- Trang Chủ
- Y khoa - Dược
- Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Xem mẫu
- HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
DƯƠNG THỊ PHƯỢNG
ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN
RỄ SÂM VŨ DIỆP
(PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
Hà Nội - 2018
- U
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
VN
KHOA Y DƯỢC
y,
DƯƠNG THỊ PHƯỢNG
ac
rm
a
ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN
Ph
RỄ SÂM VŨ DIỆP
d
(PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG an
ine
HIỆU NĂNG CAO
dic
Me
of
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
ol
ho
Khóa: QH.2013.Y
Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG
Sc
ThS. NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH
@
ht
rig
py
Co
Hà Nội - 2018
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- LỜI CẢM ƠN
U
Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận
VN
được rất nhiều sự giúp đỡ vô cùng quý báu của các thầy cô giáo của Khoa Y Dược,
Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với gia đình và bạn bè. Thời điểm hoàn thành khóa
y,
luận cũng là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với
ac
những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn của mình là
rm
TS. Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - người thầy đã
dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong quá
a
Ph
trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn của mình tới ThS. Nguyễn Thị Hoàng
Anh vì đã luôn dành thời gian hướng dẫn và động viên tôi trong quá trình hoàn
d
thiện khóa luận.
an
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong
Khoa Y Dược đặc biệt là Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều
ine
kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2013.Y, đặc biệt là các
dic
bạn Thùy, Phương, Chuyên đã luôn đồng hành với tôi trong suốt thời gian qua. Tôi
xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thành viên trong nhóm nghiên cứu của tôi là chị
Me
Thủy và chị Huệ vì đã luôn giúp đỡ và nhiệt tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài.
of
Lời cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình đã nuôi dạy, khích lệ và sát cánh,
giúp tôi có thêm động lực cố gắng để có kết quả như ngày hôm nay.
ol
Hà Nội, ngày 30 tháng 4 năm 2018
ho
Sinh viên
Sc
@
Dương Thị Phượng
ht
rig
py
Co
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
U
VN
ACN Acetonitril
BuOH Buthanol
y,
Detector mảng điốt (Diode array detector)
ac
DAD
Dd Dung dịch
rm
EtOH Ethanol
a
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performace liquid chromatography)
Ph
LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
d
LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)
an
MeOH Methanol
RSD Độ lệch chuẩn tương đối
ine
SKĐ Sắc ký đồ
dic
SKLM Sắc ký lớp mỏng
Sti Stipuleanosid R2
Me
SVD Sâm vũ diệp
of
TB Trung bình
TT Thứ tự
ol
UV Ultra violete
ho
VIS Visible
Sc
@
ht
rig
py
Co
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
U
VN
Bảng 1. Chương trình dung môi. 18
Bảng 2. Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết.
y,
19
ac
Bảng 3. Tính thích hợp hệ thống 23
Bảng 4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2 24
rm
Bảng 5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 26
a
Bảng 6. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 27
Ph
Bảng 7. Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp 28
d
an
ine
dic
Me
of
ol
ho
Sc
@
ht
rig
py
Co
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
U
VN
Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 2
Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp
y,
4
ac
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2 5
Hình 1.4. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng 7
rm
Hình 2.1. Mẫu rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa 10
a
Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016
Ph
Hình 2.2. Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập được 11
Hình 3.1. Sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun
d
17
an
H2SO4 10% /EtOH
Hình 3.2. Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 bằng HPLC 19
ine
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu trắng 21
dic
Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 21
Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch thử 22
Me
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 24
of
ol
ho
Sc
@
ht
rig
py
Co
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- MỤC LỤC
U
VN
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
y,
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN....................................................................................2
ac
1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP ................................................................... 2
rm
1.1.1. Tên khoa học .....................................................................................................2
1.1.2. Đặc điểm thực vật .............................................................................................2
a
1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái ..........................................................................2
Ph
1.1.4. Thành phần hóa học ..........................................................................................3
1.1.5. Tác dụng dược lý...............................................................................................4
d
1.1.6. Công dụng .........................................................................................................4
an
1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 ....................................................... 5
1.2.1. Công thức hóa học ............................................................................................5
ine
1.2.2. Tính chất lý hóa .................................................................................................5
1.2.3. Tác dụng sinh học .............................................................................................6
dic
1.2.4. Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC ..........................6
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ................. 6
Me
1.3.1. Nguyên tắc của HPLC .......................................................................................6
1.3.2. Một số thông số đặc trưng .................................................................................7
of
1.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích HPLC ........................................................9
1.3.4. Tổng quan các nghiên cứu định lượng thành phần hóa học của Sâm vũ diệp
ol
bằng HPLC ..................................................................................................................9
ho
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................10
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 10
Sc
2.1.1. Nguyên liệu sâm vũ diệp .................................................................................10
2.1.2. Chất tinh khiết stipuleanosid R2 .....................................................................10
@
2.1.3. Dung môi, hóa chất .........................................................................................11
2.1.4. Máy móc, dụng cụ ...........................................................................................11
ht
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 12
rig
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 12
2.3.1. Phương pháp chiết xuất các hợp chất ..............................................................12
py
2.3.2. Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong cao rễ SVD bằng HPLC ....13
Co
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- 2.3.3. Định lượng stipuleanosid R2 trong cao sâm vũ diệp và dược liệu sâm vũ diệp
U
...................................................................................................................................16
VN
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ............................................................... 16
CHƯƠNG 3 – KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN ........................................................17
y,
3.1. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA STIPULEANOSID R2 PHÂN LẬP
ĐƯỢC ....................................................................................................................... 17
ac
3.1.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng ........................................................................17
rm
3.1.2. Phương pháp HPLC ........................................................................................17
3.1.3. Phương pháp đo độ nóng chảy ........................................................................20
a
3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2
Ph
BẰNG HPLC ........................................................................................................... 20
3.2.1. Chương trình sắc ký ........................................................................................20
d
3.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng ...............................................................20
an
3.3. ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢC LIỆU SÂM VŨ
DIỆP ......................................................................................................................... 27
ine
3.4. BÀN LUẬN ....................................................................................................... 28
3.4.1. Về xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC............28
dic
3.4.2. Về định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu và cao sâm vũ diệp ............29
Me
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................31
of
ol
ho
Sc
@
ht
rig
py
Co
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- ĐẶT VẤN ĐỀ
U
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae), còn
VN
gọi là Trúc tiết nhân sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất là một vị
thuốc quý phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta
y,
[3,22]. Gần đây sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm
ac
ở một số địa phương ở Hà Giang, Lào Cai. Về mặt y học, sâm vũ diệp được sử dụng
làm thuốc bổ và là thành phần trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc
rm
vùng núi Tây Bắc [3,22]. Theo như các tài liệu đã được công bố về sâm vũ diệp cho
thấy các saponin là thành phần hoạt chất chính mang lại tác dụng dược lý và giá trị
a
sử dụng của dược liệu quý này trong y học. Do vậy, việc tập trung nghiên cứu thành
Ph
phần saponin trong SVD cũng như định lượng được các thành phần đó có ý nghĩa
rất quan trọng trong việc ứng dụng dược liệu SVD trong thực tiễn.
d
an
Qua quá trình tra cứu tài liệu, chúng tôi thấy rằng ở trong nước ta có rất ít
nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và tác dụng dược lý của sâm
vũ diệp để phát triển sử dụng dược liệu quý thuộc chi sâm Panax này. Trên cơ sở
ine
đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu về thành phần hóa học của thân rễ cây
SVD thu hái ở Sapa, Lào Cai với các hợp chất saponin phân lập được từ phân đoạn
dic
buthanol và đã xác định được stipuleanosid R2 là thành phần saponin chính có trong
thân rễ SVD [24]. Tiếp nối nghiên cứu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Định lượng
Me
stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc
of
xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu sâm vũ diệp phục vụ việc
quản lý chất lượng dược liệu trên thị trường và tối ưu hóa quy trình chiết xuất
ol
saponin của SVD sau này.
ho
Mục tiêu đề tài:
1. Xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng phương pháp sắc ký
Sc
lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2. Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao sâm vũ diệp và dược liệu sâm vũ
@
diệp thu hái ở Tây Bắc.
Đề tài này là một phần trong đề tài cấp Nhà nước thuộc Chương trình Tây
ht
Bắc “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên
rig
liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)
và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)”, mã số: KHCN-
py
TB.07C/13-18.
Co
1
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
U
1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP
VN
1.1.1. Tên khoa học
SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem. [3,21], SVD thuộc chi
y,
Sâm (Panax. L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2].
ac
1.1.2. Đặc điểm thực vật
rm
Sâm vũ diệp là cây thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm
[3,21]. Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại.
a
Ph
Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có
vạch dọc, thường lụi vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu
tháng 3 dương lịch. Lá kép chân vịt, gồm 2 - 3 cái mọc vòng. Lá chét 5 - 7 (ít khi 3)
d
thuôn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy
an
không đều, mép có răng cưa, có lông.
ine
dic
Me
of
ol
Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)[3,21]
ho
1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái
Sc
Sâm vũ diệp là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở
nước ta. Trong tự nhiên, SVD phân bố ở dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện Sa Pa, Bát
@
Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc nước ta [3,21,22]. Gần đây
sâm vũ diệp đã được nghiên cứu và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa
ht
phương ở Hà Giang, Lào Cai. Hiện nay vùng phân bố của SVD đang bị thu hẹp dần
và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Do vậy SVD là loài dược liệu quý hiếm cần
rig
được bảo tồn và gìn giữ để phát triển trong tương lai.
py
Sâm vũ diệp thường mọc rải rác hay tập trung dưới tán rừng ẩm, gần như
quanh năm có sương mù. Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm
Co
2
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy
U
thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh). Chồi này sinh trưởng nhanh trong vòng
VN
một tháng đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang
lá có thể cho ra một cụm hoa. Quả xanh quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến
tháng 7 quả đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ. Do quả chín đúng vào
y,
thời kì có lượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng
ac
đến khả năng tái sinh tự nhiên của sâm vũ diệp. Cách xác định tuổi của cây dựa vào
rm
những vết sẹo thân được hình thành sau khi quả chín [3].
1.1.4. Thành phần hóa học
a
Ph
Theo các tài liệu đã nghiên cứu cho thấy Saponin được xem là thành phần
hoạt chất chính trong các loài thuộc chi Panax L.. Các nhà khoa học đã chiết tách và
xác định được gần 300 saponin từ các loài thuộc chi này [31]. Các kết quả
d
an
nghiên cứu trước đây của SVD cũng chỉ ra rằng saponin là thành phần chính của lá
và rễ cây sâm vũ diệp, trong đó bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng
tương đối cao cùng với một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn
ine
[11,23].
dic
Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố phân lập được 13
saponin khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số
Me
ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [37].
Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự vào năm 2002 cho thấy kết quả
of
định tính sơ bộ trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen
và saponin cùng với acid béo, acid amin [21]. Năm 2003, đã xác định thành phần
ol
saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những
ho
chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro. Ngoài ra còn có các
saponin triterpen nhóm dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [22].
Sc
Gần đây vào năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập
và xác định được một nhóm gồm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2) là
@
thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn (Việt
Nam), trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C (1-3) [33].
ht
rig
py
Co
3
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- U
VN
y,
ac
a rm
Ph
d
an
ine
Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp [33]
1.1.5. Tác dụng dược lý
dic
Tính vị, công năng: Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng
dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [3].
Me
Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD cho thấy khi thử trên động
vật thí nghiệm, SVD có độc tính cấp rất thấp, tăng cường chức năng sinh lý, ảnh
of
hưởng tốt đến hệ thần kinh trung ương, tăng sức dẻo dai của cơ thể, tăng sức đề
ol
kháng, tác dụng tán huyết [3]. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự
đã chỉ ra rằng SVD có tác dụng chống stress [25], chống trầm cảm, có tác dụng bảo
ho
vệ gan và kích thích tăng miễn dịch [12-15].
Sc
1.1.6. Công dụng
Sâm vũ diệp được biết đến như một vị thuốc quý có tác dụng chống ung thư,
@
chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ [25], chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu,
nhất là đối với phụ nữ sau khi sinh. Sâm vũ diệp còn được dùng để cầm máu, tán ứ,
ht
tiêu sưng. Dùng ngoài, rễ phơi khô, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết
rig
thương mau lành. Rễ cây sâm vũ diệp còn được ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh
sâm dùng rất tốt cho sức khỏe đặc biệt là chức năng sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở
py
vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao rồi dùng để pha với nước hoặc rượu
Co
4
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- để uống cũng có tác dụng như rễ. Ở Trung Quốc, sâm vũ diệp còn được dùng làm
U
thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ huyết, đòn ngã tổn thương [7,22].
VN
1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2
1.2.1. Công thức hóa học
y,
ac
a rm
d Ph
an
ine
dic
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2 [41]
Me
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC:
(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b-
of
heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-
ol
yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]-
ho
3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4-
[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2-
Sc
carboxylic acid [40].
Công thức phân tử: C53H84O23 [41].
@
Phân tử lượng: 1089.232 g/mol [42].
ht
1.2.2. Tính chất lý hóa
rig
Chất bột màu trắng.
Độ tan: 0,57 g/L [42].
py
Điểm nóng chảy 210 - 2150C [41].
Co
5
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- 1.2.3. Tác dụng sinh học
U
Stipuleanosid R2 là thành phần saponin trong dược liệu, được biết đến như là
VN
thành phần có hoạt tính và quyết định các tác dụng sinh học của các loài dược liệu
như: sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis [36], Aralia elata [34] ... Trong
y,
một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng stipuleanosid R2 có tác dụng gây độc
ac
tế bào ung thư [30]; ức chế sự gia tăng các tế bào ung thư bạch cầu đặc biệt là đối
với dòng tế bào K562 và U937 [29]; có tác dụng chống oxy hóa [38]; hạ đường
rm
huyết, điều hòa miễn dịch và hạ lipid máu [37].
a
1.2.4. Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC
Ph
Theo như tài liệu chúng tôi tìm hiểu được tính đến thời điểm hiên tại: Trên thế
giới vẫn chưa có các nghiên cứu công bố về định lượng hàm lượng stipuleanosid R2
d
trong dược liệu bằng phương pháp HPLC mà chủ yếu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập
an
chất này trong các dược liệu. Do đó việc xây dựng được phương pháp định lượng
stipuleanosid R2 là rất cần thiết trong việc ứng dụng dược liệu trong thực tiễn.
ine
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
dic
1.3.1. Nguyên tắc của HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một một phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn
Me
hợp phân tích; dựa trên cơ sở là sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong
cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao. Trong đó: pha động là chất
lỏng; pha tĩnh là một chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một
of
chất mang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ.
ol
Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay dựa
ho
trên phân bố theo kích cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.
Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai
Sc
pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động dẫn
tới thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ khác nhau và từ đó giúp phân tách được
@
các chất.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bằng detector. Detector sẽ
ht
giúp phát hiện và đo nồng độ các chất phân tích. Hiện nay có rất nhiều loại detector
rig
được sử dụng như: detector UV-Vis, detector huỳnh quang (FLD), detector diode
py
array (DAD), detector điện hoá,…Trong đề tài này chúng tôi sử dụng detector
DAD.
Co
6
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- Nếu thực hiện quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ thu
U
được kết quả là một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm
VN
nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc ký đồ
[4,5,8,20,27,28].
y,
1.3.2. Một số thông số đặc trưng [2,3,5,9,10,15]
ac
a rm
d Ph
an
ine
Hình 1.4. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng [9]
dic
a) Thời gian lưu
Me
t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký.
tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ
of
thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
ol
tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0.
ho
(Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất
định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định).
Sc
b) Hệ số dung lượng k’
Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức:
@
t 'R t R -t 0 t R
ht
k'= = = -1
t0 t0 t0
rig
Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là
py
tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời
điểm cân bằng. Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm
Co
7
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- mẫu do đó làm giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ
U
nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài. Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt
VN
nhất.
c) Hệ số bất đối AF (tailing factor)
y,
Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ:
ac
rm
AF W 1/20
2a
a
Ph
Trong đó:
- W1/20: là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
d
- a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
an
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
ine
Yêu cầu trong phép định lượng: 0,9 < AF < 2.
Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối.
dic
d) Hệ số chọn lọc
Me
' t R,B-t 0
α= k B = (k’B k’A)
k 'A t R,A -t 0
of
Yêu cầu: α nằm trong khoảng 1,05 đến 2.
α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng.
ol
e) Độ phân giải (resolution)
ho
Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều
Sc
kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:
2t R,B t R,A 1,18t R,B t R,A N α 1 k'B
@
RS
WB WA
W1/2B W1/2A 4 α 1
k B
'
ht
- RS = 1,5: độ phân giải cơ bản đạt được, khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng,
rig
chỉ xen phủ nhau 0,3%.
- Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%.
py
- RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau.
Co
8
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- 1.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích HPLC
U
a) Yêu cầu chung
VN
Các quy trình phân tích HPLC cần phải thẩm định là các quy trình chưa
được công bố trong tiêu chuẩn Dược điển các nước. Nội dung về thẩm định phương
pháp được hướng dẫn trong các tài liệu về phân tích và được quy định trong các
y,
Dược điển.
ac
b) Nội dung thẩm định
rm
Thông số đặc trưng của kỹ thuật HPLC cần đánh giá khi thẩm định phương
pháp định lượng dược chất chính, đa lượng bao gồm: tính thích hợp hệ thống, độ
a
đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng.
Ph
1.3.4. Tổng quan các nghiên cứu định lượng thành phần hóa học của Sâm vũ
d
diệp bằng HPLC
an
Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự đã định lượng
hàm lượng saponin tổng số của thân rễ và rễ củ của Sâm vũ diệp theo phương pháp
ine
trọng lượng của Namba là 5,86% [17].
Năm 2017, Nhóm nghiên cứu của Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội:
dic
Nguyễn Thị Huệ đã tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và xây dựng
phương pháp định lượng acid oleanolic và saponin toàn phần trong dược liệu sâm
Me
vũ diệp bằng phương pháp HPLC - DAD. Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng
acid oleanolic trong cao sâm vũ diệp và rễ sâm vũ diệp lần lượt là: 0,034% và
of
0,0066% tương đương với 340 μg/g và 66 μg/g; hàm lượng saponin trong cao sâm
vũ diệp và dược liệu SVD lần lượt là 0,364% và 0,0698% tương đương 3640 µg/g
ol
698 μg/g [11].
ho
Nhận xét: Đây là những kết quả bước đầu về định lượng thành phần hóa học
của SVD và xác định hàm lượng saponin tổng số. Tính thời điểm hiện tại, chưa có
Sc
nhiều kết quả công bố phân tích và định lượng các thành phần saponin cụ thể có
trong sâm vũ diệp. Trong nghiên cứu này chúng tôi phân tích định lượng thành phần
@
saponin trong SVD bằng phương pháp HPLC, hiện đang là phương pháp được
Dược điển các nước công nhận đạt yêu cầu về tính tiên tiến so với phương pháp
ht
quang phổ hay phương pháp khối lượng của phần lớn các chuyên luận dược liệu
rig
hiện nay. Phương pháp HPLC với ưu điểm là độ chính xác cao sẽ đáp ứng được yêu
cầu phân tích từng thành phần riêng lẻ có trong mẫu, đặc biệt là đối với các mẫu
py
phức tạp như cao chiết từ dược liệu.
Co
9
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
U
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
VN
2.1.1. Nguyên liệu sâm vũ diệp
Mẫu nghiên cứu trong đề tài là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus
y,
Seem.) được trồng ở Sa Pa, Lào Cai và thu hái vào ngày 15/7/2016. Mẫu nghiên
ac
cứu được giám định tên khoa học bởi ThS. Nguyễn Quỳnh Nga và CN. Phan Văn
rm
Trường, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Mẫu tiêu bản (PB-150716)
được lưu giữ Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu.
a
Mô tả mẫu nghiên cứu: Thân rễ sâm vũ diệp có nhiều đốt và những vết sẹo,
Ph
cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm. Thể chất cứng chắc, giòn,
dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nhạt. Mùi thơm nhẹ, vị đắng, hơi ngọt.
d
Cách xử lí mẫu: thân rễ SVD thu hái tại Sa Pa được rửa sạch, cắt miếng
an
mỏng, sấy khô ở 500C, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo, thoáng mát
ine
làm nguyên liệu nghiên cứu.
dic
Me
of
ol
ho
Sc
Hình 2.1. Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào
Cai vào ngày 15/7/2016
@
2.1.2. Chất tinh khiết stipuleanosid R2
Trong đề này chúng tôi sử dụng chất stipuleanosid R2 được phân lập từ dược liệu
ht
sâm vũ diệp trong một nghiên cứu trước của cùng nhóm nghiên cứu với chúng tôi
rig
[24]. Stipuleanosid R2 phân lập được sẽ được tiến hành đánh giá độ tinh khiết đạt
tiêu chuẩn để sử dụng làm chất chuẩn trong phương pháp định lượng nồng độ chất
py
này có trong SVD bằng HPLC.
Co
10
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- U
VN
y,
ac
a rm
Hình 2.2. Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập được
Ph
2.1.3. Dung môi, hóa chất
d
Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài
an
đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC.
- Dung môi dùng cho chiết xuất và phân lập: Ethanol 70%, methanol
ine
(MeOH), ether, ethylacetat (EtOAc), n-butanol (BuOH).
dic
- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, Acetonitril, Acid acetic) của
Merck, Đức; nước cất hai lần dùng cho phân tích HPLC đạt tiêu chuẩn Dược điển
Me
Việt Nam IV.
2.1.4. Máy móc, dụng cụ
of
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị, dụng cụ
đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà
ol
Nội:
ho
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent
Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động.
Sc
- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức).
@
- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số
0,0001 g, Precisa - Thụy Sĩ).
ht
- Cân xác định độ ẩm Prescisa HA 60.
rig
- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000 ml.
py
- Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc).
Co
- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ).
11
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- - Bếp điện, bếp đun cách thủy.
U
- Đèn tử ngoại.
VN
- Cột sắc ký các loại kích cỡ.
- Màng lọc 0,45 µm.
y,
- Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức,
ac
bình cầu dung tích 50 - 2000 ml, ống nghiệm, pipet chính xác.
rm
- Tủ hút.
a
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Ph
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong
thân rễ SVD bằng HPLC với chất chuẩn là stipuleanosid R2 tinh khiết được phân
d
lập từ SVD.
an
2. Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD thu hái ở Sa Pa,
Lào Cai bằng phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định ở trên.
ine
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
dic
2.3.1. Phương pháp chiết xuất các hợp chất
Các nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp đều cho thấy sâm
Me
vũ diệp có chứa thành phần chính là saponin, tham khảo các tài liệu về chiết xuất
saponin và sapogenin trong dược liệu để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp
of
nhất với mẫu nghiên cứu là thân rễ SVD [23].
- Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70%.
ol
ho
- Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng - lỏng.
Quy trình chiết xuất được thực hiện như sau:
Sc
1. Thân rễ SVD sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết hồi lưu bằng
dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ 700C, chiết 3 lần.
@
2. Tiến hành lọc loại bã dược liệu, các dịch chiết ethanol thu được lọc qua
ht
giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng ethanol.
rig
3. Cao ethanol này đem phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung
môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetate và n-butanol lặp lại 3 lần theo tỷ lệ
py
1:1. Các phân đoạn ether, ethyl acetat, n-butanol đem cất quay chân không dưới áp
Co
12
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
nguon tai.lieu . vn