có nhiều các
dP
nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng sinh học của dƣợc liệu sâm vũ diệp.
Vì vậy, việc nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hoá học và tác dụng
sinh học để thu thập thêm bằng chứng khoa học và nâng cao hiệu quả sử dụng loại
an
dƣợc liệu quý này hứa hẹn nhiều kết quả có giá trị khoa học và thực tiễn. Năm 2017
vừa qua, nhóm nghiên cứu của Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc Gia Hà Nội đã thực
ne
hiện nghiên cứu bƣớc đầu về thành phần hoá học của thân rễ cây sâm vũ diệp thu
ici
hái ở Sapa, Lào Cai với 3 hợp chất phân lập đƣợc từ phân đoạn ít phân cực ethyl
acetat [7; 8]. Tiếp nối nghiên cứu trên chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu
ed
thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng ở
M
Tây Bắc”. Kết quả của đề tài sẽ góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần hoá
học, từ đó làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn nhƣ định tính định lƣợng cũng
of
nhƣ nghiên cứu về tác dụng sinh học của loài sâm này.
Mục tiêu của đề tài bao gồm:
ol
1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất saponin chính ở phân đoạn n-butanol
ho
của thân rễ của sâm vũ diệp.
2. Xác định cấu trúc hoá học của các saponin phân lập đƣợc
Sc
3. Xây dựng dấu vân tay sắc ký sâm vũ diệp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Đề tài này là một phần trong đề tài cấp Nhà nƣớc thuộc Chƣơng trình Tây
t@
Bắc “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu
và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam
gh
thất hoang (Panax stipuleanatus H. Tsai et K.M.)”, mã số: KHCN-TB.07C/13-18.
p yri
Co
1
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- Chƣơng 1 - Tổng quan
U
1.1. Tổng quan chung về sâm vũ diệp
VN
1.1.1. Tên khoa học, tên đồng danh
Sâm vũ diệp còn có tên khác là vũ diệp tam thất, hoa diệp tam thất, trúc tiết
y,
nhân sâm, tam thất lá xẻ, sâm hai lần xẻ, phan xiết (Dao), hoàng liên thất, nữu tử
thất, tam thất lá lông chim, hƣơng sơn tam thất (Trung Quốc) có tên khoa khoa học
c
ma
là Panax bipinnatifidus Seem. [1; 12].
Một số tên đồng danh của SVD:
r
Aralia bipinnatifida (Seem.) C. B. Clarke; Aralia quinquefolia (L.) Dec. et
ha
Plan.var.major Burk; Aralia quinquefolia (L.) Dec.et Plan.var.elegantior Burk;
Panax pseudoginseng Wall.var.bipinnatifidus (Seem.) Li; Panax pseudoginseng
dP
Wall. var. major (Burk.) Li; Panax major Ting ex Pei; Panax pseudoginseng Wall.
spp. Himalaicus Hara; Panax pseudoginseng Wall.var.elegantior (Burk) Hoo et
an
Tseng; Panax Japonicus Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng [12].
1.1.2. Vị trí phân loại [2]
ne
Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), SVD thuộc chi
Nhân sâm (Panax L.), họ Ngũ gia bì (Araliaceae)
ici
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
ed
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
M
Bộ Hoa tán (Apiales)
of
Họ Ngũ gia bì (Araliaceae)
Chi Nhân sâm (Panax L.)
ol
ho
1.1.3. Đặc điểm thực vật, bộ phận dùng
Cây thân thảo sống nhiều năm. Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do
Sc
thân rụng hàng năm để lại. Thân khí sinh mảnh, cao 20-30 cm, thƣờng đơn độc,
mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thƣờng lụi tàn vào mùa đông, mọc chồi thân
t@
mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dƣơng lịch. Lá kép chân vịt, gồm 2-3 cái mọc
vòng. Lá chét 5-7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5-14 cm, rộng 1,5-4 cm, gốc tròn, đầu thuôn
thành mũi nhọn, xẻ thuỳ không đều, mép có răng cƣa, có lông.
gh
Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5-10 cm; cụm hoa có từ 20-
yri
90 hoa; cuống hoa mảnh dài 1-1,5 cm. Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn ở
ngọn thân, 5 cánh hoa, bầu 2-3 ô. Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, đƣờng kính 0,6-1,2
p
cm, khi chín màu đỏ, có chấm đen to ở đầu, chứa 1-2 hạt. Hạt hình cầu hoặc gần
Co
2
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [1; 5; 12; 13]. Bộ phận dùng: dƣợc liệu là
U
thân rễ SVD [1].
VN
1.1.4. Phân bố và sinh thái
Trong tự nhiên SVD phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nepan (vùng cận
Hymalaya) và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nƣớc ta. Sapa ở Việt Nam cũng là
y,
điểm phân bố cuối cùng của SVD ở phía nam. Năm 1973, cây đã đƣợc phát hiện ở
c
núi Hàm Rồng, sát thị trấn Sapa, ở độ cao 1600 m. Hiện nay vùng phân bố của Sâm
ma
vũ diệp đã bị thu hẹp dần, từ độ cao khoảng 1800 m trở lên, cây đƣợc coi là cực
hiếm. Gần đây SVD đã đƣợc thuần hoá và bƣớc đầu đƣợc trồng thử nghiệm ở một
r
ha
số địa phƣơng ở Hà Giang, Lào Cai. Đây là một loài quý hiếm và đang đứng trƣớc
nguy cơ tuyệt chủng cao ở Việt Nam [1; 13].
dP
SVD là loài thân thảo ƣa bóng và đặc biệt ƣa ẩm, thƣờng mọc rải rác hay tập
trung dƣới tán rừng ẩm, gần nhƣ quanh năm có sƣơng mù. Hàng năm vào cuối
an
tháng 2 và đầu tháng 3 từ phần đầu mầm rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ
mọc lên một hoặc một vài chồi thân (tuỳ thuộc vào số lƣợng đầu mầm ở rễ). Chồi
ne
này thƣờng sinh trƣởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt đƣợc chiều
cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa. Quả xanh
ici
quan sát đƣợc vào cuối tháng 4-6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống quanh gốc
ed
cây mẹ. Do quả chín đúng vào thời kỳ có lƣợng mƣa lớn tháng 7-8 nên hạt giống
thƣờng bị cuốn trôi, ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của SVD. Sau khi
M
quả chín, từ tháng 9-10, toàn bộ phần thân trên mặt đất tàn lụi qua mùa đông, để lộ
những vết sẹo thân rễ khá rõ. Đó là dấu hiệu giúp ta xác định tuổi của cây [1].
of
1.1.5. Tác dụng dƣợc lý
ol
SVD có tác dụng gây động dục, hƣớng sinh dục, liều thấp có tác dụng làm
ho
giảm thời gian ngủ do phenobarbital, tăng sức dẻo dai cho cơ thể và tán huyết [1].
Năm 2016, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt
Sc
tính diệt tế bào ung thƣ từ 57 cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Quốc,
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một trong số những loài thể hiện hoạt
t@
tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thƣ [24].
Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngƣng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân
đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn ethylacetat
gh
có tác dụng ở các mức liều: 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 5 mg/mL, phân đoạn
yri
ether ở các mức liều 1-2-5 mg/mL [15].
1.1.6. Tính vị và công dụng
p
Co
3
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dƣỡng huyết, hoạt lạc,
U
chỉ huyết, tán ứ.
VN
Theo đông y, SVD có tác dụng bổ, chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu, nhất là
đối với phụ nữ sau đẻ. SVD còn đƣợc dùng cầm máu, tán ứ, tiêu sƣng. Dùng ngoài, rễ
phơi khô, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết thƣơng mau lành. Rễ cây SVD
y,
còn đƣợc ngâm rƣợu rồi chiết dƣới dạng tinh sâm dùng rất tốt, có tác dụng kích thích
c
sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao, cao này
ma
pha với nƣớc hoặc rƣợu để uống cũng có tác dụng nhƣ rễ. Ở Trung Quốc, SVD là
thuốc chữa hƣ lao thổ huyết, chảy máu cam, đòn ngã tổn thƣơng [1; 5].
r
ha
1.1.7. Thành phần hoá học
Rễ SVD chứa saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất nhƣ:
dP
chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginseninosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1, và Rg2
[1].
an
Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố 13 saponin từ lá của loài
sâm vũ diệp Panax japonicus var. bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng thu hái ở dãy núi
ne
Tần Lĩnh, Thiểm Tây, Trung Quốc. Trong đó có hai saponin mới là bipinnatifidusoside
F1 và F2 và 11 saponin đã biết trƣớc đó gồm ginsenoside F1, F2, F3, Rg2, Re, Rd,
ici
Rb1, Rb3, 24S-pseudoginsenoside F11, panasenoside và majoroside F1. Cấu trúc của
ed
hai saponin mới đã đƣợc xác định là dammar-25(26)-ene-3-beta, 12 beta, 20(S), 24
zeta-tetraol-(20-O-beta-D-glucopyranosyl)-3-O-beta-D-glucopyranosyl (1-2)-beta-D-
M
glucopyranoside (bipinnatifidusoside F1) và dammar-22(23)-ene-3-beta, 12 beta, 20
(S), 24-zeta-tetraol-(20-O-beta-D-glucopyranosyl)-3-O-beta-D-glucopyranosyl (1-2)-
of
beta-D-glucopyranoside (bipinnatifidusoside F2) [26].
ol
Năm 2002, nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự đã chỉ ra rằng trong
ho
thân rễ của SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen, saponin cùng với
acid béo, acid amin. Đồng thời bằng cách thuỷ phân saponin rồi kết tinh sapogenin
Sc
toàn phần thu đƣợc acid oleanolic [9; 10].
Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc phân lập đƣợc 10 saponin
t@
khung oleanan từ dịch chiết MeOH của rễ cây SVD (hình 1), bao gồm 3 hợp chất
mới bifinoside A-C (1-3) và 7 hợp chất đã biết bao gồm nacrissiflorine methyl este
(4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenoside RP1 methyl este (6),
gh
stipuleanoside R1 (7), pseudoginsenoside RT1 methyl este (8), mormordin IIe (9)
yri
và stipuleanoside R2 methyl este (10) [25].
p
Co
4
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- U
VN
c y,
r ma
ha
dP
an
ne
Hình 1. Cấu trúc hoá học của 10 saponin tách được từ rễ SVD
ici
Năm 2017, Đỗ Văn Hào và cộng sự đã phân lập đƣợc 3 hợp chất từ phân
đoạn ethylacetat của thân rễ SVD. Các hợp chất đó là β-sitosterol, oleanolic acid và
ed
daucosterol [7].
M
Bảng 1. Các hợp chất saponin đã phân lập từ SVD
STT Hợp chất TLTK
of
1 Chikusetsusaponin IV [25]
ol
2 Zingibrosid R1 [26]
ho
3 Ginsenoside Ro [26]
4 Ginsenoside F1 [26]
Sc
5 Ginsenoside F2 [26]
t@
6 Ginsenoside F3 [26]
7 Ginsenoside Rb1 [26]
gh
8 Ginsenoside Rd [26]
9 Ginsenoside Rg1 [26]
yri
10 Ginsenoside Rg2 [26]
p
11 Ginsenoside Rb3 [26]
Co
5
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- 12 Ginsenoside Re [26]
U
13 24-S-pseudoginsenoside F11 [26]
VN
14 Panasenoside [26]
15 Majoroside F1 [26]
y,
16 Bipinnatifidusoside F1 [26]
c
ma
17 Bipinnatifidusoside F2 [26]
18 Bifinoside A [25]
r
19 Bifinoside B [25]
ha
20 Bifinoside C [25]
dP
21 Nacrissiflorine methyl este [25]
22 Pseudoginsenoside RP1 methyl este [25]
an
23 Pseudoginsenoside RT1 methyl este [25]
24 Stipuleanoside R1 [26]
ne
25 Stipuleanoside R2 methyl este [26]
ici
26 Mormordin IIe [25]
ed
Nhƣ vậy cho tới hiện tại đã có 26 hợp chất saponin đƣợc phân lập từ SVD
M
Nhận xét chung: qua các nghiên cứu về thành phần hoá học của SVD chúng
tôi thấy rằng saponin chiếm hàm lƣợng chủ yếu trong thân rễ SVD. Do đó chúng tôi
of
lựa chọn nghiên cứu thành phần saponin, cụ thể là ở phân đoạn n-butanol (phân
ol
đoạn giàu saponin nhất).
1.2. Tổng quan các phƣơng pháp sắc ký
ho
1.2.1. Sắc ký cột
Sc
Pha tĩnh là những hạt có kích thƣớc tƣơng đối lớn (50-150 µm), đƣợc nạp
trong cột thuỷ tinh. Mẫu chất cần phân tích đƣợc đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh
t@
(có một lớp thuỷ tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi
giải ly đƣợc đặt trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dƣới cột đƣợc
hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Phƣơng pháp này thƣờng làm
gh
cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy
vậy sắc ký cột cũng có ƣu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ dễ kiếm, có thể triển khai
yri
với một lƣợng mẫu tƣơng đối lớn. Các bƣớc thực hiện sắc ký cột gồm:
p
Co
6
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- + Lựa chọn chất hấp phụ: pha tĩnh là silicagel loại thƣờng, hợp chất không
U
phân cực đƣợc giải ly khỏi cột trƣớc, hợp chất phân cực đƣợc giải ly sau. Với 2
VN
phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng lƣợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực
mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ laị trong cột nên di chuyển ra khỏi cột
chậm hơn so với các phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với
y,
phân tử tuy có tính phân cực.
c
+ Lựa chọn dung môi: Mẫu sắc ký đƣợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi
ma
phù hợp với nồng độ 10 mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản
r
mỏng 2,5x10 cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5 µl dung dịch
ha
(A). Mỗi bản mỏng đƣợc triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó
phát hiện bằng đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy đƣợc
dP
dung môi nào phù hợp. Từ kết quả đó, tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một
dung môi phân cực và một dung môi kém phân cực.
an
+ Nạp chất hấp phụ dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên
giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Cho chất
ne
hấp thụ dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vừa
gõ nhẹ vào thành cột. Khi lớp chất hấp phụ đạt đƣợc chiều cao khoảng 2 cm trong
ici
cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dƣới để cho dung môi chảy ra, hứng vào một bình trống
ed
để bên dƣới cột, dung môi này sẽ đƣợc rót lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong, cho
dung môi chảy qua chất hấp phụ vài lần đến khi chất hấp phụ trong cột đồng nhất.
M
+ Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu dạng
rắn thì hoà tan chất vào trong một lƣợng nhỏ dung môi. Loại dung môi cho khởi đầu
of
sắc ký.
ol
+ Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa đƣợc hứng bằng
ho
ống thuỷ tinh. Dịch rửa giải trong các ống đƣợc gom lại dựa vào kết quả phân tích
sắc ký lớp mỏng [4; 6; 16;18].
Sc
1.2.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
- Nguyên tắc:
t@
Dựa vào hệ số phân tách khác nhau của chất cần phân tích giữa 2 pha: pha
động và pha tĩnh. Chất cần phân tích đƣợc hấp phụ (hoặc phân bố hoặc trao đổi ion)
trên pha tĩnh, pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần phân tích.
gh
Các thành phần sau khi đƣợc phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp đƣợc lƣu giữ trên
yri
pha tĩnh.
Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thƣờng (nếu các
p
chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bƣớc sóng 254 nm, 366 nm
Co
7
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- hoặc phun thuốc thử hiện màu hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị densitometer
U
(một thiết bị đo cƣờng độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hặc khả kiến của chất cần phân
VN
tích). Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các
phƣơng pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích.
Các đại lƣợng đặc trƣng
y,
-
+ Hệ số lƣu giữ Rf
c
Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số
ma
lƣu giữ Rf. Trị số của nó đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách dịch chuyển của
chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
r
ha
(1)
dP
Trong đó: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)
là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha
động (cm) (đo trên cùng đƣờng đi của vết)
an
có giá trị dao động giữa 0 và 1
+ Hệ số lƣu giữ tƣơng đối
ne
:
(2)
ici
Trong đó: là đƣờng đi của chất phân tích (cm)
ed
là đƣờng đi của chất chuẩn (cm)
(giá trị càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất)
M
[4; 6; 16; 17].
of
1.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
a. Nguyên tắc của HPLC
ol
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở sự phân
ho
tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động
dƣới áp suất cao. Pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn
Sc
dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất
mang đã đƣợc liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ.
t@
Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc
phân loại theo kích cỡ. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của
gh
chúng giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của chất này với pha tĩnh và
yri
pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bằng detector. Nếu ghi quá
p
trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic.
Co
8
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng
U
biệt đƣợc tách ra trên sắc ký đồ
VN
b. Ứng dụng của phƣơng pháp HPLC
- Định tính: dựa vào thời gian lƣu, hình dạng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn,
y,
hoặc chồng phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử
c
- Xác định tạp chất: dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu thử, trên sắc ký đồ
ma
không có pic tại thời gian lƣu của tạp chất khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện
- Định lƣợng: dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao
r
hoặc diên tích pic của nó [4; 14; 18].
ha
1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc
dP
1.3.1. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
a. Nguyên tắc
Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính đƣợc đặt trong từ trƣờng, khi thay đổi từ
an
trƣờng sẽ dẫn đến hấp thụ năng lƣợng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng
hƣởng từ hạt nhân.
ne
Những hạt nhân nguyên tử có khối lƣợng là số lẻ và những hạt nhân nguyên
tử có khối lƣợng là số chẵn nhƣng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và
ici
cho tín hiệu NMR. Các hạt nhân nguyên tử có khối lƣợng và số thứ tự nguyên tử là
ed
những số chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR. Vị trí của tín
hiệu cộng hƣởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân
M
cận quanh proton đó.
of
b. Các đại lƣợng đặc trƣng
- Độ chuyển dịch hoá học: sự khác nhau về vị trí hấp thụ giữa proton của
ol
mẫu phân tích và của chất chuẩn đƣợc gọi là độ chuyển dịch hoá học (δ).
ho
( )
( ) (3)
Sc
Trong đó:
t@
δ: độ chuyển dịch hoá học
νmau: tần số của mẫu phân tích
νTMS: tần số của mẫu chuẩn tetramethylsilane
gh
νmay: tần số làm việc của máy
yri
- Hằng số tƣơng tác spin
p
Co
9
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- Khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội đƣợc biểu hiện bằng Hz, đặc
U
trƣng cho sự tƣơng tác gọi là hằng số tƣơng tác spin (J). Trị số J phụ thuộc vào
VN
tƣơng quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2 proton tƣơng tác.
- Diện tích dƣới tín hiệu
Diện tích dƣới tín hiệu tỷ lệ với số lƣợng proton cho tín hiệu đó. Đƣờng
y,
cong tích phân diện tích dƣới tín hiệu cho biết số lƣợng tƣơng đối của proton cho tín
c
ma
hiệu.
c. Ứng dụng của phổ NMR
Bằng cách xác định độ chuyển dịch hoá học δ, hằng số tƣơng tác J và diện
r
ha
tích dƣới tín hiệu ngƣời ta có thể biện giải phổ và kết hợp với các thông tin của các
loại phổ khác nhƣ IR, MS từ đó xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ
dP
[3; 4; 17].
1.3.2. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS)
an
a. Nguyên tắc
Dùng chùm điện tử có năng lƣợng trung bình (50-100 eV) để bắn phá phân
ne
tử hữu cơ ở môi trƣờng chân không cao (10-3- 10-6mmHg). Trong quá trình đó chất
hữu cơ bị ion hoá và bị phá vỡ thành các mảnh. Các ion đƣợc tạo thành trong buồng
ici
ion hoá, đƣợc gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trƣớc khi đến
ed
detector. Tín hiệu tƣơng ứng với các ion sẽ đƣợc thể hiện bằng một số vạch (pic) có
cƣờng độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối.
M
b. Ứng dụng
- Xác định các đồng vị: Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có
of
cùng số điện tích hạt nhân chỉ khác nhau về số neuron trong nhân đó nên khối lƣợng
ol
nguyên tử khác nhau. Có thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của các
ho
nguyên tố trong mẫu.
- Định tính:
Sc
+ Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lƣợng các ion phân tử
M+, (M+1)+, (M+2)+, đây là các đặc trƣng quan trọng của hợp chất hoá học. Bên
t@
cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cƣờng độ của chúng cùng với khối
lƣợng của các mảnh ion có thể xác định công thức nguyên của chất phân tích.
gh
+ Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thƣ viện phổ có trong máy hoặc phổ
nghiên cứu với phổ chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu.
yri
- Xác định công thức cấu tạo: để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên
p
cứu cần dùng kỹ thuật ion hoá thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều
Co
10
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng. Việc biện giải phổ nên kết hợp với
U
phổ NMR và phổ IR.
VN
- Định lƣợng: phân tích định lƣợng khối phổ tƣơng tự nhƣ các kỹ thuật khác
dùng cách thiết lập đƣờng chuẩn hoặc thêm đƣờng chuẩn cùng với độ cƣờng độ
vạch phổ để xác định nồng độ [3; 4; 17].
c y,
ma
Chƣơng 2 - Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
r
Mẫu nghiên cứu là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) đƣợc
ha
thu hái ở Sa a, Lào Cai vào tháng 15-07-2016 và đƣợc giám định tên khoa học bởi
dP
TS. Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu. Mẫu dƣợc
liệu (DL-150716) đƣợc lƣu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu-
Viện Dƣợc liệu.
an
ne
ici
M ed
of
Hình 2. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)
ol
thu hái tại Sa Pa, Lào Cai 15/07/2016
ho
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
Sc
2.2.1. Dung môi, hoá chất
Dung môi dùng trong chiết xuất phân lập nhƣ ethanol (EtOH), methanol
t@
(MeOH), dicloromethan (CH2Cl2), chloroform (CHCl3), ethyl acetat (EtOAc), n-
butanol (BuOH) đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và đƣợc cất lại trƣớc khi dùng.
Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel (0,040 – 0,063 mm, Nacalai Tesque
gh
Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50 µm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản).
Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thƣờng Kiesel 60 F254 và pha đảo
yri
TLC silica gel 60 RP-18 F254 S (Merk, Damstadt, Đức).
p
Co
11
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc
U
thử là dung dịch H2SO4 10 % trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất.
VN
Dung môi chạy sắc ký HPLC (methanol, acetonitrile, acid acetic) của Merk,
Đức, nƣớc cất dùng cho phân tích.
y,
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ
- Máy Jasco DIP-360 digital polarimeter (Jasco, Nhật Bản): đo năng suất
c
ma
quay cực
- Máy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản): đo điểm nóng chảy
r
- Máy AGILENT 1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies,
ha
Hoa Kỳ): đo phổ khối ion hoá phun mù điện tử (ESI-MS)
- Máy JEOL ECX 400 (Jeol, Nhật Bản): đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
dP
một và hai chiều, sử dụng dung môi CDCl3/CD3OD, chất nội chuẩn là
tetramethylsilan (TMS)
an
- Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ)
với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động
ne
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu
ici
- Phƣơng pháp chiết mẫu: chiết hồi lƣu đơn giản với dung môi ethanol 70
ed
%/nƣớc
- Phƣơng pháp chiết phân đoạn: chiết lỏng lỏng
M
Quy trình: Thân rễ sâm vũ diệp đƣợc chiết hồi lƣu 3 lần với ethanol 70 % ở
70ºC. Tiến hành lọc loại bỏ bã dƣợc liệu, gộp dịch lọc, sử dụng máy cô quay chân
of
không dƣới áp suất giảm tại 50ºC thu đƣợc cao khô. Cao khô này đem phân tán
ol
trong nƣớc rồi lắc lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực khác nhau (ete, ethyl
ho
acetat và butanol), thu đƣợc các phân đoạn tƣơng ứng.
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hoá học
Sc
Sử dụng các kỹ thuật sắc ký bao gồm:
- Sắc ký cột: cột nhồi silica gel pha thƣờng và pha đảo
t@
- Sắc ký lớp mỏng: để theo dõi quá trình phân lập, kiểm tra độ tinh khiết
của chất phân lập
2.3.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
gh
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc dựa trên các phƣơng pháp phổ
yri
bao gồm: phổ khối lƣợng (ESI-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) kết hợp so
sánh dữ liệu phổ thu đƣợc với các dữ liệu phổ đã đƣợc công bố trong các tài liệu
p
tham khảo.
Co
12
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
nguon tai.lieu . vn
