1. Trang Chủ
  2. Y khoa - Dược
  3. Khóa luận tốt nghiệp: Bước đầu khảo sát nghiên cứu quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ cây Thừng mực lá to

Khóa luận tốt nghiệp: Bước đầu khảo sát nghiên cứu quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ cây Thừng mực lá to

Đề tài nghiên cứu nhằm 2 mục tiêu: Xây dựng được quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ cây Thừng mực lá to; xác định được hàm lượng alcaloid trong cao. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC  TRẦN NGỌC ÁNH BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO GIÀU ALCALOID TỪ VỎ CÂY THỪNG MỰC LÁ TO (Holarrhena antidysenterica (L.) Wall.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC 

Thể loại Tài liệu miễn phí Y khoa - Dược

Số trang 45

Ngày tạo 4/2/2023 4:06:21 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.47 M

Tên tệp

Tải Khóa luận tốt nghiệp: Bước đầu khảo sát nghiên cứu... (.pdf)

Xem mẫu

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC  TRẦN NGỌC ÁNH BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO GIÀU ALCALOID TỪ VỎ CÂY THỪNG MỰC LÁ TO (Holarrhena antidysenterica (L.) Wall.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC  TRẦN NGỌC ÁNH BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO GIÀU ALCALOID TỪ VỎ CÂY THỪNG MỰC LÁ TO (Holarrhena antidysenterica (L.) Wall.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH2016.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN VĂN TÀI ThS. LÊ ANH TUẤN HÀ NỘI - 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu Trung Ương. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Trường Đại Học Y Dược - Đại Học Quốc Gia Hà Nội và Viện Dược liệu đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em được thực hiện khóa luận tại đây. Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Nguyễn Văn Tài và ThS. Lê Anh Tuấn đã định hướng, quan tâm giúp đỡ em hoàn thành đề tài này. Đồng thời em cũng chân thành cảm ơn TS. Lê Thành Nghị, CN. Phùng Như Hoa và tất cả các thầy cô, anh chị và các bạn ở Khoa Hóa Thực Vật - Viện Dược liệu đã tận tình giúp đỡ, động viên, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong quá trình xây dựng, triển khai các bước và phân tích kết quả trong suốt quá trình em thực hiện đề tài tại đơn vị. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt 5 năm theo học tại trường. Những kiến thức này không chỉ giúp em có kiến thức hoàn thành khóa luận mà còn là hành trang cho em vững bước trong chặng đường tương lai. Cuối cùng em xin gửi lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên khích lệ em trong học tập và cuộc sống. Em xin chân thành cảm cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2021 Sinh viên Trần Ngọc Ánh
  4. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải ACN Acetonitril Acetonitril o C Độ Celcius DM/DL Dung môi : dược liệu EtOAc Ethyl Acetat Ethyl Acetat EtOH Ethanol Ethanol MeOH Methanol Methanol HPLC High Perfomance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography SKĐ Sắc kí đồ tt:tt Thể tích : thể tích kl:tt Thin layer chromatography Khối lượng : thể tích TLC Sắ c ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo
  5. MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 2 1.1. Tổng quan về Thừng mực lá to ............................................................... 2 1.1.1. Tổng quan về thực vật học ...................................................................... 2 1.1.1.1. Vị trí phân loại ..................................................................................... 2 1.1.1.2. Phân bố .. ............................................................................................. 2 1.1.2. Thành phần hóa học của Thừng mực lá to ............................................. 3 1.1.2.1. Alcaloid.... ............................................................................................ 4 1.1.2.2. Chất nhựa.... ......................................................................................... 5 1.1.2.3. Chất gôm .... ......................................................................................... 5 1.1.2.4. Các chất vô cơ.... .................................................................................. 5 1.1.3. Tác dụng dược lý của Thừng mực lá to .................................................. 6 1.1.3.1. Tác dụng chống tiêu chảy .................................................................... 6 1.1.3.2. Tác dụng kháng khuẩn ......................................................................... 6 1.1.3.3. Tác dụng điều trị tiểu đường ................................................................ 6 1.1.3.4. Tác dụng khác ...................................................................................... 7 1.1.4 Một số sản phẩm của Thừng mực lá to .................................................... 7 1.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế, định tính, định lượng Conessin từ dược liệu ...................................................................................... 8 1.2.1. Chiết xuất alcaloid toàn phần từ vỏ thân cây Thừng mực lá to ............. 8 1.2.2. Phân lập Conessin từ alcaloid toàn phần ............................................... 9 1.2.3. Một số phương pháp định tính, định lượng Conessin........................... 10 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 12 2.1. Đối tượng, nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu .................... 12 2.1.1. Đối tượng............ .................................................................................. 12 2.1.2. Nguyên vật liệu, dụng cụ, thiết bị.......................................................... 12 2.1.3. Hóa chất, dung môi ............................................................................... 12
  6. 2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 13 2.2.1. Khảo sát quy trình chiết xuất, làm giàu alcaloid từ vỏ cây Thừng mực lá to. ................................................................................................................. 13 2.2.1.1. Khảo sát quy trình chiết xuất cao tổng. ............................................. 13 2.2.1.2. Khảo sát quy trình làm giàu alcaloid từ cao tổng..............................15 2.2.2. Định lượng alcaloid bằng phương pháp HPLC. .................................. 15 2.2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng alcaloid và xác định tạp chất bằng phương pháp HPLC ............................................................................... 15 2.2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích..................... ............................... 16 2.2.2.3. Xây dựng đường chuẩn và công thức..................... ........................... 16 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 17 3.1. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu................... ..................................... 17 3.2. Khảo sát phương pháp chiết và số lần chiết ................... .................... 20 3.3. Khảo sát loại dung môi chiết................... .............................................. 23 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ DM/DL................... ............................... 28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................
  7. DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với dược liệu không làm ẩm bằng NH3 ................................................................................. 19 Bảng 2. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với dược liệu có làm ẩm bằng NH3 ............................................................................................ 19 Bảng 3. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to (PP1). ................... 21 Bảng 4. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to (PP2) ............. 22 Bảng 5. Phần trăm khối lượng cao tổng ......................................................... 23 Bảng 6. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với phương pháp chiết PPA................................................................................................. 25 Bảng 7. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với phương pháp chiết PPB................................................................................................. 26 Bảng 8. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với phương pháp chiết PPC ................................................................................................ 26 Bảng 9. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với phương pháp chiết PPD ................................................................................................ 27 Bảng 10. So sánh hiệu suất trung bình chiết xuất cao tổng của 4 phương pháp ......................................................................................................................... 27 Bảng 11. Hiệu suất chiết với tỷ lệ MD/DL: 30/1; 24/1; 24/1 ......................... 30 Bảng 12. Hiệu suất chiết với tỷ lệ MD/DL: 10/1; 8/1; 8/1 ............................. 31 Bảng 13. Hiệu suất chiết với tỷ lệ MD/DL: 7/; 5/1; 5/1 ................................. 31 Bảng 14. So sánh hiệu suất chiết của 3 tỷ lệ MD/DL ..................................... 31
  8. DANH MỤC HÌNH Hình 1. Ảnh cây Thừng mực lá to lúc ra hoa.................................................... 3 Hình 2. Ảnh cành mang hoa của cây Thừng mực lá to..................................... 3 Hình 3. Conessin ............................................................................................... 4 Hình 4. Isoconessimin ....................................................................................... 4 Hình 5. Holadysenterin ..................................................................................... 5 Hình 6. Kurchessin ............................................................................................ 5 Hình 7. Sản phẩm chứa cao vỏ thân Thừng mực lá to...................................... 7 Hình 8. Ảnh TLC so sánh alcaloid từ dịch chiết MeOH và chất chuẩn Conessin .......................................................................................................... 17 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1. Sơ đồ chiết xuất cao tổng . ................................................................ 33
  9. MỞ ĐẦU Với vị trí địa lý gần vành đai nhiệt đới, Việt Nam có hệ sinh thái thực vật phong phú. Theo một số tài liệu nghiên cứu: nước ta có 12.000 loài thực vật bậc cao thuộc hơn 2.500 chi và 300 họ. Trong đó có hơn 4.000 loài thực vật được sử dụng làm thuốc chữa bệnh [1]. Trải qua hàng ngàn năm tồn tại và phát triển của loài người. Nhân dân Việt Nam cũng như nhân dân nhiều nước khác nhau trên thế giới đã tích lũy, lưu truyền những kinh nghiệm phòng, chữa bệnh bằng cây cỏ. Tuy nhiên những bài thuốc này phần lớn còn phụ thuộc vào kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu kỹ để có cơ sở khoa học trong việc sử dụng chúng. Xu hướng sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược ngày càng tăng ở Việt Nam và các nước khác trên thế giới. Hướng nghiên cứu tìm ra các hợp chất, làm giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu được nhiều nhà khoa học quan tâm. Cây Thừng mực lá to mọc hoang ven triền núi nhiều nơi ở nước ta và một số nước trong khu vực Đông Nam Á. Từ lâu đã được nhân dân sử dụng vỏ cây để chữa lỵ amip. Tuy nhiên, các sản phẩm từ dược liệu thường có chất lượng không ổn định. Vì vậy nên việc điều chế ra cao chiết có chất lượng đảm bảo và đánh giá hàm lượng hoạt chất trong cao là rất cần thiết để bào chế các thuốc có hiệu quả. Với mong muốn góp phần xác định hàm lượng thành phần hợp chất alcaloid trong vỏ thân Thừng mực lá to và kiểm soát được chất lượng sản phẩm chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Bước đầu khảo sát nghiên cứu quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ cây Thừng mực lá to’’ với mục tiêu: - Xây dựng được quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ cây Thừng mực lá to. - Xác định được hàm lượng alcaloid trong cao. 1
  10. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Thừng mực lá to 1.1.1. Tổng quan về thực vật học 1.1.1.1. Vị trí phân loại Tên khoa học: Holarrhena antidysenterica (L.) Wall., thuộc họ Trúc đào - Apocynaceae. Tên thông thường: Thừng mực lá to Tên khác: Mức hoa trắng, Mộc hoa trắng, Sừng trâu, Mộc vài (Tày), Xi chào (K’ Ho), Hồ liên. Tên nước ngoài: Coneru (Anh), Vatsaka (Sanskrit) [21] 1.1.1.2. Phân bố Thừng mực lá to phân bố rải ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của Châu Á và Châu Phi. Cây được tìm thấy ở Myanmar, Malaysia, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Srilanka, Pakistan, Nepal ... Ở nước ta Thừng mực lá to mọc hoang ở các tỉnh miền núi và trung du như Cao Bằng, Bắc Giang, Yên Bái, Lạng Sơn, Hòa Bình, Gia Lai, Kon Tum, ... nhưng tập trung nhiều nhất ở Đắk Lắk và Nghệ An [3,4,7,8,10]. 1.1.1.3. Đặc điểm thực vật Thừng mực lá to là cây thân gỗ, có chiều cao lên đến 13m và chu vi thân lên đến 1,1m. Cành non hơi dẹt, nhẵn bóng. Cành già tròn nhẵn, màu nâu nhạt, có nốt sần nhỏ màu trắng. Lá mọc đối xứng, có cuống ngắn, không có lá mọc kèm, hình bầu dục đầu tù hay nhọn, đáy lá tròn hoặc nhọn, dài 12 - 15 cm, rộng 4 - 8 cm, mặt lá bóng, màu xanh lục nhạt, mặt dưới có lông nhỏ rất mịn và gân nổi rõ. Hoa màu trắng, rất thơm, mọc ở kẽ lá hay đầu cành, dài 5 -10 cm; đài 5 răng, có lông ở lưng; tràng 5 cánh tròn đầu, ống tràng dài 1 cm, hơi thắt ở họng, nhị 5 đính gần phía gốc ống tràng, chỉ nhị có lông, bao phấn hẹp, vòi nhụy hơi dày. 2
  11. Quả đại, mọc từng đôi thành cung trông như sừng trâu. Mỗi đài màu nâu có vân dọc, dài 15 – 30 cm, rộng 5 - 7 mm. Hạt nhiều, dài 1 - 2 cm, rộng 0,2 - 0,25 cm, màu nâu nhạt, đầu hơi dẹp, lõm một mặt. Lá gấp nếp nhiều lần, toàn cây có nhựa mủ trắng. Mùa hoa nở: tháng 3 -7, Mùa quả: tháng 6 - 12. Hình 1: Ảnh cây Thừng mực lá to lúc ra hoa Hình 2: Ảnh cành mang hoa của Thừng mực lá to 1.1.2. Thành phần hóa học của cây Thừng mực lá to Vỏ Thường mực lá to chứa alcaloid 0,4%, gôm 9,56%, nhựa 0,2%, tanin 1,14%. [7,10] Hạt Thường mực lá to chứa alcaloid 0,025%, dầu 36 - 40%, chất nhựa, tanin. [3,10] 3
  12. Lá, vỏ, hạt, vỏ thân Thường mực lá to đều chứa alcaloid. Vỏ chứa 2,82 - 3,217% alcaloid toàn phần, lá chứa 0,60% alcaloid toàn phần. [11] 1.1.2.1. Alcaloid Từ vỏ cây Thừng mực lá to người ta đã chiết xuất được các alcaloid sau: [7,10,16,19]. - Conessine C24H40N2 - Isoconessimin C23H38N2 - Holadysenterin C23H38N2O3 - Kurchessin C25H44N2 v. v ... Trong đó, alcaloid chủ yếu là Conessine. Chất Conessine có tinh thể hình lăng trụ (Kết tinh trong aceton) điểm chảy 1250, [α]D = -1,90 (trong CHCl3) hoặc 2106 (trong C2H5OH). Muối chlohydrat, bromhydrat và oxalat của conessin tồn tại dưới dạng tinh thể [9,10,19]. Hình 3: Conessin [10] Hình 4: Isoconessimin [10] 4
  13. Hình 5: Holadysenterin [10] Hình 6: Kurchessin [10] 1.1.2.2. Chất nhựa [10]. Thành phần chất nhựa trong cây Thừng mực lá to gồm có: chất nhựa mủ (nước và chất tan trong nước) chiếm (57,91%), chất cao su chiếm (1,5- 9,7%), chất tủa keo cao su chiếm (15-22,8%), chất nhựa chiếm (74,1- 82,8%), các chất không tan khác chiếm (0,9-5,9%) Hai chất alcol nhựa (resinol) được tách từ nhựa mủ là: - Lettoresinol A (C28H50O5): độ chảy 227- 2280C. - Lettoresinol B (C28H56O2): độ chảy 136 -1370C. Các chất nhựa khác được tìm thấy trong nhựa mủ: trierpen alcol, lupcol và β-sitosterol. 1.1.2.3. Chất gôm [7,10]. Chất gôm được tìm thấy trong Thừng mực lá to có màu nâu, vị đắng, tỷ trọng 1,092, chỉ số acid 65,28, chỉ số ester 106, chỉ số xà phòng 171,42 và chỉ số acetyl là 150,52. 1.1.2.4. Các chất vô cơ [10]. Thành phần các chất vô cơ trong mẫu tro từ gỗ cây Thừng mực lá to gồm các chất sau: K2CO3 (10,82%), KCl (4,2%), K2SO4 (2,48%) và chất tro không tan chiếm 80,24%. 5
  14. 1.1.3. Tác dụng dược lý của Thừng mực lá to 1.1.3.1. Tác dụng chống tiêu chảy Conessin là có tác dụng diệt amip, có tác dụng cả đối với kén và amip. Thí nghiệm ngoài cơ thể nồng độ có hiệu quả đối với Entamoeba histolytica của conesssin là: 1:71000 - 1:45000. Trên lâm sàng, người ta dùng conessin chlohydrat hay bromhydrat chữa lỵ amip. Conessin có tác dụng diệt cả Trichomonas vaginalis và Trichomonas intestinalis. [7,10,21] 1.1.3.2. Tác dụng kháng khuẩn Đối với hoạt tính kháng khuẩn, nghiên cứu quan sát vùng ức chế sự tăng trưởng (tính bằng mm) trên 3 loại vi khuẩn (Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium và Escherchia coli). Dịch chiết từ vỏ cây Thừng mực lá to cho kết quả vùng ức chế 10,05 mm cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối với Staphylococcus trong khi đối với Salmonella và E.coli, vùng ức chế chỉ tương ứng là 6,65 mm và 2,7 mm Dịch chiết từ hạt Thừng mực lá to với nồng độ 100% cũng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại Staphylococcus. Dịch chiết từ lá với nồng độ 100% cho thấy vùng ức chế đối với Staphylococcus là 4 mm, vùng ức chế đối với E.coli là 3,1 mm. Kết quả thu được trong nghiên cứu cho thấy dịch chiết (lá, vỏ thân, hạt) của Thừng mực lá to có hoạt tính kháng khuẩn tiềm năng chống lại Staphylococcus, Salmonella và E. coli [13,21] 1.1.3.3. Tác dụng điều trị tiểu đường Dịch chiết ethanol từ hạt Thừng mực lá to có tác dụng làm giảm mức đường huyết đáng kể sau ½ giờ khi dùng ở chuột tăng huyết áp. Những con chuột mắc bệnh tiểu đường cho thấy trọng lượng cơ thể giảm trong thời gian thử nghiệm điều trị bằng dịch chiết ethanol từ hạt Thừng mực lá to. Nhóm chuột bị tiểu đường được điều trị bằng glibenclamide cho thấy trọng lượng tăng lên đáng kể. Mức đường huyết giảm ở nhóm được điều trị bằng dịch chiết Thừng mực lá to làm giảm cholesterol toàn phần, triglycerid, AST, 6
  15. ALT, urê và creatinin huyết thanh [23] Dịch chiết methanol cũng cho kết quả tương tự ở chuột mắc bệnh tiểu đường. [21] 1.1.3.4. Tác dụng khác Ngoài ra alcaloid chiết xuất từ Thừng mực lá to còn có các tác dụng sau: tác dụng chống ung thư, hoạt động bảo vệ thần kinh, hoạt động chống chứng hay quên, tác dụng hạ huyết áp, làm chậm nhịp tim, chống co thắt ... [7,10,21]. 1.1.4. Một số sản phẩm chứa cao vỏ thân Thừng mực lá to - Viên nén Holanin: Viện Dược liệu - Viên Hipolten: công ty cổ phần dược vật tư y tế Hải Dương - Viên nang Mộc Hoa Trắng: công ty cổ phần dược phẩm Hà Nội - Viên nén bao phim Mộc Hoa Trắng HT: công ty dược phẩm và thiết bị Y tế Hà Tĩnh. Hình 7: Sản phẩm chứa cao vỏ thân Thừng mực lá to 7
  16. 1.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế, định tính, định lượng Conessin từ dược liệu 1.2.1. Chiết xuất alcaloid toàn phần từ vỏ thân cây Thừng mực lá to - Conessin là một alcaloid, theo nguyên tắc có thể sử dụng một trong hai phương pháp sau: A. Chiết bằng acid loãng trong cồn hoặc nước [2]. B. Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm [2,22]. - Kumar N. và cộng sự [19] đã chiết xuất alcaloid toàn phần từ vỏ thân cây Holarrhena antidysenterica ở Pragpur, Ấn Độ theo qui trình như sau: 1kg vỏ thân cây được sấy, nghiền mịn sau đó chiết bằng dung môi MeOH 5x2500ml, điều kiện nhiệt độ phòng. Gộp dịch, cô quay thu hồi dung môi, thu được 307,8g dịch chiết tổng MeOH. Sau đó chiết dịch chiết tổng với HCl 3M 3x200ml bằng phương pháp ngâm lạnh trong thời gian 24 giờ. Tiếp theo gộp dịch chiết acid, chiết tiếp bằng dung môi CHCl3 4x400ml để loại tạp. Kiềm hóa dịch chiết bằng NH4OH 30% đến pH 8,5. Chiết tiếp dịch chiết đã kiềm hóa bằng CHCl3 5x400ml. Gộp dịch chiết, cô quay thu hồi dung môi, thu được 11,9 g cắn alcaloid toàn phần (hiệu suất chiết đạt 1,19%). - Phí Tùng Lâm [6] đã chiết xuất alcaloid toàn phần trong vỏ thân cây Thừng mực lá to thu hái ở Hải Dương theo qui trình như sau: cân 50g dược liệu, làm ẩm bằng NH4OH trong vòng 12 giờ, sau đó chiết Soxhlet bằng với dung môi cloroform đến kiệt alcaloid. Gộp dịch, cô quay thu hồi dung môi thu được 0,471g cắn alcaloid base (hiệu suất chiết đạt 0,942%). - Chakraborty A. và cộng sự [14] chiết alcaloid toàn phần trong vỏ thân cây Holarrhena pubescens bằng dung môi MeOH, qui trình không được nêu cụ thể. 8
  17. Bàn luận: Cả 3 phương pháp chiết nêu trên hiệu suất chiết còn thấp và thay đổi khác nhau tùy phương pháp. Đặc biệt qui trình chiết không được nêu rõ cụ thể. Vì vậy chúng tôi mong muốn xây dựng qui trình chiết xuất alcaloid tổng số với hiệu suất cao hơn, quy trình cụ thể hơn. Một mặt khác, quy trình khảo sát được cần đảm bảo các yêu cầu về tính khả thi, an toàn và kinh tế khi nâng cấp và triển khai ứng dụng. 1.2.2. Phân lập Conessin từ alcaloid toàn phần - Kumar N. [19] phân lập Conessin từ cắn alcaloid toàn phần ở trên bằng sắc kí cột theo qui trình sau: Sử cột có pha tĩnh là alumina, pha động là hỗn hợp benzen dầu hỏa (60 - 80 0C) : EtOAc với tỉ lệ EtOAc tăng dần. Nạp vào cột 11,9g cắn alcaloid tiến hành sắc kí. Kiểm tra các phân đoạn bằng TLC. Phân đoạn từ ống 19 - 23, có tỉ lệ dung môi là benzen dầu hỏa : EtOAc (95 : 5) cho 1 vết trên SKĐ, được xác định là Conessin - Phạm Thanh Kỳ và cộng sự [8] phân lập Conessin và Norconessin trong alaloid toàn phần chiết xuất từ vỏ thân cây Thừng mực lá to bằng sắc kí cột theo qui trình sau: Sử dụng cột sắc kí kích thước 2 cm x 50 cm, lắp thẳng đứng trên giá. Nhồi cột bằng silica gel đã được ngâm trong cloroform. Cuối cùng đặt một lớp bông mỏng trên miếng giấy lọc. Mở khóa cho dung môi chảy nhiều lần, ổn định cột trong thời gian 12 giờ. Khi cột đã ổn định, tiến hành sắc kí. Mở khóa cột đến khi cloroform vừa đến bề mặt của bông thì khóa cột. Hòa tan 0,471g cắn alcaloid toàn phần trong lượng tối thiểu cloroform vào cốc mỏ. Đổ từ từ dịch cloroform vào cột. Pha động là hỗn hợp cloroform và methanol có độ phân cực tăng dần: i) CHCl3 (99,5 ml) : MeOH (0,5 ml), ii) CHCl3 (99 ml) : MeOH (1 ml), iii) CHCl3 (98,5 ml) : MeOH (1,5 ml), iiii) CHCl3 (98 ml) : MeOH (2,0 ml). Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống 2 ml. Kiểm tra dịch rửa giải bằng TLC, thu được các phân đoạn tinh khiết chỉ cho 1 vết trên SKĐ, từ ống 33 - 36 được xác định là Conessin, từ ống 85 - 98 được xác định là Norconessin. 9
  18. Bàn luận: Hai qui trình phân lập, làm giàu alcaloid trên sử dụng hệ dung môi rửa giải độc hại, chi phí cao do đó rất khó để áp dụng trong quy mô sản xuất lớn. Vì vậy chúng tôi muốn xây dựng qui trình làm giàu alcaloid với hệ dung môi phù hợp trong sản xuất công nghiệp mà vẫn đảm bảo hiệu suất cao. 1.2.3. Một số phương pháp định tính, định lượng Conessin - Định tính và định lượng Conessin trong dịch chiết dược liệu bằng GC [17]: Sử dụng máy sắc kí Shimadzu GC-8A, detector FID, cột nhồi silica gel WHP 100 - 120 mesh, pha động là khí N2 30 mL/phút, phân tách ở 250 0C, thời gian lưu Rt = 11,5 phút, khoảng tuyến tính 0,08 - 0,2% kl/tt (trong MeOH). - Định tính và định lượng Conessin trong dịch chiết dược liệu bằng HPTLC [17]: Sử dụng máy sắc kí Chromoscan 200 với pha động ethyl acetat : hexan : diethylamin (75 : 25 : 5), được phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff, sau đó phun dung dịch NaNO2 10% kl/tt để cho độ nhạy tốt nhất, Rf = 0,66, khoảng tuyến tính 0,01 - 0,1% kl/tt (pha trong dung dịch chuẩn nội), đo độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm. - Định tính và định lượng Conessin trong dịch chiết dược liệu và chế phẩm bằng HPTLC [18]: Sử dụng máy sắc kí Camag TLC Scanner III với pha động Toluen : ethyl acetat : diethylamine (6,5 : 2,5 : 1, tt/tt/tt), điều kiện nhiệt độ phòng (25 ± 2 0C), được phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff, Rf = 0,82, với khoảng tuyến tính 1- 10 µg/vết, đo độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm. - Định tính và định lượng Conessin trong dịch chiết dược liệu bằng HPTLC [120]: Sử dụng máy sắc kí Camag Linomat I với pha động benzen : ethyl acetat : diethylamin (6 : 3 : 1), khoảng cách khai triển 90 mm, thời gian khai triển 20 phút, điều kiện nhiệt độ phòng (25 ± 2 0C), được phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff, bước sóng phát hiện 254 nm. 10
  19. - Định lượng Conessin trong chế phẩm bằng HPLC [15]: Sử dụng máy sắc kí Waters (Milford, MA, USA), cột C18 (kích thước 250 x 4,6 mm x 5 µm), với pha động Methanol : nước (95 : 5), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, detector chỉ số khúc xạ. - Định lượng Conessin trong chế phẩm bằng HPLC- MS [21]: Sử dụng myáy sắc kí Waters HPLC-MS với pha động Acetonitril : nước (cả hai dung môi đều chứa acid acetic 0,1%), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, detector ZQ, máy khối phổ LCQ. Bàn luận: Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kĩ thuật tách chất hiện đại và đa năng. Đây là phương pháp có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy bởi nhiệt. Do đó chúng tôi muốn hướng đến xây dựng qui trình định lượng bằng phương pháp HPLC với điều kiện trong phòng thí nghiệm hiện có. 11
  20. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng Mẫu vỏ thân cây Thừng mực lá to được thu hái và giám định tên khoa học là Hollarena antidysenterica (L.) Wall. bởi khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu. Mẫu thực vật được phơi khô, thái lát, nghiền nhỏ trước khi đem chiết. 2.1.2. Nguyên vật liệu, dụng cụ, thiết bị - Cột thủy tinh kích thước: 2,5 cm x 30 cm; 4,5 cm x 30 cm; 4,5 cm x 50 cm; 9,3 cm x 50 cm. - Sắc ký cột: sử dụng chất hấp phụ là Silicagel Merck cỡ hạt 40-63 µm để phân lập từng phân đoạn có chứa các chất cần thiết. - Sắc ký lớp mỏng (SKLM/TLC): TLC sử dụng bản mỏng pha thuận tráng sẵn DC - Alufolien 60 F254 (Merck), các vết chất hiện màu với thuốc thử Dragendorff - Bộ dụng cụ chiết hồi lưu, tủ sấy Memmert - Đức, tủ sấy chân không, bếp cách thủy Memmert, cồn kế, bình nón, bình cầu, bát sứ, giấy lọc. - Vial, bơm tiêm, màng lọc 0,45 µm, bình định mức, pipet Pasteur thủy tinh. - Cân phân tích Precisa XT 220A, độ chính xác 0,0001g. - Cân kĩ thuật, độ chính xác 0,01g. - Máy xác định độ ẩm Precisa - Máy rung siêu âm Power Sonic 405. - Hệ thống máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu bao gồm: Hệ bơm binary LC-20AD, detector SPD-20A UV, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A HT, bộ phận ổn định nhiệt CTO-10AS của Shimadzu. Phần mềm điều khiển Labsolution. 2.1.3. Hóa chất, dung môi 12
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược