Xem mẫu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010
Nghiên cứu Y học
HIỆU QUẢ BẢO VỆ ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM
CỦA VẮC XIN CÚM AH5N1 BẤT HOẠT, TINH CHẾ
DÙNG CHO NGƯỜI SẢN XUẤT TỪ NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO
Nguyễn Kim Dung*, Nguyễn Văn Thương*, Ngô Chung Chỉnh*, Cao Thị Bảo Vân*
TÓM TẮT
Đặt vấn ñề: Nguy cơ lây nhiễm virus cúm A H5N1 gây bệnh cho gia cầm sang người và tỷ lệ chết cao ở
những người nhiễm ñã ñặt ra yêu cầu cần có vắc xin bảo vệ hiệu quả. Báo cáo này nghiên cứu hiệu quả bảo vệ
chuột Balb/c của vắc xin cúm A H5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt virus sản xuất bằng kỹ thuật nuôi tế bào Vero
khi thử thách với chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho người.
Mục tiêu nghiên cứu: Kiểm tra ñộc lực của chủng virus cúm AH5N1 phân lập từ người ñối với chuột Balb/c.
Hiệu quả bảo vệ chuột Balb/c của vắc xin khi thử thách với chủng này.
Phương pháp nghiên cứu: Xác ñịnh ñộc tính ở chuột các chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho gà và
người. Gây miễn dịch bằng vắc xin cúm AH5N1 sản xuất từ nuôi cấy tế bào Vero các liều 10 và 1mcg/0,5ml/IP (ổ
bụng) chuột nhắt trắng Balb/c 6-7 tuần tuổi, 2 mũi cách nhau 2 tuần. 4-8 tuần sau mũi thứ 2, thử thách bằng
ñường mũi (IN) hoặc tiêm não (IC) liều 4,2 – 420LD50/0,02ml chủng virus cúm AH5N1. Theo dõi 14 – 21 ngày
sau khi thử thách. So sánh tỷ lệ chuột sống ở 2 nhóm chuột tiêm vắc xin và tiêm dung dịch ñệm PBS/chất hỗ trợ
miễn dịch Hydroxyd nhôm.
Kết quả nghiên cứu: Chủng virus cúm AH5N1 (Phuc09VN-P2) phân lập từ người gây bệnh cho chuột.
Chủng có hiệu giá 102,6 /0,02ml/IN và 104,3 LD50/0.02ml/IC. Chuột tiêm vắc xin liều 10 và 1 mcg có tỷ lệ sống
100 - 67% trong khi các chuột tiêm PBS+nhôm là 60 - 0% khi thử thách ở các liều 4,2 và 420 LD50/0.02ml/IN và
IC.
Kết luận: Vắc xin cúm AH5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt virus sản xuất từ nuôi tế bào Vero cho hiệu quả
bảo vệ tốt chuột nhắt trắng chủng Balb/c khi thử thách với chủng virus cúm AH5N1 phân lập từ người.
Từ khoá: virus cúm A H5N1, ñộc lực, chuột Balb/c, hiệu quả bảo vệ của vaccin
ABSTRACT
PROTECTIVE EFFICACY OF A WHOLE-VIRION INACTIVATED PURIFIED INFLUENZA AH5N1 VACCINE
FOR HUMAN USE BASED ON VERO CELL CULTURE
Nguyen Kim Dung, Nguyen Van Thuong, Ngo Chung Chinh, Cao Thi Bao Van
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 221 - 227
Background: Transmissive risk of avian influenza AH5N1 virus to human and high mortality rate at
infectious case required an effective vaccine for prevention. Since 2006 a whole-virion inactivated purified
influenza A/H5N1 vaccine for human use based on Vero cell culture was developed at Pasteur Institute in
HoChiMinh City. The artirle informed the testing for protective efficacy in mice against lethal dose human
influenza AH5N1 virus of this vaccine.
Objectives: Determination of pathogenicity in mice Balb/c of influenza AH5N1 virus A/Vietnam/26-1/09
(Phuc09VN-P2). Testing the protective efficacy in mice of a whole-virion inactivated purified influenza A H5N1
vaccine for human use against lethal dose of this virus.
Method: Vaccinate to mice Balb/c 6 – 7 weeks-old 2 injections 2 weeks interval with doses of 10 and
1mcg/0,5ml/IP (in abdomen cavity). 4-8 weeks after 2nd injection mice were challenged with a human influenza
AH5N1 virus in doses of 4.2 – 420LD50/0,02ml/IN (intranasal) or IC (intracerebral). Observe mice for 14 – 21
days post-challenge (P. c). Consider the proportion of survival in vaccinated and control group which was
injected with PBS+Alum instead of vaccine.
Results: Vaccinated mice were healthy and survived 100 - 67% after 14 – 21 days P. c. Control group that
*
Viện Pasteur tp. Hồ Chí Minh
Địa chỉ Liên lạc: Nguyễn Kim Dung
ĐT: 0908631885 Email: kimdung@pasteur-hcm.org.vn
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010
221
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010
Nghiên cứu Y học
non-vaccinated succumbed within 10 days P. c in proportion of survival 40 - 0% at doses 4.2 – 420
LD50/0.02ml/IN & IC.
Conclusion: Whole-virion inactivated purified influenza A H5N1 vaccine based on Vero cell culture gives
sufficient protective efficacy in mice Balb/c when challenge with a human influenza AH5N1 virus.
Keywords: influenza AH5N1 virus, pathogenicity, mice Balb/c, protective efficacy.
ĐẶT VẤN ĐỀ
với ñộng vật thí nghiệm ñã ñược chọn lựa sử dụng
Nguy cơ lây nhiễm virus cúm AH5N1 gây bệnh
bao gồm gà(3), khỉ(4) và chuột(1,6,5,10,3,9). Trong ñiều kiện
cho gia cầm sang người ñã ñược ñặt ra khi từ năm
ñược trang bị một hệ thống nuôi chuột ñạt tiêu chuẩn
2003 – 2009 có ít nhất 258 người chết trong số 423 ca
an toàn sinh học cấp III, chúng tôi ñã chọn chuột
(7)
toàn thế giới. Việt nam từ năm 2003 ñến
Balb/c ñể ñánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin. Việc
tháng 3/2009 có 54 trường hợp ñược xác nhận tử
chọn lựa chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho
vong do cúm gia cầm trên tổng số 109 người mắc. Tỷ
chuột trong thử thách vắc xin là ñiều ñầu tiên ñược ñặt
lệ chết cao ở người mắc và sự lưu hành của virus này
ra.Trong ñó chủng phải gây chết ít nhất 90% chuột
trong ñàn gia cầm nuôi cũng như trong các loài chim
ñối chứng trong thời gian theo dõi 14 – 21 ngày sau
hoang dã ñòi hỏi cần có một vắc xin hiệu quả phòng
khi thử thách(9).
bệnh cúm AH5N1 cho người. Bên cạnh quy trình sản
Mục tiêu nghiên cứu
xuất vắc xin cúm từ trứng, nhiều nhà sản xuất ñã
Xác ñịnh ñộc lực của chủng virus cúm A H5N1
phân lập từ người năm 2009 ñối chuột nhắt trắng
Balb/c. Đánh giá hiệu quả bảo vệ chuột Balb/c của
vắc xin cúm A H5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt
virus sản xuất bằng kỹ thuật nuôi tế bào Vero khi thử
thách với chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho
người này.
nhiễm
nghiên cứu phát triển vắc xin cúm dựa trên nuôi cấy tế
bào ñặc biệt là tế bào Vero, loại ñã ñược Tổ chức Y tế
thế giới ñồng ý cho sử dụng trong sản xuất vắc xin
cho người(12,13). Vắc xin cúm, ñặc biệt là loại vắc xin
cúm dùng khẩn cấp trong trường hợp có ñại dịch, sản
xuất vắc xin dựa trên nuôi tế bào có ưu ñiểm là có thể
tăng qui mô nhanh chóng, yêu cầu về mặt bằng sản
xuất gọn nhẹ. Bên cạnh ñó cơ chất sử dụng nhân
chủng virus vắc xin ñược tiêu chuẩn hóa, kiểm soát dễ
dàng và ít tốn kém hơnn nhiều so với sử dụng nguyên
liệu là trứng gà có phôi. Vì thế, từ năm 2006 – 2009,
quy trình sản xuất vắc xin cúm AH5N1 bất hoạt, tinh
chế toàn hạt virus bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào Vero
ñã ñược nghiên cứu ở Viện Pasteur tP. HCM. Virus
NIBRG-14 dùng sản xuất vắc xin nhận từ Viện Quốc
gia các tiêu chuẩn sinh học và kiểm ñịnh (NIBSC) của
Anh. Đây là chủng biến ñổi di truyền dựa trên chủng
virus cúm người A/Vietnam/1194/04. Ngoài các tiêu
chuẩn chung ñối với vắc xin cúm sản xuất từ nuôi tế
bào theo Dược ñiển châu Âu, vắc xin ñược kiểm tra
hiệu quả bảo vệ ñộng vật thí nghiệm khi thử thách với
liều gây chết của chủng virus cúm AH5N1 hoang dại.
Các mô hình xem xét tính hiệu quả của vắc xin ñối
ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Vắc xin
Vắc xin cúm AH5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt
virus sản xuất từ nuôi cấy chủng NIBRG-14 (dựa trên
chủng A/Vietnam/1194/04) sử dụng dòng tế bào Vero
(WHO) ECACC 88020401. Vắc xin ñạt các tiêu
chuẩn của Dược ñiển Châu Âu (2005) ñối với vắc xin
cúm từ nuôi cấy tế bào. Một liều vắc xin 0,5ml chứa >
10mcg kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) và
Hydroxide Nhôm 1mg/liều.
Động vật thí nghiệm
Sử dụng chuột nhắt trắng chủng Balb/c 6 – 7 tuần
tuổi, cái, trọng lượng 18 – 20g nuôi trong các ñiều
kiện ñược kiểm soát về thức ăn, nước uống và chăm
sóc của Labo Chăn nuôi Viện Pasteur TP. HCM. Xem
xét khả năng bảo vệ chuột của vắc xin nghiên cứu khi
thử thách với chủng virus cúm AH5N1 có ñộc lực
cao.
Chủng virus thử thách
Chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho người có
ký hiệu A/Vietnam/26-1/09 (Phuc09VN-P2) do
Phòng thí nghiệm Virus hô hấp Viện Pasteur TP.
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010
222
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010
HCM cung cấp.
Phương pháp nghiên cứu
Đây là loại nghiên cứu can thiệp: thực nghiệm
ñánh giá hiệu quả bảo vệ chuột nhắt trắng của vắc xin.
Trong ñó chuột ñược tiêm vắc xin sau ñó thử thách
chuột bằng chủng virus cúm A H5N1 có ñộc lực cao.
Đánh giá hiệu quả bảo vệ
Quy trình gây miễn dịch, thử thách, theo dõi và
ñánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin theo các tài
liệu(1,6,5,10,3,9). Chủng virus cúm AH5N1 từ một bệnh
nhân ở Đồng tháp tháng 3/2009, có PCR dương tính
với cúm AH5N1 ñược phân lập trên tế bào MDCK.
Cấy chuyền thêm 1 lần trên MDCK và chuẩn ñộ HA
có hiệu giá 1/2048. Ký hiệu chủng là Phuc09VN-P2.
Pha loãng chủng thành các ñộ pha 10-2–10-6. Gây
nhiễm cho chuột bằng ñường mũi các ñộ pha 10-2 –
10-6 và tiêm não (IC) các ñộ pha 10-3 – 10-6 liều
0,02ml/chuột. Mỗi nhóm 5 chuột. Theo dõi chuột 21
ngày sau gây nhiễm. Ghi nhận số chuột chết. Tính tỷ
lệ và liều gây chết 50% chuột (LD50) của các nhóm.
Gây miễn dịch bằng vắc xin cúm AH5N1 sản
xuất từ nuôi cấy tế bào Vero các liều 10 và
1mcg/0,5ml/IP (ổ bụng) chuột nhắt trắng Balb/c 6-7
tuần tuổi, tiêm 2 mũi cách nhau 2 - 4 tuần. Song
song tiêm cho nhóm chuột dùng ñối chứng dung
dịch ñệm PBS có chất bổ trợ miễn dịch Hydroxide
nhôm. 4 - 8 tuần sau mũi thứ 2, thử thách bằng
ñường mũi (IN) hoặc tiêm não (IC) liều 4,2 –
420LD50/0,02ml chủng virus cúm người AH5N1.
Mỗi nhóm dùng 10 chuột. Theo dõi 14 – 21 ngày
sau khi thử thách. So sánh tỷ lệ chuột sống ở 2
nhóm chuột tiêm vắc xin và ñối chứng.
Thiết bị nuôi chuột và theo dõi
Phân lập, kiểm tra ñộc lực virus cúm AH5N1 gây
bệnh cho người trên chuột Balb/c ñược thực hiện
trong các thiết bị cách ly an toàn sinh học cấp III
(Isolator Biosafety Class III) và thiết bị nuôi chuột có
lọc HEPA, áp xuất âm BCU-080033-A
ALLENTOWN ñặt trong khu vực ñược kiểm soát của
Viện Pasteur tP. HCM.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu Y học
Tính gây bệnh cho chuột của chủng cúm
AH5N1 phân lập từ người
Chủng Phuc09VN-P2 gây nhiễm qua ñường mũi
làm chết chuột Balb/C từ ngày thứ 7 ñến ngày thứ 9.
Gây nhiễm qua tiêm não gây chết chuột sớm từ ngày
thứ 2 ñến ngày thứ 6.
Bảng 1: Liều gây chết 50% chuột gây nhiễm qua nhỏ
mũi (IN) và tiêm não (IC)
Đường gây
nhiễm
nhỏ mũi (IN)
tiêm não (IC)
Độ pha
loãng
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
LD50
10-3
10-4
10-5
10-6
LD50
Số chuột
sống
0
4
5
5
5
0
2
4
5
Số chuột
Tỷ lệ %
chết
chết
5
100
1
20
0
0
0
0
0
0
10-2,6/0,02ml
5
100
3
60
1
20
0
0
10-4,3/0,02ml
Độc lực của chủng cúm AH5N1 Phuc09VN-P2 là
102,6 LD50/0,02ml khi gây nhiễm chuột nhắt trắng
chủng Balb/c qua ñường mũi (IN), trong khi ñó ñộc
lực của chủng gây nhiễm qua ñường não lên ñến 104,3
LD50/0,02ml (IC). Như vậy ñộc lực của chủng
Phuc09VN-P2 ñối với chuột có thể dao ñộng trong
khoảng từ 400 – 20000 LD50/0,02ml.
Hiệu quả bảo vệ của vắc xin cúm AH5N1 ñối
với chuột Balb/c khi thử thách bằng chủng
cúm AH5N1 gây bệnh cho người Phuc09VNP2
Tỷ lệ sống của chuột ñối chứng
Gây nhiễm cho chuột ñối chứng liều 4,2LD50/IN
chỉ làm 40% chuột chết trong khi liều 420LD50/IN
gây chết 100% chuột trong vòng 8 - 9 ngày. Liều
4,2LD50 gây chết chuột từ ngày thứ 8 còn liều
420LD50 gây chết chuột từ ngày thứ 6. Tỷ lệ sống sót
của chuột ñối chứng sau thử thách trình bày trong
Biểu ñố 1.
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010
223
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010
Nghiên cứu Y học
Độc lực ñối với chuột Balb/c của chủng virus cúm AH5N1 (Phuc09VN-P2)
gây bệnh cho người
Tỷ lệ % chuột sống
120
100
80
60
40
20
N21
N20
N19
N18
N17
N16
N15
N14
N13
N12
N11
N9
N10
N8
N7
N6
N5
N4
N3
N2
N1
0
Ngày theo dõi
Liều 420 LD50/IN
Liều 4,2 LD50/IN
Biểu ñồ 1: Tỷ lệ chuột sống ở nhóm chuột tiêm PBS + chất bổ trợ miễn dịch hydroxide nhôm
Chủng Phuc09VN-P2 liều 420LD50/IN ñạt tiêu
Tỷ lệ sống ở chuột tiêm vắc xin
chuẩn gây chết >90% chuột từ 14 – 21 ngày sau khi
Chuột tiêm liều 10mcg có tỷ lệ sống 100% ở tất
thử thách.
cả các liều thử thách và ñường gây nhiễm (Biểu ñồ 2).
Chuột tiêm liều 1mcg có tỷ lệ sống 100% ở liều
4,2LD50/IN, 80% ở liều 420LD50/IN và 67% liều
420LD50/IC (Biểu ñồ 3).
Hình 1. Chuột ñối chứng sau 6 ngày, liều 420
LD50/0,02ml/IN. Chuột ủ rũ, một con hấp hối
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010
224
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010
Nghiên cứu Y học
Hiệu quả bảo vệ của vắc xin 10mcg ở các liều virus thử thách
120
Tỷ lệ % chuột sống
100
80
4,2 LD50/IN
60
420 LD50/IN
40
420 LD50/IC
20
N1
N2
N3
N4
N5
N6
N7
N8
N9
N10
N11
N12
N13
N14
N15
N16
N17
N18
N19
N20
N21
0
Ngày theo dõi
Biểu ñồ 2: Tỷ lệ sống của nhóm chuột tiêm vắc xin 10mcg/ liều x 2 liều
Hiệu quả bảo vệ của vắc xin 1mcg ở các liều virus thử thách
120
Tỷ lệ % chuột sống
100
80
4,2 LD50/IN
60
420 LD50/IN
40
420 LD50/IC
20
N1
N2
N3
N4
N5
N6
N7
N8
N9
N10
N11
N12
N13
N14
N15
N16
N17
N18
N19
N20
N21
0
Ngày theo dõi
Biểu ñồ 3: Tỷ lệ sống của nhóm chuột tiêm vắc xin 1mcg/ liều x 2 liều
.
Hình 2: Chuột tiêm vắc xin liều 10mcg khỏe mạnh sau 21 ngày
BÀN LUẬN
Về tính gây bệnh cho ñộng vật thí nghiệm của các chủng cúm AH5N1
Trước khi có chủng virus cúm AH5N1 phân lập từ người năm 2009, nhóm nghiên cứu cũng ñã
xem xét tính gây bệnh cho chuột của các chủng virus cúm AH5N1 Clade 1.2; 2.1; 2.2, 7 và QN phân
lập từ gia cầm do Trung tâm Chẩn ñoán thú y trung ương cung cấp. Các chủng virus cúm gia cầm
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010
225
nguon tai.lieu . vn
Nghiên cứu Y học
HIỆU QUẢ BẢO VỆ ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM
CỦA VẮC XIN CÚM AH5N1 BẤT HOẠT, TINH CHẾ
DÙNG CHO NGƯỜI SẢN XUẤT TỪ NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO
Nguyễn Kim Dung*, Nguyễn Văn Thương*, Ngô Chung Chỉnh*, Cao Thị Bảo Vân*
TÓM TẮT
Đặt vấn ñề: Nguy cơ lây nhiễm virus cúm A H5N1 gây bệnh cho gia cầm sang người và tỷ lệ chết cao ở
những người nhiễm ñã ñặt ra yêu cầu cần có vắc xin bảo vệ hiệu quả. Báo cáo này nghiên cứu hiệu quả bảo vệ
chuột Balb/c của vắc xin cúm A H5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt virus sản xuất bằng kỹ thuật nuôi tế bào Vero
khi thử thách với chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho người.
Mục tiêu nghiên cứu: Kiểm tra ñộc lực của chủng virus cúm AH5N1 phân lập từ người ñối với chuột Balb/c.
Hiệu quả bảo vệ chuột Balb/c của vắc xin khi thử thách với chủng này.
Phương pháp nghiên cứu: Xác ñịnh ñộc tính ở chuột các chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho gà và
người. Gây miễn dịch bằng vắc xin cúm AH5N1 sản xuất từ nuôi cấy tế bào Vero các liều 10 và 1mcg/0,5ml/IP (ổ
bụng) chuột nhắt trắng Balb/c 6-7 tuần tuổi, 2 mũi cách nhau 2 tuần. 4-8 tuần sau mũi thứ 2, thử thách bằng
ñường mũi (IN) hoặc tiêm não (IC) liều 4,2 – 420LD50/0,02ml chủng virus cúm AH5N1. Theo dõi 14 – 21 ngày
sau khi thử thách. So sánh tỷ lệ chuột sống ở 2 nhóm chuột tiêm vắc xin và tiêm dung dịch ñệm PBS/chất hỗ trợ
miễn dịch Hydroxyd nhôm.
Kết quả nghiên cứu: Chủng virus cúm AH5N1 (Phuc09VN-P2) phân lập từ người gây bệnh cho chuột.
Chủng có hiệu giá 102,6 /0,02ml/IN và 104,3 LD50/0.02ml/IC. Chuột tiêm vắc xin liều 10 và 1 mcg có tỷ lệ sống
100 - 67% trong khi các chuột tiêm PBS+nhôm là 60 - 0% khi thử thách ở các liều 4,2 và 420 LD50/0.02ml/IN và
IC.
Kết luận: Vắc xin cúm AH5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt virus sản xuất từ nuôi tế bào Vero cho hiệu quả
bảo vệ tốt chuột nhắt trắng chủng Balb/c khi thử thách với chủng virus cúm AH5N1 phân lập từ người.
Từ khoá: virus cúm A H5N1, ñộc lực, chuột Balb/c, hiệu quả bảo vệ của vaccin
ABSTRACT
PROTECTIVE EFFICACY OF A WHOLE-VIRION INACTIVATED PURIFIED INFLUENZA AH5N1 VACCINE
FOR HUMAN USE BASED ON VERO CELL CULTURE
Nguyen Kim Dung, Nguyen Van Thuong, Ngo Chung Chinh, Cao Thi Bao Van
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 221 - 227
Background: Transmissive risk of avian influenza AH5N1 virus to human and high mortality rate at
infectious case required an effective vaccine for prevention. Since 2006 a whole-virion inactivated purified
influenza A/H5N1 vaccine for human use based on Vero cell culture was developed at Pasteur Institute in
HoChiMinh City. The artirle informed the testing for protective efficacy in mice against lethal dose human
influenza AH5N1 virus of this vaccine.
Objectives: Determination of pathogenicity in mice Balb/c of influenza AH5N1 virus A/Vietnam/26-1/09
(Phuc09VN-P2). Testing the protective efficacy in mice of a whole-virion inactivated purified influenza A H5N1
vaccine for human use against lethal dose of this virus.
Method: Vaccinate to mice Balb/c 6 – 7 weeks-old 2 injections 2 weeks interval with doses of 10 and
1mcg/0,5ml/IP (in abdomen cavity). 4-8 weeks after 2nd injection mice were challenged with a human influenza
AH5N1 virus in doses of 4.2 – 420LD50/0,02ml/IN (intranasal) or IC (intracerebral). Observe mice for 14 – 21
days post-challenge (P. c). Consider the proportion of survival in vaccinated and control group which was
injected with PBS+Alum instead of vaccine.
Results: Vaccinated mice were healthy and survived 100 - 67% after 14 – 21 days P. c. Control group that
*
Viện Pasteur tp. Hồ Chí Minh
Địa chỉ Liên lạc: Nguyễn Kim Dung
ĐT: 0908631885 Email: kimdung@pasteur-hcm.org.vn
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010
221
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010
Nghiên cứu Y học
non-vaccinated succumbed within 10 days P. c in proportion of survival 40 - 0% at doses 4.2 – 420
LD50/0.02ml/IN & IC.
Conclusion: Whole-virion inactivated purified influenza A H5N1 vaccine based on Vero cell culture gives
sufficient protective efficacy in mice Balb/c when challenge with a human influenza AH5N1 virus.
Keywords: influenza AH5N1 virus, pathogenicity, mice Balb/c, protective efficacy.
ĐẶT VẤN ĐỀ
với ñộng vật thí nghiệm ñã ñược chọn lựa sử dụng
Nguy cơ lây nhiễm virus cúm AH5N1 gây bệnh
bao gồm gà(3), khỉ(4) và chuột(1,6,5,10,3,9). Trong ñiều kiện
cho gia cầm sang người ñã ñược ñặt ra khi từ năm
ñược trang bị một hệ thống nuôi chuột ñạt tiêu chuẩn
2003 – 2009 có ít nhất 258 người chết trong số 423 ca
an toàn sinh học cấp III, chúng tôi ñã chọn chuột
(7)
toàn thế giới. Việt nam từ năm 2003 ñến
Balb/c ñể ñánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin. Việc
tháng 3/2009 có 54 trường hợp ñược xác nhận tử
chọn lựa chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho
vong do cúm gia cầm trên tổng số 109 người mắc. Tỷ
chuột trong thử thách vắc xin là ñiều ñầu tiên ñược ñặt
lệ chết cao ở người mắc và sự lưu hành của virus này
ra.Trong ñó chủng phải gây chết ít nhất 90% chuột
trong ñàn gia cầm nuôi cũng như trong các loài chim
ñối chứng trong thời gian theo dõi 14 – 21 ngày sau
hoang dã ñòi hỏi cần có một vắc xin hiệu quả phòng
khi thử thách(9).
bệnh cúm AH5N1 cho người. Bên cạnh quy trình sản
Mục tiêu nghiên cứu
xuất vắc xin cúm từ trứng, nhiều nhà sản xuất ñã
Xác ñịnh ñộc lực của chủng virus cúm A H5N1
phân lập từ người năm 2009 ñối chuột nhắt trắng
Balb/c. Đánh giá hiệu quả bảo vệ chuột Balb/c của
vắc xin cúm A H5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt
virus sản xuất bằng kỹ thuật nuôi tế bào Vero khi thử
thách với chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho
người này.
nhiễm
nghiên cứu phát triển vắc xin cúm dựa trên nuôi cấy tế
bào ñặc biệt là tế bào Vero, loại ñã ñược Tổ chức Y tế
thế giới ñồng ý cho sử dụng trong sản xuất vắc xin
cho người(12,13). Vắc xin cúm, ñặc biệt là loại vắc xin
cúm dùng khẩn cấp trong trường hợp có ñại dịch, sản
xuất vắc xin dựa trên nuôi tế bào có ưu ñiểm là có thể
tăng qui mô nhanh chóng, yêu cầu về mặt bằng sản
xuất gọn nhẹ. Bên cạnh ñó cơ chất sử dụng nhân
chủng virus vắc xin ñược tiêu chuẩn hóa, kiểm soát dễ
dàng và ít tốn kém hơnn nhiều so với sử dụng nguyên
liệu là trứng gà có phôi. Vì thế, từ năm 2006 – 2009,
quy trình sản xuất vắc xin cúm AH5N1 bất hoạt, tinh
chế toàn hạt virus bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào Vero
ñã ñược nghiên cứu ở Viện Pasteur tP. HCM. Virus
NIBRG-14 dùng sản xuất vắc xin nhận từ Viện Quốc
gia các tiêu chuẩn sinh học và kiểm ñịnh (NIBSC) của
Anh. Đây là chủng biến ñổi di truyền dựa trên chủng
virus cúm người A/Vietnam/1194/04. Ngoài các tiêu
chuẩn chung ñối với vắc xin cúm sản xuất từ nuôi tế
bào theo Dược ñiển châu Âu, vắc xin ñược kiểm tra
hiệu quả bảo vệ ñộng vật thí nghiệm khi thử thách với
liều gây chết của chủng virus cúm AH5N1 hoang dại.
Các mô hình xem xét tính hiệu quả của vắc xin ñối
ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Vắc xin
Vắc xin cúm AH5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt
virus sản xuất từ nuôi cấy chủng NIBRG-14 (dựa trên
chủng A/Vietnam/1194/04) sử dụng dòng tế bào Vero
(WHO) ECACC 88020401. Vắc xin ñạt các tiêu
chuẩn của Dược ñiển Châu Âu (2005) ñối với vắc xin
cúm từ nuôi cấy tế bào. Một liều vắc xin 0,5ml chứa >
10mcg kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) và
Hydroxide Nhôm 1mg/liều.
Động vật thí nghiệm
Sử dụng chuột nhắt trắng chủng Balb/c 6 – 7 tuần
tuổi, cái, trọng lượng 18 – 20g nuôi trong các ñiều
kiện ñược kiểm soát về thức ăn, nước uống và chăm
sóc của Labo Chăn nuôi Viện Pasteur TP. HCM. Xem
xét khả năng bảo vệ chuột của vắc xin nghiên cứu khi
thử thách với chủng virus cúm AH5N1 có ñộc lực
cao.
Chủng virus thử thách
Chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho người có
ký hiệu A/Vietnam/26-1/09 (Phuc09VN-P2) do
Phòng thí nghiệm Virus hô hấp Viện Pasteur TP.
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010
222
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010
HCM cung cấp.
Phương pháp nghiên cứu
Đây là loại nghiên cứu can thiệp: thực nghiệm
ñánh giá hiệu quả bảo vệ chuột nhắt trắng của vắc xin.
Trong ñó chuột ñược tiêm vắc xin sau ñó thử thách
chuột bằng chủng virus cúm A H5N1 có ñộc lực cao.
Đánh giá hiệu quả bảo vệ
Quy trình gây miễn dịch, thử thách, theo dõi và
ñánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin theo các tài
liệu(1,6,5,10,3,9). Chủng virus cúm AH5N1 từ một bệnh
nhân ở Đồng tháp tháng 3/2009, có PCR dương tính
với cúm AH5N1 ñược phân lập trên tế bào MDCK.
Cấy chuyền thêm 1 lần trên MDCK và chuẩn ñộ HA
có hiệu giá 1/2048. Ký hiệu chủng là Phuc09VN-P2.
Pha loãng chủng thành các ñộ pha 10-2–10-6. Gây
nhiễm cho chuột bằng ñường mũi các ñộ pha 10-2 –
10-6 và tiêm não (IC) các ñộ pha 10-3 – 10-6 liều
0,02ml/chuột. Mỗi nhóm 5 chuột. Theo dõi chuột 21
ngày sau gây nhiễm. Ghi nhận số chuột chết. Tính tỷ
lệ và liều gây chết 50% chuột (LD50) của các nhóm.
Gây miễn dịch bằng vắc xin cúm AH5N1 sản
xuất từ nuôi cấy tế bào Vero các liều 10 và
1mcg/0,5ml/IP (ổ bụng) chuột nhắt trắng Balb/c 6-7
tuần tuổi, tiêm 2 mũi cách nhau 2 - 4 tuần. Song
song tiêm cho nhóm chuột dùng ñối chứng dung
dịch ñệm PBS có chất bổ trợ miễn dịch Hydroxide
nhôm. 4 - 8 tuần sau mũi thứ 2, thử thách bằng
ñường mũi (IN) hoặc tiêm não (IC) liều 4,2 –
420LD50/0,02ml chủng virus cúm người AH5N1.
Mỗi nhóm dùng 10 chuột. Theo dõi 14 – 21 ngày
sau khi thử thách. So sánh tỷ lệ chuột sống ở 2
nhóm chuột tiêm vắc xin và ñối chứng.
Thiết bị nuôi chuột và theo dõi
Phân lập, kiểm tra ñộc lực virus cúm AH5N1 gây
bệnh cho người trên chuột Balb/c ñược thực hiện
trong các thiết bị cách ly an toàn sinh học cấp III
(Isolator Biosafety Class III) và thiết bị nuôi chuột có
lọc HEPA, áp xuất âm BCU-080033-A
ALLENTOWN ñặt trong khu vực ñược kiểm soát của
Viện Pasteur tP. HCM.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu Y học
Tính gây bệnh cho chuột của chủng cúm
AH5N1 phân lập từ người
Chủng Phuc09VN-P2 gây nhiễm qua ñường mũi
làm chết chuột Balb/C từ ngày thứ 7 ñến ngày thứ 9.
Gây nhiễm qua tiêm não gây chết chuột sớm từ ngày
thứ 2 ñến ngày thứ 6.
Bảng 1: Liều gây chết 50% chuột gây nhiễm qua nhỏ
mũi (IN) và tiêm não (IC)
Đường gây
nhiễm
nhỏ mũi (IN)
tiêm não (IC)
Độ pha
loãng
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
LD50
10-3
10-4
10-5
10-6
LD50
Số chuột
sống
0
4
5
5
5
0
2
4
5
Số chuột
Tỷ lệ %
chết
chết
5
100
1
20
0
0
0
0
0
0
10-2,6/0,02ml
5
100
3
60
1
20
0
0
10-4,3/0,02ml
Độc lực của chủng cúm AH5N1 Phuc09VN-P2 là
102,6 LD50/0,02ml khi gây nhiễm chuột nhắt trắng
chủng Balb/c qua ñường mũi (IN), trong khi ñó ñộc
lực của chủng gây nhiễm qua ñường não lên ñến 104,3
LD50/0,02ml (IC). Như vậy ñộc lực của chủng
Phuc09VN-P2 ñối với chuột có thể dao ñộng trong
khoảng từ 400 – 20000 LD50/0,02ml.
Hiệu quả bảo vệ của vắc xin cúm AH5N1 ñối
với chuột Balb/c khi thử thách bằng chủng
cúm AH5N1 gây bệnh cho người Phuc09VNP2
Tỷ lệ sống của chuột ñối chứng
Gây nhiễm cho chuột ñối chứng liều 4,2LD50/IN
chỉ làm 40% chuột chết trong khi liều 420LD50/IN
gây chết 100% chuột trong vòng 8 - 9 ngày. Liều
4,2LD50 gây chết chuột từ ngày thứ 8 còn liều
420LD50 gây chết chuột từ ngày thứ 6. Tỷ lệ sống sót
của chuột ñối chứng sau thử thách trình bày trong
Biểu ñố 1.
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010
223
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010
Nghiên cứu Y học
Độc lực ñối với chuột Balb/c của chủng virus cúm AH5N1 (Phuc09VN-P2)
gây bệnh cho người
Tỷ lệ % chuột sống
120
100
80
60
40
20
N21
N20
N19
N18
N17
N16
N15
N14
N13
N12
N11
N9
N10
N8
N7
N6
N5
N4
N3
N2
N1
0
Ngày theo dõi
Liều 420 LD50/IN
Liều 4,2 LD50/IN
Biểu ñồ 1: Tỷ lệ chuột sống ở nhóm chuột tiêm PBS + chất bổ trợ miễn dịch hydroxide nhôm
Chủng Phuc09VN-P2 liều 420LD50/IN ñạt tiêu
Tỷ lệ sống ở chuột tiêm vắc xin
chuẩn gây chết >90% chuột từ 14 – 21 ngày sau khi
Chuột tiêm liều 10mcg có tỷ lệ sống 100% ở tất
thử thách.
cả các liều thử thách và ñường gây nhiễm (Biểu ñồ 2).
Chuột tiêm liều 1mcg có tỷ lệ sống 100% ở liều
4,2LD50/IN, 80% ở liều 420LD50/IN và 67% liều
420LD50/IC (Biểu ñồ 3).
Hình 1. Chuột ñối chứng sau 6 ngày, liều 420
LD50/0,02ml/IN. Chuột ủ rũ, một con hấp hối
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010
224
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010
Nghiên cứu Y học
Hiệu quả bảo vệ của vắc xin 10mcg ở các liều virus thử thách
120
Tỷ lệ % chuột sống
100
80
4,2 LD50/IN
60
420 LD50/IN
40
420 LD50/IC
20
N1
N2
N3
N4
N5
N6
N7
N8
N9
N10
N11
N12
N13
N14
N15
N16
N17
N18
N19
N20
N21
0
Ngày theo dõi
Biểu ñồ 2: Tỷ lệ sống của nhóm chuột tiêm vắc xin 10mcg/ liều x 2 liều
Hiệu quả bảo vệ của vắc xin 1mcg ở các liều virus thử thách
120
Tỷ lệ % chuột sống
100
80
4,2 LD50/IN
60
420 LD50/IN
40
420 LD50/IC
20
N1
N2
N3
N4
N5
N6
N7
N8
N9
N10
N11
N12
N13
N14
N15
N16
N17
N18
N19
N20
N21
0
Ngày theo dõi
Biểu ñồ 3: Tỷ lệ sống của nhóm chuột tiêm vắc xin 1mcg/ liều x 2 liều
.
Hình 2: Chuột tiêm vắc xin liều 10mcg khỏe mạnh sau 21 ngày
BÀN LUẬN
Về tính gây bệnh cho ñộng vật thí nghiệm của các chủng cúm AH5N1
Trước khi có chủng virus cúm AH5N1 phân lập từ người năm 2009, nhóm nghiên cứu cũng ñã
xem xét tính gây bệnh cho chuột của các chủng virus cúm AH5N1 Clade 1.2; 2.1; 2.2, 7 và QN phân
lập từ gia cầm do Trung tâm Chẩn ñoán thú y trung ương cung cấp. Các chủng virus cúm gia cầm
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010
225