Xem mẫu

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN ANH ĐỨC GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA BỘ PHẬN LÁ CỦA SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidius Seem.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà nội 2020
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN ANH ĐỨC GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA BỘ PHẬN LÁ CỦA SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidius Seem.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS. NGUYỄN HỮU TÙNG Người hướng dẫn 2: ThS. NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH Hà Nội-2020
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ vô cùng quý báu của thầy cô giáo của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với gia đình và bạn bè. Trước hết, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Thị Hoàng Anh - Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội và PGS. TS Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Dược, Đại học Phenikaa; những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong Khoa Y Dược đặc biệt là Bộ môn Hóa Dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này. Lời cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập và đạt được kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Anh Đức
  4. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ........................................................................................... 3 1.1.Tổng quan về Sâm vũ diệp ..................................................................................... 3 1.1.1. Tên khoa học, tên đồng danh .......................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật............................................................................................ 3 1.1.3. Phân bố và sinh thái ........................................................................................ 4 1.1.4. Thành phần hóa học ........................................................................................ 5 1.1.5. Tính vị, công năng ......................................................................................... 12 1.1.6. Công dụng ..................................................................................................... 12 1.1.7. Tác dụng dược lý ........................................................................................... 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 14 2.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................. 14 2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 15 2.4.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất ........................................................... 15 2.4.2. Phương pháp phân lập các hợp chất hóa học............................................... 15 2.4.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập ...................... 16 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................................... 17 3.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất tinh khiết .................................................. 17 3.2. Đặc điểm vật lý và dữ liệu phổ của araloside A phân lập được ........................ 18 3.3. Biện giải cấu trúc của saponin stipuleanosid phân lập được: ........................... 24 3.4. Bàn luận .............................................................................................................. 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................... 28
  5. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BuOH n-butanol 13 C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13) DAD Diode array detector (Detector mảng diod) DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ĐHQGHN Đại học Quốc gia Hà Nội ESI-MS Eletrospray Ionization Mass Spectroscopy EtOH Ethanol EtOAc Ethyl acetat 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) HPLC High performace liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) MeOH Methanol MS Mass spectrum (Phổ khối) NMR Nuclear Magetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) P. Panax SKLM Sắc ký lớp mỏng Rha α-ʟ-rhamnopyranosyl v/v Thể tích/ thể tích
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Axit béo trong SVD 9 2 Bảng 1.2. Axit amin trong SVD 10 3 Bảng 1.3. Nguyên tố đa lượng và vi lượng 10 4 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 1H, 13C, DEPT phần aglycon của 20 chất F223 5 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H, 13C, DEPT phần đường của chất 22 F223
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1. Hình ảnh cây Sâm vũ diệp 3 2 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 10 saponin được tách 7 từ rễ SVD 3 Hình 2.1. Mẫu lá SVD (Panax bipinnatifidus Seem.) 13 thu hái tại Sapa, Lào Cai 4 Hình 3.1. Quá trình chiết lá SVD ban đầu 16 5 Hình 3.2. Quá trình tách hợp chất chính aralosid A từ 17 phân đoạn BuOH 6 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của aralosid A phân lập 18 được. 7 Hình 3.4. Phổ IR của aralosid A phân lập được 19 8 Hình 3.5. Phổ ESI-MS của aralosid A phân lập được 20 9 Hình 3.6. Dữ liệu nhóm chức CH3 trong phân tử dựa 23 trên phổ 13C và DEPT 10 Hình 3.7. Dữ liệu carbon mang nối đôi, nhóm chức 24 carbonyl và dữ liệu carbon trong vùng 60-100 ppm. 11 Hình 3.8. Dữ liệu HMBC thể hiện tương quan giữa các 25 phân tử trong đường 12 Hình 3.9. Dữ liệu HMBC chỉ ra mối quan hệ giữa các 26 đường và phần aglycon 13 Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của saponin phân lập 26 được, aralosid A.
  8. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, xu hướng sử dụng các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng. Từ xu hướng đó, các dược liệu quý trong nước cũng như trên thế giới trở thành mục tiêu cho việc nghiên cứu, tìm kiếm, khai thác nguồn tài nguyên này. Việt Nam là một quốc gia có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú với trên 5000 loài thực vật có khả năng được sử dụng làm thuốc. Tuy nhiên trên thực tế các loài thảo dược này chỉ được sử dụng trực tiếp hoặc dưới dạng nguyên liệu thô thông qua một số phương pháp sơ chế đơn giản, điều này khiến cho giá trị các loài thảo dược này chưa được phát huy hết tác dụng. Một trong số đó phải kể đến sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một dược liệu quý của vùng Dược liệu Tây Bắc được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền có tiềm năng để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên. Các kết quả nghiên cứu công bố gần đây khẳng định phần thân rễ Sâm vũ diệp chứa nhiều saponin có giá trị. Tuy nhiên liên hệ với loài Panax nổi tiếng khác như nhân sâm (P. ginseng), tam thất (P. notoginseng) cho thấy các bộ phận khác của cây bao gồm thân, lá và hoa đều giàu hoạt chất saponin không kém phần thân rễ. Bên cạnh đấy, phần thân lá của các loài trên cũng được sử dụng trong y học giống như phần dưới mặt đất của chúng. Hơn nữa, lá và hoa là bộ phận tái sinh cùng với quá trình sinh trưởng của Sâm vũ diệp. Nếu thành phần hoạt chất trong phần thân, lá Sâm vũ diệp có sự tương đồng với thành phần hoạt chất trong phần thân rễ của cây thì trong tương lai chúng ta có khả năng sử dụng phần trên mặt đất làm dược liệu thay thế cho phần thân rễ Sâm vũ diệp. Trên cơ sở đó, kế thừa và phát triển tiếp nghiên cứu về đối tượng Sâm vũ diệp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Góp phần nghiên cứu thành phần Saponin của bộ phận lá của Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.)”. Nội dung KLTN này là một phần trong đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) ở Việt Nam” 1
  9. (Mã số: B2019_BKA.02 (2019-2020); CNĐT: PGS TS Vũ Đình Hoàng và TKĐT: PGS TS Nguyễn Hữu Tùng), đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ, Bộ Giáo dục và Đào tạo. Mục tiêu của đề tài: Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được. 2
  10. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Sâm vũ diệp 1.1.1. Tên khoa học, tên đồng danh Sâm vũ diệp là một loài thực vật thuộc chi Panax, họ Araliaceae được Seem. miêu tả lần đầu tiên vào năm 1868. SVD còn có những tên gọi khác như Tam thất lá xẻ, Vũ diệp tam thất, Sâm hai lần xẻ, Phan xiết (Dao), Hoàng liên thất, Nữu tử thất, Tam thất lá lông chim, Hương sơn tam thất (Trung Quốc), Hoa diệp tam thất, Trúc tiết nhân sâm. [1,3] Ngoài tên khoa học cho loài là Panax bipinnatifidus (Seem.) Sâm Vũ Diệp còn có những tên đồng danh khác như Aralia bipinnatifida (Seem.) C.B.Clarke; Aralia quinquefolia (L.) Dec. et Plan. var. major Burk; Aralia quinquefolia (L.) Dec. et Plan. var. elegantior Burk; Panax pseudoginseng Wall. var. bipinnatifidus (Seem.) Li; Panax pseudoginseng Wall. var. major (Burk.) Li; Panax major Ting ex Pei; Panax pseudoginseng Wall. Spp. himalaicus Hara; Panax pseudoginseng Wall. var. elegantior (Burk) Hoo et Tseng; Panax japonicas Mey. var. bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng. [1,3] 1.1.2. Đặc điểm thực vật Cây thân thảo sống lâu năm, cao 0,3- 0,5 m. Rễ củ dài, vặn vẹo, có nhiều đốt và những vết sẹo to do thân cây rụng để lại, đầu rễ có hình con quay. Thân khí sinh mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, cao 20-30 cm. Lá kép chân vịt gồm 2-3 cái mọc vòng. Lá chét 5-7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5- 14 cm, rộng 1,5- 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy lông chim không đều, mép khía răng, có lông. Cụm hoa tán đơn mọc ở ngọn, hoa màu trắng đục; 5 cánh hoa; 5 nhị; bầu 2- 3 ô. Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, màu đỏ khi chín, có châm đen to ở đầu, chứa 1-2 hạt. Hạt hình cầu hoặc gần cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt. [1,3] 3
  11. Hình 1.1. Hình ảnh Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 1.1.3. Phân bố và sinh thái Sâm vũ diệp loài sâm mọc hoang dại được phát hiện vào năm 1868. Trên thế giới cây phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal (vùng cận Hymalaya). Tại Việt Nam SVD được phân bố ở khu vực núi Hoàng Liên Sơn ở độ cao trên 1600m. Năm 1973, cây được phát hiện ngay ở núi Hàm Rồng, sát thị trấn Sapa, ở độ cao 1600m. Hiện nay vùng phân bố của sâm vũ diệp bị thu hẹp dần ở độ cao khoảng 1800m trở lên, cây được coi là cực hiếm. Gần đây Sâm vũ diệp bước đầu được trồng thử ở Hà Giang và Lào Cai. [1,3] Sâm vũ diệp đặc biệt ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm, mọc rải rác hay tập trung dưới tán rừng ẩm kín thường xanh núi cao. Quần hệ rừng nơi có Sâm vũ diệp được xác định là rừng thường xanh mưa ẩm nhiệt đới trên cao. Cây gieo giống tự nhiên từ hạt. Mùa hoa tháng 4-5, quả xanh cuối tháng 4-6, quả chín tháng 7. Quả chín thường rơi xuống gốc mẹ, tuy nhiên do tháng 7 rơi vào thời kỳ có lượng mưa lớn nên có thể bị cuốn trôi ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của Sâm Vũ Diệp. Quả chín chim thường ăn (bỏ hạt), hạt rơi xuống lại bị một loại sóc nâu nhỏ ăn nhân hạt. Thân rễ bị gãy hoặc khai thác mất phần già, phần đầu thân rễ (có chồi ngủ) còn lại vẫn có khả năng tái sinh. Toàn bộ phần thân mang lá tàn lụi vào mùa đông, đến đầu mùa xuân năm sau từ đầu mầm thân rễ sẽ mọc lên các chồi thân mới. [8] 4
  12. 1.1.4. Thành phần hóa học Ở Việt Nam và trên thế giới có rất ít tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của SVD. Các bài báo nghiên cứu bước đầu cho thấy saponin là thành phần hóa học chính của SVD, trong đó khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn. a. Saponin Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponin từ lá khô của cây Panax japonicus var. bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng thu hái ở dải núi Tần Lĩnh, Thiểm Tây, Trung Quốc trong đó bao gồm 2 saponin mới là bipinnatifidusosid F1, F2 và 11 saponin đã biết được xác định là ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Re, Rd, Rb1, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid và majorosid F1. [11,12] Tên R1 R2 Ginsenoside Rb1 Glc(2→1)Glc Glc(6→1)Glc Ginsenoside Rd Glc(2→1)Glc Glc Ginsenoside Rb3 Glc(2→1)Glc Glc(6→1)Xyl 5
  13. Tên R1 R2 R3 Ginsenoside Re H Glc(2→1)Rha Glc Ginsenoside Rg2 H Glc(2→1)Rha H Ginsenoside F3 H H Glc(6→1)Ara(p) Ginsenoside F1 H H Glc R= Glc (2→1)Rha (24S) 24(S)-pseudoginsenosid F11 6
  14. Ginsenosid F2 Majorosid F1 Rễ Sâm vũ diệp chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2.[1,3] Nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc năm 2011, phân lập một nhóm 10 saponin khung oleanan (1-10) từ dịch chiết methanol của rễ SVD thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C (1-3) và bảy hợp chất được biết bao gồm narcissiflorin methyl este (4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenosid RP1 methyl este (6), stipuleanosid R1 (7), pseudoginsenosid RT1 methyl este (8), momordin IIe (9) và stipuleanosid R2 methyl ester (10). [10] 7
  15. Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 10 saponin được tách từ rễ SVD [5] Chất R1 R2 R3 R4 R5 1 Ara(p) H H Me H 2 H Xyl (1→6) H Me H 3 Xyl Ara(p) H Me GlcA 4 Ara(p) H Ara(p) Me H 5 Ara(p) H H Me GlcA 6 Xyl H H Me H 7 H Glc Ara(f) H H 8 Xyl H H Me GlcA 9 Xyl Ara(p) H H GlcA 10 H Glc Ara(f) Me GlcA Me : Methyl Ara(f) : α-L-arabinofuranosyl Ara(p) : α-L-arabinopuranosyl Glc : β-D-glucopyranosyl Xyl : β-D-xylopyranosyl GlcA β-D-glucuronopyranosyl 8
  16. Năm 2017, Đỗ Văn Hào và cộng sự đã xác định được axít oleanolic và daucosterol. Sử dụng phương pháp HPLC- DAD định lượng axít oleanolic cho thấy hàm lượng axít oleanolic trong cao Sâm vũ diệp và rễ Sâm vũ diệp lần lượt là: 0,034% và 0,0066% tương đương với 340 μg/g và 66 μg/g; hàm lượng saponin trong cao Sâm vũ diệp và dược liệu SVD lần lượt là 0,364% và 0,0698% tương đương 3640 µg/g và 698 μg/g. [1] axit oleanolic daucosterol Nguyễn Thị Thu Thủy năm 2018, đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học 2 hợp chất saponin mới từ phân đoạn n-butanol của thân rễ Sâm vũ diệp thu hái tại Sapa, đó là stipuleanosid R2, aralosid A methyl ester, trong đó hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD là 0,49%. Đây là 2 hợp chất lần đầu được tìm thấy của cây này tại Việt Nam. [2] 9
  17. Stipuleanosid R2 Aralosid A methyl ester b. Steroid [6] β-sitosterol c. Lipit [6] + Xác định hàm lượng lipit thô Kết quả cho thấy hàm lượng lipit thô trong Sâm vũ diệp là 5,86% + Axit béo 10
  18. Bảng 1.1. Axit béo trong SVD STT (Số carbon: Số Tên axit béo Hàm lượng (% so liên kết đôi) với dịch tổng) 1 (16:0) Axit palmitic 9,38 2 (18:0) Axit steraric 3,2 3 (18:1) Axit oleic 32,23 4 (18:2) Axit linoleic 5,78 5 (18:3) Axit limolenic 4,37 6 (24:0) Axit lignoceric 35,92 7 Cx Chưa biết 9,12 d. Acid amin [6] Bảng 1.2. Axit amin trong SVD STT Axit amin % Axit amin tự do 1 Aspartic acid + glutamic acid 0,13 2 Glycin 0,01 3 Arginin 0,04 4 Threonin + alanin 0,05 5 Isoleucin + leucin 0,34 e. Nguyên tố đa lượng và vi lượng [6] Bảng 1.3. Nguyên tố đa lượng và vi lượng STT Nguyên tố Phần trăm (so với dược liệu khô) 1 Al 0,05 2 Si 0,02 3 Mg 1 11
  19. 4 Ca >1 5 Ba 0,02 6 Fe 0,03 7 Mn 0,015 8 Ti 0,02 9 Ni 0,0001 10 Cu 0,0015 11 Pb 0,0001 12 P 0,2 13 Na 0,1 f. Polyacetylen [6] Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học của SVD còn khá mới mẻ. Trong nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2009, kết quả định tính sơ bộ cho thấy trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin. 1.1.5. Tính vị, công năng Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết tán ứ. [1,3] 1.1.6. Công dụng Theo kinh nghiệm nhân dân, Sâm vũ diệp được làm thuốc bổ huyết nhất là cho phụ nữ sau khi đẻ và người cao tuổi. Cách dùng: rễ thái mỏng, phơi khô, sắc nước nóng, hoặc ninh với chân giò, hoặc tán bột hầm với thịt gà. Sâm vũ diệp còn được dùng cầm máu, tán ứ tiêu sưng. Khi dùng ngoài, rễ phơi khô tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết thương mau lành. Rễ Sâm vũ diệp còn được ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm dùng rất tốt, lại có kích thích sinh dục. Ngoài ra, nhân dân còn tận dụng cả thân và lá để nấu cao. Cao này pha với nước hoặc rượu để uống cũng có tác dụng như 12
  20. rễ. Ở Trung Quốc, Sâm vũ diệp là thuốc chữa hư lao, thổ huyết, chảy máu cam, đòn ngã tổn thương. [1,3] 1.1.7. Tác dụng dược lý Trên thế giới có rất ít các nghiên cứu liên quan đến tác dụng dược lý của Sâm Vũ Diệp. Theo như một số công bố thì cho biết SVD có tác dụng: Tác dụng tăng cường tính đề kháng chung của cơ thể: bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma cho chuột cống trắng, trong thí nghiệm dùng gamma liều cao (1500 rengben), Sâm vũ diệp với liều 5g/kg có tác dụng kéo dài thời gian sống của động vật thí nghiệm, thời gian sống của chuột dùng sâm vũ diệp là 5 ngày còn đối với lô đối chứng là 4,8 ngày. [1,3] Tác dụng cầm máu: Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn ethylacetat có tác dụng ở các mức liều: 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 5 mg/mL, phân đoạn ether ở các mức liều 1-2-5 mg/mL. [3,9] Tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư: nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư từ 57 cây trong hơn 2000 cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Quốc, Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một trong số những loài thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư. [3,9] Ảnh hưởng đối với hệ thần kinh trung ương: thí nghiệm trên chuột, ở liều thấp (0,5 g/kg) không ảnh hưởng rõ rệt hoặc có chiều hướng rút ngắn thời gian gây ngủ của hexobarbital, đối với liều cao có tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của hexobarbital chưa rõ rệt. [1,3] 13
nguon tai.lieu . vn