Xem mẫu
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
ĐỊNH LƯỢNG ACID HOMOVANILLIC (HVA)
VÀ ACID VANILLYLMANDELIC (VMA) TRONG NƯỚC TIỂU
BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
Trần Thị Chi Mai1, Trần Thị Thu Trang2, Hoàng Trung Kiên2
1
Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương
Nghiên cứu này nhằm xây dựng và hiệu chuẩn quy trình kỹ thuật định lượng đồng thời acid homovanillic
(HVA) và acid vanillylmandelic (VMA) niệu bằng sắc ký khí khối phổ. Phương pháp định lượng đồng thời HVA và
VMA niệu bằng sắc ký khí khối phổ (GCMS) được xây dựng dựa trên phương pháp phân tích acid hữu cơ: tách
chiết HVA và VMA trong nước tiểu, tạo dẫn xuất di - và tri (trimethylsilyl), phân tách và định lượng bằng phương
pháp SIM trên GCMS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,9 µmol/L cho HVA và VMA. Khoảng tuyến tính
của HVA là 5,68 đến 192,9 µmol/L, của VMA là 3,2 đến 221 µmol/L. Sai số toàn bộ tính toán của phương pháp nhỏ
hơn sai số cho phép. Qui trình kỹ thuật định lượng đồng thời VMA và HVA niệu bằng phương pháp GCMS xây dựng
được là chính xác và xác thực, có thể sử dụng để phục vụ chẩn đoán và theo dõi điều trị u nguyên bào thần kinh.
Từ khoá: acid homovanillic, acid vanillylmandelic, sắc ký khí khối phổ, u nguyên bào thần kinh
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Các khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh
như u nguyên bào thần kinh (UNBTKNeuroblastoma) hay u tuỷ thượng thận
(Pheochrocytomas) có đặc điểm là tăng bài
tiết catecholamin. Do vậy, việc định lượng
catecholamin (noradrenalin, adrenalin) và các
sản phẩm chuyển hoá của chúng như acid
homovanillic (HVA) và acid vanillylmandelic
(VMA) đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán
và theo dõi điều trị các bệnh nhân u nguyên
bào thần kinh, u tuỷ thượng thận [1; 2].
Trên thế giới, phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (High Performance liquid choromatography- HPLC) thường được sử dụng
định lượng HVA và VMA trong nước tiểu.Tại
Việt Nam, có rất ít phòng xét nghiệm định
lượng VMA niệu và phương pháp sử dụng là
đo quang sau khi đã tiến hành tinh sạch một
Địa chỉ liên hệ: Trần Thị Chi Mai, Khoa Kỹ thuật Y học,
Trường Đại học Y Hà Nội
Email: mai.duong2@yahoo.com
Ngày nhận: 08/01/2013
Ngày được chấp thuận: 26/4/2013
TCNCYH 82 (2) - 2013
phần VMA bằng sắc ký trao đổi ion. Phương
pháp này rẻ tiền, đơn giản nhưng độ chính
xác không cao vì nhiều yếu tố nhiễu. Trước
khi định lượng VMA niệu bệnh nhân không
được ăn một số thực phẩm như chuối, sô cô
la. Hiện tại chưa có phòng xét nghiệm nào ở
Việt Nam triển khai kỹ thuật định lượng HVA
niệu. Việc định lượng đồng thời HVA và VMA
niệu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ là
một phương pháp nhạy và đặc hiệu, được
nhiều tác giả trên thế giới phát triển và sử
dụng trong sàng lọc và chẩn đoán u nguyên bào
thần kinh [1; 2]. Việc chuẩn hóa kỹ thuật này và
đưa vào ứng dụng trong điều kiện phòng xét
nghiệm của nước ta nhằm cải thiện việc chẩn
đoán và theo dõi u nguyên bào thần kinh là
cần thiết. Vì vậy đề tài này được tiến hành với
mục tiêu: xây dựng và hiệu chuẩn qui trình kỹ
thuật định lượng đồng thời VMA và HVA niệu
bằng phương pháp sắc ký khối phổ.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Chất liệu nghiên cứu
Thiết bị: GCMS (GC 7890A - MS 5975)
của Agilent. Cột sắc ký HP- 5MS 30m x 0,25
1
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
mm internal diameter x 0,25 um film thickness
(Agilent).Hệ thống làm bay hơi dung môi bằng
khí nitơ.
Hóa chất: Acid 3-phenylbutyric của hãng
Sigma- Aldrich, BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)
trifluoroacetamide) của hãng Supelco, Ethyl
acetate của Fluka. Lyphocheck Quantitative
Urine Control level 1 và level 2 của hãng
Bio-Rad. Chuẩn HVA/VMA (Calibrator for
HVA/VMA urine) của hãng Recipe. Các dung
môi và hoá chất khác của hãng Merck đều có
độ tinh khiết ở mức phân tích.
Bệnh phẩm: Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên
của trẻ khoẻ mạnh và trẻ bị u nguyên bào thần
kinh, được acid hoá bằng HCl 6M ngay sau
khi thu thập và được bảo quản ở -20oC cho
đến khi phân tích.
2. Phương pháp
2.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật định
lượng đồng thời HVA và VMA niệu
Chuẩn bị mẫu: cho 50 µl nội chuẩn acid
3- phenyl butyric vào 1 ml nước tiểu, hỗn hợp
trên được bão hòa bằng NaCl và được chiết
tách bằng ethyl acetate trong môi trường acid
(pH < 1). Làm khô mẫu được tách chiết bằng
khí nitơ. Ủ mẫu với BSTFA trong 75 phút ở
80°C để gắn các nhóm trimethylsilyl (trong
BSTFA) với 2 nhóm -OH của phân tử HVA,
với 3 nhóm -OH của VMA.
Phân tích GCMS được tiến hành trên cột
sắc ký HP - 5MS 30m x 0,25 mm internal
diameter x 0,25 um film thickness (Agilent).
Mẫu được bơm bằng bộ bơm mẫu tự động
Agilent 7693. Chương trình nhiệt độ lò từ
160oC đến 280oC trong vòng 15,8 phút. Tốc
độ khí He qua cột là 1 ml/ phút. HVA và VMA
được phát hiện bằng phổ khối theo phương
pháp SIM (selected ion monitoring). Các ion
đặc hiệu cho mỗi chất được lựa chọn. Đường
chuẩn được xây dựng bằng chạy các hỗn hợp
2
chuẩn chứa một lượng HVA và VMA chuẩn đã
biết và chuẩn nội. Ba mức chuẩn được phân
tích trên sắc ký khối phổ mỗi khi chạy mẫu
thử, các đỉnh tạo ra được đo bằng phương
pháp SIM và đường chuẩn ba điểm được
thiết lập cho mỗi chất phân tích. Sau khi thiết
lập đường chuẩn ba điểm cho HVA và VMA,
định lượng HVA và VMA trong mẫu thử bằng
phần mềm Chemstation. Sử dụng chuẩn nội
để hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình
chuẩn bị mẫu. Hai mức vật liệu kiểm tra chất
lượng (QC- Quality Control material) được
chạy cùng với bệnh phẩm trong mỗi lần làm
xét nghiệm định lượng HVA và VMA trong
nước tiểu.
2.2. Các thực nghiệm đánh giá kỹ thuật
Xác định giới hạn phát hiện: Tiến hành pha
loãng 2, 4, 8, 16, 32 và 64 lần dung dịch
chuẩn có nồng độ cao nhất bằng HCl 0,2 M
(dung môi dùng pha chuẩn). Các chuẩn pha
loãng được chạy 5 lần trong một đợt phân tích
theo quy trình chuẩn (standard operation procedures- SOP), tính SD và CV tại các nồng độ
để xác định nồng độ thấp nhất định lượng
được có độ chính xác chấp nhận (giới hạn
phát hiện).
Thực nghiệm đánh giá độ tuyến tính:
Chuẩn bị hai hỗn hợp nước tiểu của bệnh nhân.
Hỗn hợp thứ nhất là các mẫu đã phân tích có
nồng độ thấp. Hỗn hợp thứ hai là các mẫu đã
phân tích có nồng độ cao gần với hoặc cao hơn
giá trị trên dự đoán của khoảng phân tích. Trộn
hai mẫu bệnh phẩm trên với các tỷ lệ như sau
1/0, 3/1, 1/1, 1/3 và 0/1. Tiến hành phân tích
định lượng HVA và VMA trong 5 mẫu trên.
Mỗi mẫu làm lặp lại 03 lần. Tính giá trị trung
bình thu được của mỗi mẫu. Vẽ đồ thị để đánh
giá độ tuyến tính bằng phần mềm Linchecker
của Philippe Marquis: trục hoành là nồng độ
tính toán lý thuyết, trục tung là nồng độ trung
TCNCYH 82 (2) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
bình đo được. Tính toán độ dốc (slope) và
giao điểm với trục Y (intercept). So sánh độ
dốc và giao điểm tính toán được với độ dốc và
giao điểm mong muốn (là 1 và 0,0).
Xác định độ chính xác: Hai loại vật liệu
kiểm tra chất lượng (QC) bình thường và
bệnh lý được phân tích trong một lần chạy,
mỗi mẫu được chạy 15 lần (n = 15) để thu
thập dữ liệu và đánh giá độ chính xác trong
một lần chạy. Hai loại QC nước tiểu bình
thường và bệnh lý được chạy trong 20 mẻ
khác nhau trong vòng 3 tháng (n = 20). Tính
giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, và CV để
đánh giá độ chính xác trong một lần chạy và
giữa các lần chạy. Tiêu chuẩn chấp nhận: Độ
chính xác trong một lần chạy: SD < 0,25 sai
số toàn bộ cho phép. Độ chính xác giữa các
lần chạy: SD < 0,33 sai số toàn bộ cho phép.
Thực nghiệm so sánh phương pháp:
Các vật liệu ngoại kiểm amin sinh học của
chương trình ngoại kiểm Úc (RCPA) được
chạy trong vòng 6 tháng liên tục: mỗi tháng 02
mẫu tuyến tính và 01 mẫu bệnh phẩm ngoại
kiểm. Kết quả được so sánh với trung bình và
SD của ngoại kiểm. Độ lệch (bias) của mỗi giá
trị so với trung bình chung của ngoại kiểm
được biểu diễn dưới dạng đồ thị để đánh giá
độ lệch hệ thống (systemic bias) và độ không
xác thực (inaccuracy).
Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu được
chấp thuận bởi Hội đồng Y đức bệnh viện Nhi
Trung ương.
III. KẾT QUẢ
Hình 1. Sắc ký đồ tổng số chạy bằng phương pháp SIM
Với chương trình chạy sắc ký khí như sau: nhiệt độ lò ban đầu là 160oC, tốc độ tăng nhiệt giai
đoạn đầu là 8oC/phút, tiếp theo là 50oC/phút, tổng thời gian phân tích cho một mẫu là 15,8 phút;
kết quả sắc ký đồ (hình 1) cho thấy nội chuẩn có thời gian lưu là 4,95, HVA là 9,13 và VMA là
10,6 phút. Khi qua detector khối phổ, với cơ chế ion hóa bằng điện (electron impact mass
spectrometry), nội chuẩn và các chất cần phân tích bị bắn phá thành các mảnh ion đặc trưng.
Trong phương pháp này, nội chuẩn và hai chất cần phân tích được lựa chọn một mảnh ion đích
và một ion định lượng.
Tại nồng độ pha loãng thấp nhất của HVA và VMA là 0,9 µmol/L, CV lần lượt là 5,9% và 6,3%,
như vậy có thể xem 0,9 µmol/L là giới hạn phát hiện của HVA và VMA.
TCNCYH 82 (2) - 2013
3
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
B
A
Hình 2. Đồ thị tuyến tính của HVA (a) và MA (b)
Phương trình thể hiện mối tương quan giữa nồng độ HVA đo được với nồng độ HVA tính toán
theo lý thuyết là y= 0,998 x – 0,3985. Như vậy, độ dốc là 0,998 và giao điểm với trục tung
là - 0,3985. Khoảng nồng độ HVA trong thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính là từ 5,68 đến
192,9 µmol/L. Phương trình thể hiện mối tương quan giữa nồng độ VMA đo được với nồng độ
VMA tính toán theo lý thuyết là y = 0,9974 x + 0,2151. Như vậy, độ dốc là 0,9974 và giao điểm
với trục tung là 0,2151. Khoảng nồng độ VMA trong thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính là từ 3,2
đến 221 µmol/L.
Bảng 1. Độ chính xác của phương pháp
Mẫu
Độ chính xác
trong một lần chạy
(n = 15)
Độ chính xác
giữa các lần chạy
(n = 20)
HVA
VMA
QC mức 1
QC mức 2
QC mức 1
QC mức 2
X (µmol/L)
10,9
87,8
18,2
90,6
SD
0,27
1,06
0,54
1,61
CV (%)
2,45
1,2
2,97
1,79
X (µmol/L)
10,2
84,7
16,9
85,4
SD
0,37
1,77
0,75
2,48
CV (%)
3,6
2,1
6,6
2,6
Độ biến thiên (CV) trong một lần chạy của cả hai thông số HVA và VMA đều dưới 5%. Độ biến
thiên (CV) giữa các lần chạy của HVA đều nhỏ hơn 5%. Với VMA, CV của QC mức 1 là 6,6%,
của QC mức 2 nhỏ hơn 5%.
4
TCNCYH 82 (2) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
GCMS
120
200
GCMS
100
160
80
120
60
80
40
40
20
A
0
B
Ngoai kiem
0
20
40
60
80
Unweighted linear regression N = 12
Slope : 0.971 [ 0.898 to 1.043 ]
Intercept : 0.0 [ -5.4 to 5.4 ]
100
120
0
0
Ngoai kiem
40
80
120
Unweighted linear regression N = 6
Slope : 1.021 [ 0.936 to 1.107 ]
Intercept : 1.4 [ -5.7 to 8.4 ]
160
200
Hình 3. Đồ thị so sánh kết quả của các mẫu HVA tuyến tính (a) và
bệnh phẩm (b) với kết quả ngoại kiểm
Trong vòng 6 tháng, 12 mẫu ngoại kiểm HVA tuyến tính của chương trình ngoại kiểm các
amin sinh học của Úc đã được phân tích bằng phương pháp sắc ký khối phổ xây dựng tại phòng
xét nghiệm. Kết quả cho thấy, không có mẫu nào ở ngoài giới hạn cho phép. Đồ thị có độ dốc là
0,971 và giao điểm là 0. Các thông số tính toán độ chính xác là: SD = 4, CV = 6,4%. Thông số
tính toán độ xác thực là độ lệch (bias) = 1,9. Sáu mẫu ngoại kiểm HVA bệnh phẩm (nước tiểu của
bệnh nhân) của chương trình ngoại kiểm các amin sinh học của Úc đã được phân tích bằng
phương pháp GCMS xây dựng tại phòng xét nghiệm. Kết quả cho thấy không có mẫu nào ở
ngoài giới hạn cho phép. Đồ thị có độ dốc là 1,021 và giao điểm là 1,4. Các thông số tính toán độ
chính xác là: SD = 4,2, CV = 4,7%. Thông số tính toán độ xác thực là độ lệch (bias) = 3,2.
IV. BÀN LUẬN
Phương pháp định lượng HVA và VMA
được phát triển dựa trên phương pháp kinh
điển để xác định thành phần của acid hữu cơ
niệu: chiết tách bằng ethyl acetate/tạo dẫn
xuất trimethylsilyl/phân tách và định lượng
HVA và VMA được thực hiện bằng phương
pháp SIM (selected ion monitoring) trên máy
sắc ký khối phổ. Đường chuẩn được chạy mỗi
lần với các mẫu thử và được đánh giá tính
hợp thức bằng vật liệu kiểm tra chất lượng
(QC hai mức của Bio- Rad). Kết quả của các
mẫu bệnh phẩm chỉ chấp nhận được khi QC
nằm trong giới hạn cho phép. Phương pháp
định lượng đồng thời HVA và VMA bằng sắc
ký khối phổ là kỹ thuật được thực hiện lần đầu
tiên tại phòng xét nghiệm (in-house development), do vậy cần phải được đánh giá trước
TCNCYH 82 (2) - 2013
khi đưa vào sử dụng. Các thực nghiệm nhằm
đánh giá các sai số của phương pháp.
Phương pháp có thể chấp nhận được khi các
sai số không ảnh hưởng đến việc phân tích
diễn giải kết quả xét nghiệm, không ảnh
hưởng đến việc chẩn đoán và theo dõi điều trị
bệnh. Giá trị 0,9 µmol/L có thể xem là giới hạn
định lượng của HVA và VMA trong phương
pháp này. Nghiên cứu của Kaluzna và cộng
sự có giới hạn định lượng của HVA là 1,26
µmol/L, VMA là 0,76 µmol/L [4].
Khoảng tuyến tính của HVA được xác định
là 5,36 - 194 µmol/L, VMA là 3,2 - 222 µmol/L.
Độ dốc của cả hai đồ thị đều xấp xỉ 1 và giao
điểm xấp xỉ 0 (hình 2). Như vậy, khoảng tuyến
tính của hai thông số định lượng trong
phương pháp này bao phủ cả vùng các giới
hạn có ý nghĩa quyết định chẩn đoán bệnh.
5
nguon tai.lieu . vn
ĐỊNH LƯỢNG ACID HOMOVANILLIC (HVA)
VÀ ACID VANILLYLMANDELIC (VMA) TRONG NƯỚC TIỂU
BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
Trần Thị Chi Mai1, Trần Thị Thu Trang2, Hoàng Trung Kiên2
1
Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương
Nghiên cứu này nhằm xây dựng và hiệu chuẩn quy trình kỹ thuật định lượng đồng thời acid homovanillic
(HVA) và acid vanillylmandelic (VMA) niệu bằng sắc ký khí khối phổ. Phương pháp định lượng đồng thời HVA và
VMA niệu bằng sắc ký khí khối phổ (GCMS) được xây dựng dựa trên phương pháp phân tích acid hữu cơ: tách
chiết HVA và VMA trong nước tiểu, tạo dẫn xuất di - và tri (trimethylsilyl), phân tách và định lượng bằng phương
pháp SIM trên GCMS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,9 µmol/L cho HVA và VMA. Khoảng tuyến tính
của HVA là 5,68 đến 192,9 µmol/L, của VMA là 3,2 đến 221 µmol/L. Sai số toàn bộ tính toán của phương pháp nhỏ
hơn sai số cho phép. Qui trình kỹ thuật định lượng đồng thời VMA và HVA niệu bằng phương pháp GCMS xây dựng
được là chính xác và xác thực, có thể sử dụng để phục vụ chẩn đoán và theo dõi điều trị u nguyên bào thần kinh.
Từ khoá: acid homovanillic, acid vanillylmandelic, sắc ký khí khối phổ, u nguyên bào thần kinh
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Các khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh
như u nguyên bào thần kinh (UNBTKNeuroblastoma) hay u tuỷ thượng thận
(Pheochrocytomas) có đặc điểm là tăng bài
tiết catecholamin. Do vậy, việc định lượng
catecholamin (noradrenalin, adrenalin) và các
sản phẩm chuyển hoá của chúng như acid
homovanillic (HVA) và acid vanillylmandelic
(VMA) đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán
và theo dõi điều trị các bệnh nhân u nguyên
bào thần kinh, u tuỷ thượng thận [1; 2].
Trên thế giới, phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (High Performance liquid choromatography- HPLC) thường được sử dụng
định lượng HVA và VMA trong nước tiểu.Tại
Việt Nam, có rất ít phòng xét nghiệm định
lượng VMA niệu và phương pháp sử dụng là
đo quang sau khi đã tiến hành tinh sạch một
Địa chỉ liên hệ: Trần Thị Chi Mai, Khoa Kỹ thuật Y học,
Trường Đại học Y Hà Nội
Email: mai.duong2@yahoo.com
Ngày nhận: 08/01/2013
Ngày được chấp thuận: 26/4/2013
TCNCYH 82 (2) - 2013
phần VMA bằng sắc ký trao đổi ion. Phương
pháp này rẻ tiền, đơn giản nhưng độ chính
xác không cao vì nhiều yếu tố nhiễu. Trước
khi định lượng VMA niệu bệnh nhân không
được ăn một số thực phẩm như chuối, sô cô
la. Hiện tại chưa có phòng xét nghiệm nào ở
Việt Nam triển khai kỹ thuật định lượng HVA
niệu. Việc định lượng đồng thời HVA và VMA
niệu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ là
một phương pháp nhạy và đặc hiệu, được
nhiều tác giả trên thế giới phát triển và sử
dụng trong sàng lọc và chẩn đoán u nguyên bào
thần kinh [1; 2]. Việc chuẩn hóa kỹ thuật này và
đưa vào ứng dụng trong điều kiện phòng xét
nghiệm của nước ta nhằm cải thiện việc chẩn
đoán và theo dõi u nguyên bào thần kinh là
cần thiết. Vì vậy đề tài này được tiến hành với
mục tiêu: xây dựng và hiệu chuẩn qui trình kỹ
thuật định lượng đồng thời VMA và HVA niệu
bằng phương pháp sắc ký khối phổ.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Chất liệu nghiên cứu
Thiết bị: GCMS (GC 7890A - MS 5975)
của Agilent. Cột sắc ký HP- 5MS 30m x 0,25
1
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
mm internal diameter x 0,25 um film thickness
(Agilent).Hệ thống làm bay hơi dung môi bằng
khí nitơ.
Hóa chất: Acid 3-phenylbutyric của hãng
Sigma- Aldrich, BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)
trifluoroacetamide) của hãng Supelco, Ethyl
acetate của Fluka. Lyphocheck Quantitative
Urine Control level 1 và level 2 của hãng
Bio-Rad. Chuẩn HVA/VMA (Calibrator for
HVA/VMA urine) của hãng Recipe. Các dung
môi và hoá chất khác của hãng Merck đều có
độ tinh khiết ở mức phân tích.
Bệnh phẩm: Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên
của trẻ khoẻ mạnh và trẻ bị u nguyên bào thần
kinh, được acid hoá bằng HCl 6M ngay sau
khi thu thập và được bảo quản ở -20oC cho
đến khi phân tích.
2. Phương pháp
2.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật định
lượng đồng thời HVA và VMA niệu
Chuẩn bị mẫu: cho 50 µl nội chuẩn acid
3- phenyl butyric vào 1 ml nước tiểu, hỗn hợp
trên được bão hòa bằng NaCl và được chiết
tách bằng ethyl acetate trong môi trường acid
(pH < 1). Làm khô mẫu được tách chiết bằng
khí nitơ. Ủ mẫu với BSTFA trong 75 phút ở
80°C để gắn các nhóm trimethylsilyl (trong
BSTFA) với 2 nhóm -OH của phân tử HVA,
với 3 nhóm -OH của VMA.
Phân tích GCMS được tiến hành trên cột
sắc ký HP - 5MS 30m x 0,25 mm internal
diameter x 0,25 um film thickness (Agilent).
Mẫu được bơm bằng bộ bơm mẫu tự động
Agilent 7693. Chương trình nhiệt độ lò từ
160oC đến 280oC trong vòng 15,8 phút. Tốc
độ khí He qua cột là 1 ml/ phút. HVA và VMA
được phát hiện bằng phổ khối theo phương
pháp SIM (selected ion monitoring). Các ion
đặc hiệu cho mỗi chất được lựa chọn. Đường
chuẩn được xây dựng bằng chạy các hỗn hợp
2
chuẩn chứa một lượng HVA và VMA chuẩn đã
biết và chuẩn nội. Ba mức chuẩn được phân
tích trên sắc ký khối phổ mỗi khi chạy mẫu
thử, các đỉnh tạo ra được đo bằng phương
pháp SIM và đường chuẩn ba điểm được
thiết lập cho mỗi chất phân tích. Sau khi thiết
lập đường chuẩn ba điểm cho HVA và VMA,
định lượng HVA và VMA trong mẫu thử bằng
phần mềm Chemstation. Sử dụng chuẩn nội
để hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình
chuẩn bị mẫu. Hai mức vật liệu kiểm tra chất
lượng (QC- Quality Control material) được
chạy cùng với bệnh phẩm trong mỗi lần làm
xét nghiệm định lượng HVA và VMA trong
nước tiểu.
2.2. Các thực nghiệm đánh giá kỹ thuật
Xác định giới hạn phát hiện: Tiến hành pha
loãng 2, 4, 8, 16, 32 và 64 lần dung dịch
chuẩn có nồng độ cao nhất bằng HCl 0,2 M
(dung môi dùng pha chuẩn). Các chuẩn pha
loãng được chạy 5 lần trong một đợt phân tích
theo quy trình chuẩn (standard operation procedures- SOP), tính SD và CV tại các nồng độ
để xác định nồng độ thấp nhất định lượng
được có độ chính xác chấp nhận (giới hạn
phát hiện).
Thực nghiệm đánh giá độ tuyến tính:
Chuẩn bị hai hỗn hợp nước tiểu của bệnh nhân.
Hỗn hợp thứ nhất là các mẫu đã phân tích có
nồng độ thấp. Hỗn hợp thứ hai là các mẫu đã
phân tích có nồng độ cao gần với hoặc cao hơn
giá trị trên dự đoán của khoảng phân tích. Trộn
hai mẫu bệnh phẩm trên với các tỷ lệ như sau
1/0, 3/1, 1/1, 1/3 và 0/1. Tiến hành phân tích
định lượng HVA và VMA trong 5 mẫu trên.
Mỗi mẫu làm lặp lại 03 lần. Tính giá trị trung
bình thu được của mỗi mẫu. Vẽ đồ thị để đánh
giá độ tuyến tính bằng phần mềm Linchecker
của Philippe Marquis: trục hoành là nồng độ
tính toán lý thuyết, trục tung là nồng độ trung
TCNCYH 82 (2) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
bình đo được. Tính toán độ dốc (slope) và
giao điểm với trục Y (intercept). So sánh độ
dốc và giao điểm tính toán được với độ dốc và
giao điểm mong muốn (là 1 và 0,0).
Xác định độ chính xác: Hai loại vật liệu
kiểm tra chất lượng (QC) bình thường và
bệnh lý được phân tích trong một lần chạy,
mỗi mẫu được chạy 15 lần (n = 15) để thu
thập dữ liệu và đánh giá độ chính xác trong
một lần chạy. Hai loại QC nước tiểu bình
thường và bệnh lý được chạy trong 20 mẻ
khác nhau trong vòng 3 tháng (n = 20). Tính
giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, và CV để
đánh giá độ chính xác trong một lần chạy và
giữa các lần chạy. Tiêu chuẩn chấp nhận: Độ
chính xác trong một lần chạy: SD < 0,25 sai
số toàn bộ cho phép. Độ chính xác giữa các
lần chạy: SD < 0,33 sai số toàn bộ cho phép.
Thực nghiệm so sánh phương pháp:
Các vật liệu ngoại kiểm amin sinh học của
chương trình ngoại kiểm Úc (RCPA) được
chạy trong vòng 6 tháng liên tục: mỗi tháng 02
mẫu tuyến tính và 01 mẫu bệnh phẩm ngoại
kiểm. Kết quả được so sánh với trung bình và
SD của ngoại kiểm. Độ lệch (bias) của mỗi giá
trị so với trung bình chung của ngoại kiểm
được biểu diễn dưới dạng đồ thị để đánh giá
độ lệch hệ thống (systemic bias) và độ không
xác thực (inaccuracy).
Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu được
chấp thuận bởi Hội đồng Y đức bệnh viện Nhi
Trung ương.
III. KẾT QUẢ
Hình 1. Sắc ký đồ tổng số chạy bằng phương pháp SIM
Với chương trình chạy sắc ký khí như sau: nhiệt độ lò ban đầu là 160oC, tốc độ tăng nhiệt giai
đoạn đầu là 8oC/phút, tiếp theo là 50oC/phút, tổng thời gian phân tích cho một mẫu là 15,8 phút;
kết quả sắc ký đồ (hình 1) cho thấy nội chuẩn có thời gian lưu là 4,95, HVA là 9,13 và VMA là
10,6 phút. Khi qua detector khối phổ, với cơ chế ion hóa bằng điện (electron impact mass
spectrometry), nội chuẩn và các chất cần phân tích bị bắn phá thành các mảnh ion đặc trưng.
Trong phương pháp này, nội chuẩn và hai chất cần phân tích được lựa chọn một mảnh ion đích
và một ion định lượng.
Tại nồng độ pha loãng thấp nhất của HVA và VMA là 0,9 µmol/L, CV lần lượt là 5,9% và 6,3%,
như vậy có thể xem 0,9 µmol/L là giới hạn phát hiện của HVA và VMA.
TCNCYH 82 (2) - 2013
3
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
B
A
Hình 2. Đồ thị tuyến tính của HVA (a) và MA (b)
Phương trình thể hiện mối tương quan giữa nồng độ HVA đo được với nồng độ HVA tính toán
theo lý thuyết là y= 0,998 x – 0,3985. Như vậy, độ dốc là 0,998 và giao điểm với trục tung
là - 0,3985. Khoảng nồng độ HVA trong thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính là từ 5,68 đến
192,9 µmol/L. Phương trình thể hiện mối tương quan giữa nồng độ VMA đo được với nồng độ
VMA tính toán theo lý thuyết là y = 0,9974 x + 0,2151. Như vậy, độ dốc là 0,9974 và giao điểm
với trục tung là 0,2151. Khoảng nồng độ VMA trong thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính là từ 3,2
đến 221 µmol/L.
Bảng 1. Độ chính xác của phương pháp
Mẫu
Độ chính xác
trong một lần chạy
(n = 15)
Độ chính xác
giữa các lần chạy
(n = 20)
HVA
VMA
QC mức 1
QC mức 2
QC mức 1
QC mức 2
X (µmol/L)
10,9
87,8
18,2
90,6
SD
0,27
1,06
0,54
1,61
CV (%)
2,45
1,2
2,97
1,79
X (µmol/L)
10,2
84,7
16,9
85,4
SD
0,37
1,77
0,75
2,48
CV (%)
3,6
2,1
6,6
2,6
Độ biến thiên (CV) trong một lần chạy của cả hai thông số HVA và VMA đều dưới 5%. Độ biến
thiên (CV) giữa các lần chạy của HVA đều nhỏ hơn 5%. Với VMA, CV của QC mức 1 là 6,6%,
của QC mức 2 nhỏ hơn 5%.
4
TCNCYH 82 (2) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
GCMS
120
200
GCMS
100
160
80
120
60
80
40
40
20
A
0
B
Ngoai kiem
0
20
40
60
80
Unweighted linear regression N = 12
Slope : 0.971 [ 0.898 to 1.043 ]
Intercept : 0.0 [ -5.4 to 5.4 ]
100
120
0
0
Ngoai kiem
40
80
120
Unweighted linear regression N = 6
Slope : 1.021 [ 0.936 to 1.107 ]
Intercept : 1.4 [ -5.7 to 8.4 ]
160
200
Hình 3. Đồ thị so sánh kết quả của các mẫu HVA tuyến tính (a) và
bệnh phẩm (b) với kết quả ngoại kiểm
Trong vòng 6 tháng, 12 mẫu ngoại kiểm HVA tuyến tính của chương trình ngoại kiểm các
amin sinh học của Úc đã được phân tích bằng phương pháp sắc ký khối phổ xây dựng tại phòng
xét nghiệm. Kết quả cho thấy, không có mẫu nào ở ngoài giới hạn cho phép. Đồ thị có độ dốc là
0,971 và giao điểm là 0. Các thông số tính toán độ chính xác là: SD = 4, CV = 6,4%. Thông số
tính toán độ xác thực là độ lệch (bias) = 1,9. Sáu mẫu ngoại kiểm HVA bệnh phẩm (nước tiểu của
bệnh nhân) của chương trình ngoại kiểm các amin sinh học của Úc đã được phân tích bằng
phương pháp GCMS xây dựng tại phòng xét nghiệm. Kết quả cho thấy không có mẫu nào ở
ngoài giới hạn cho phép. Đồ thị có độ dốc là 1,021 và giao điểm là 1,4. Các thông số tính toán độ
chính xác là: SD = 4,2, CV = 4,7%. Thông số tính toán độ xác thực là độ lệch (bias) = 3,2.
IV. BÀN LUẬN
Phương pháp định lượng HVA và VMA
được phát triển dựa trên phương pháp kinh
điển để xác định thành phần của acid hữu cơ
niệu: chiết tách bằng ethyl acetate/tạo dẫn
xuất trimethylsilyl/phân tách và định lượng
HVA và VMA được thực hiện bằng phương
pháp SIM (selected ion monitoring) trên máy
sắc ký khối phổ. Đường chuẩn được chạy mỗi
lần với các mẫu thử và được đánh giá tính
hợp thức bằng vật liệu kiểm tra chất lượng
(QC hai mức của Bio- Rad). Kết quả của các
mẫu bệnh phẩm chỉ chấp nhận được khi QC
nằm trong giới hạn cho phép. Phương pháp
định lượng đồng thời HVA và VMA bằng sắc
ký khối phổ là kỹ thuật được thực hiện lần đầu
tiên tại phòng xét nghiệm (in-house development), do vậy cần phải được đánh giá trước
TCNCYH 82 (2) - 2013
khi đưa vào sử dụng. Các thực nghiệm nhằm
đánh giá các sai số của phương pháp.
Phương pháp có thể chấp nhận được khi các
sai số không ảnh hưởng đến việc phân tích
diễn giải kết quả xét nghiệm, không ảnh
hưởng đến việc chẩn đoán và theo dõi điều trị
bệnh. Giá trị 0,9 µmol/L có thể xem là giới hạn
định lượng của HVA và VMA trong phương
pháp này. Nghiên cứu của Kaluzna và cộng
sự có giới hạn định lượng của HVA là 1,26
µmol/L, VMA là 0,76 µmol/L [4].
Khoảng tuyến tính của HVA được xác định
là 5,36 - 194 µmol/L, VMA là 3,2 - 222 µmol/L.
Độ dốc của cả hai đồ thị đều xấp xỉ 1 và giao
điểm xấp xỉ 0 (hình 2). Như vậy, khoảng tuyến
tính của hai thông số định lượng trong
phương pháp này bao phủ cả vùng các giới
hạn có ý nghĩa quyết định chẩn đoán bệnh.
5