- Trang Chủ
- Y khoa - Dược
- Đề tài “ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ THỎ KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HIỆN OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1”
Xem mẫu
- tài "“ NGHIÊN C U S N XU T KHÁNG TH TH
KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HI N
OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1”
- L I C M ƠN
T lòng bi t ơn sâu s c c a mình, em xin dành trang u tiên c a khóa lu n
bày t lòng c m ơn chân thành n:
Ban Giám hi u trư ng i h c Nha Trang, Phòng ào t o, Ban ch nhi m
khoa Ch Bi n cùng toàn th quý th y cô ã gi ng d y t n tình và giúp em trong
quá trình h c t p t i trư ng.
PGS.TS. Lê Văn Hi p - Vi n trư ng Vi n V c xin và Sinh ph m Y t Nha
Trang, ngư i th y ã luôn quan tâm hư ng d n, t o i u ki n thu n l i cho em
trong quá trình th c t p t i Vi n.
CN. Nguy n Th Minh Hi n - trư ng phòng, TS. Nguy n Th Lan Phương -
phó phòng Ki m nh, CN. Tr n Ng c Nhơn, TS. Minh Sĩ ã tr c ti p hư ng
d n, ch b o nhi t tình, chu áo và luôn t o m i i u ki n thu n l i nh t giúp em
hoàn thành lu n văn này.
Qua ây em xin bày t lòng bi t ơn sâu s c n toàn th các cô, các anh ch
phòng Ki m nh, phòng Nghiên c u và phát tri n ã nhi t tình giúp , góp ý và
ng viên em trong th i gian th c t p t i phòng.
Em xin chân thành c m ơn Ban Giám c Vi n V c xin Nha Trang ã t o
i u ki n thu n l i cho em th c t p t i Vi n.
Xin bày t lòng bi t ơn n gia ình, t t c b n bè, anh ch và các em ã
quan tâm, giúp , chia s , ng viên em trong su t th i gian qua.
Nha Trang, tháng 11 năm 2007
Sinh viên
ào Th Thanh Vân.
- CH VI T T T TRONG KHÓA LU N
APS : Amonium persulfat
CV : H s bi n thiên
D : Dư c i n
D VN : Dư c i n Vi t Nam
ELISA : Enzyme - linked immuno sorbent assay
(Th nghi m mi n d ch g n men)
FCA : Tá ch t Freund Complete
FIA : Tá ch t Freund Incomplete
HA : Haemagglutin
IgG : Immuno globulin G
IU : International Unit ( ơn v qu c t )
KN : Kháng nguyên
KT : Kháng th
LOD : Limit of detection (Gi i h n phát hi n)
LOQ : Limit of quantification (Gi i h n nh lư ng)
NA : Neuraminidase
OD : Optical density (M t quang)
PBS : Photphat buffer saline (Dung d ch m c a mu i Photphat)
SD : Standard Deviation ( l ch chu n)
SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulphate – Poly acrylamide gel Electrophoresis
( i n di gel Poly acrylamide có Sodium dodecyl sulphate)
Streptavidine – PO : Streptavidine – Peroxydase
RIA : Radial immuno assay (Th nghi m mi n d ch phóng x )
RNA : Ribonucleic Acide (Axit Ribonucleic)
TMB : 3,3’,5,5’ – TetraMethyl Benzidine
TEMED : N,N,N’,N’- TetraMethylethylendiamin
WHO : World Health Organization (T ch c Y t th gi i -TCYTTG)
- M CL C
TRANG BÌA PH
L I C M ƠN
DANH M C CH VI T T T
M CL C
DANH M C CÁC B NG
DANH M C CÁC HÌNH
L I NÓI U ................................................................................................................ 1
1.1. TÌNH HÌNH B NH CÚM A/H5N1 ............................................................. 4
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN C U S N XU T VACXIN CÚM A/H5N1
HI N NAY ......................................................................................................... 5
1.3. GI I THI U VACXIN CÚM A/H5N1 S N XU T TRÊN TR NG GÀ
CÓ PHÔI ............................................................................................................ 6
1.3.1. Nguyên li u s n xu t .............................................................................. 6
1.3.2. Ch ng s n xu t ....................................................................................... 6
1.3.3. Quy trình s n xu t và ki m nh vacxin cúm A/H5N1 trên tr ng gà
có phôi ............................................................................................................. 7
1.3.4. Tiêu chu n ch t lư ng c a vacxin cúm A/H5N1 .................................... 7
1.4. OVALBUMIN .............................................................................................. 8
1.4.1. c tính ................................................................................................. 8
1.4.2. C u t o .................................................................................................. 9
1.4.3. Tính sinh mi n d ch ............................................................................... 9
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HI N OVALBUMIN VÀ KHUY N
CÁO V CÁCH PHÁT TRI N VÀ TH M NH PHƯƠNG PHÁP .............. 10
1.5.1. Các phương pháp phát hi n ovalbumin ................................................ 10
1.5.1.1. Phương pháp Ouchterlony (khuy ch tán mi n d ch kép) ................. 11
1.5.1.2. Phương pháp i n di mi n d ch i lưu ............................................ 11
1.5.1.3. Phương pháp mi n d ch phóng x (Radioimmunoassay- RIA) ....... 12
1.5.1.4. Phương pháp ELISA – K thu t ch t h p ph mi n d ch g n
enzyme (Enzyme – Linked immunosorbent Assay) ......................... 12
1.5.2. Các khuy n cáo v cách phát tri n và th m nh phương pháp ............. 14
1.6 S N XU T KHÁNG TH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CH .......... 15
- 1.6.1. Tá ch t ................................................................................................. 15
1.6.2. Quy trình gây mi n d ch cơ b n t o kháng th a dòng ........................ 16
1.6.3. Tinh ch kháng th IgG ....................................................................... 17
1.6.3.1. K t t a IgG t huy t thanh ho c d ch sinh v t khác b ng
(NH4)2SO4............................................................................................ 18
1.6.3.2. Tinh ch IgG nh s c kí trao i ion .................................................. 18
1.6.3.3. Tinh ch IgG nh c t ái l c protein A- ho c protein G-sepharose
4B ......................................................................................................... 19
1.6.4. Ki m tra n ng và s ch c a huy t thanh sau tinh ch ................... 20
2.1. TH I GIAN VÀ A I M NGHIÊN C U ............................................. 22
2.2. V T LI U .................................................................................................. 22
2.2.1. Sinh ph m............................................................................................. 22
2.2.2. Súc v t thí nghi m ................................................................................ 22
2.2.3. Hoá ch t và dung d ch chu n ................................................................ 22
2.2.4. Thi t b ................................................................................................. 23
2.2.5. D ng c ................................................................................................ 24
2.3. PHƯƠNG PHÁP ........................................................................................ 24
2.3.1. Mi n d ch th thu huy t thanh kháng ovalbumin .................................. 24
2.3.2. Xác nh hi u giá kháng th th kháng ovalbumin b ng phương pháp
khuy ch tán mi n d ch kép (Ouchterlony) ...................................................... 26
2.3.2.1. Nguyên t c............................................................................................ 26
2.3.2.2. Ti n hành .............................................................................................. 26
2.3.3. Tinh ch kháng th kháng ovalbumin b ng c t HiTrap protein G HP.... 27
2.3.3.1. Tinh ch ............................................................................................... 27
2.3.3.2. Phương pháp i n di SDS-PAGE ki m tra s ch c a huy t
thanh sau tinh ch ................................................................................ 28
2.3.4. Phương pháp i n di mi n d ch i lưu................................................. 30
2.3.5. Xây d ng phương pháp ELISA nh lư ng ovalbumin trong vacxin
cúm A/H5N1. ................................................................................................. 31
2.3.5.1. Nguyên lý ............................................................................................. 31
2.3.5.2. Các bư c ti n hành .............................................................................. 31
2.3.6. Th m nh phương pháp ....................................................................... 33
2.3.6.1. Xây d ng ư ng chu n và nh y c a ph n ng............................. 33
2.3.6.2. Xác nh chính xác c a phương pháp ........................................... 33
- CHƯƠNG III: K T QU VÀ BÀN LU N.............................................................. 36
3.1. ÁNH GIÁ QUY TRÌNH MI N D CH VÀ S N XU T KHÁNG TH
TH KHÁNG OVALBUMIN ........................................................................... 37
3.2. TINH CH KHÁNG TH TH (IgG) KHÁNG OVALBUMIN ................ 40
3.3. XÂY D NG H ELISA NH LƯ NG OVALBUMIN. ......................... 43
3.3.1. Ch n h m khóa phi n ...................................................................... 43
3.3.2. Xác nh n ng kháng th phù h p cho ph phi n ............................. 44
3.4. TH M NH PHƯƠNG PHÁP ................................................................. 46
3.4.1. Xây d ng ư ng chu n ......................................................................... 46
3.4.2. K t qu xác nh nh y c a ph n ng ................................................ 47
3.4.3. K t qu xác nh chính xác và úng c a phương pháp ............... 49
3.4.4. So sánh v i phương pháp i n di mi n d ch i lưu .............................. 55
3.5. NG D NG H ELISA NH LƯ NG OVALBUMIN TRONG
TRONG VACXIN CÚM A/H5N1 ..................................................................... 56
4.1. K T LU N ................................................................................................ 59
4.1.1. S n xu t kháng th th kháng ovabumin ............................................... 59
4.1.2. ã s d ng c t HiTrap protein G HP tinh ch thành công kháng th
(IgG) kháng ovalbumin t huy t thanh th thô ............................................... 59
4.1.3. Xây d ng và th m nh ư c h ELISA gián ti p nh lư ng
ovalbumin trong vacxin cúm A/H5N1 ............................................................ 59
4.2. KI N NGH ................................................................................................ 60
TÀI LI U THAM KH O .............................................................................................. 1
PH L C
- DANH M C CÁC B NG
B ng 3.1. K t qu áp ng kháng th c a th sau mũi tiêm th nh t. .................... 37
B ng 3.2. K t qu hi u giá kháng th sau các mũi tiêm ......................................... 38
B ng 3.3. K t qu kháng th sau khi tinh ch ........................................................ 41
B ng 3.4. nh y c a ph n ng (LOD và LOQ) .................................................. 48
B ng 3.5. M t quang n n c a 6 l n th nghi m ................................................ 51
B ng 3.6. l p l i c a ph n ng ........................................................................ 52
B ng 3.7. chính xác và úng c a ph n ng................................................. 54
B ng 3.8. K t qu ELISA nh lư ng các m u ovalbumin .................................... 56
- DANH M C CÁC HÌNH
Hình 2.1. Sơ mi n d ch ..................................................................................... 25
Hình 2.2. Sơ l y máu ........................................................................................ 25
Hình 2.3. K thu t ELISA gián ti p nh lư ng kháng nguyên ovalbumin............. 35
Hình 3.1. Tiêu b n nhu m Coomassie phương pháp Ouchterlony phát hi n
kháng th kháng ovalbumin ................................................................................... 39
Hình 3.2 th bi u di n các phân o n thu ư c khi tinh ch huy t thanh
kháng ovalbumin. .................................................................................................. 40
Hình 3.3. Tiêu b n nhu m Coomassie b n i n di SDS-PAGE (10% SDS) các
m u huy t thanh. ................................................................................................... 42
Hình 3.4. th bi u di n s phù h p gi a các m khóa phi n trong ph n ng
ELISA nh lư ng ovalbumin. ............................................................................... 43
Hình 3.5. th bi u di n s phù h p gi a các n ng kháng th th kháng
ovalbumin trong ph n ng ELISA nh lư ng ovalbumin...................................... 44
Hình 3.6. th ư ng chu n ............................................................................... 46
Hình 3.7. Tiêu b n nhu m Coomassie phương pháp i n di i l ưu nh lư ng
ovalbumin ............................................................................................................. 55
- -1-
L I NÓI U
B nh cúm A/H5N1 ư c xem là b nh truy n nhi m c bi t nguy hi m v i
s lây lan nhanh và t l t vong r t cao. M i ch xu t hi n t cu i năm 2003 t i
m t s nư c châu Á, n nay d ch cúm A/H5N1 ã lan r ng ra nhi u qu c gia trên
th gi i v i 229 ngư i nhi m b nh, trong ó 131 ngư i t vong chi m t l 58% [6].
Các trư ng h p nhi m virus cúm ư c phát hi n m c dù ch x y ra do lây nhi m
gi a ngư i v i các loài gia c m. Th nhưng, các chuyên gia trên th gi i ã kh ng
nh, vi c virus cúm A lây nhi m t ngư i sang ngư i ch còn là v n th i gian.
Trư c nguy cơ bùng phát c a i d ch, các nư c, các t ch c trên th gi i ã ph i
vào cu c nhanh chóng tìm ra phương th c phòng b nh hi u qu .
Vacxin luôn ư c coi là phương th c h u hi u nh t trong vi c phòng ch ng,
gi m t l m c b nh và t l ch t do các i d ch gây ra. Công ngh s n xu t vacxin
cúm “thông thư ng” ã có t 60 năm trư c các nư c châu Âu và B c M nhưng
s lư ng ít và m c giá cao [3] nên không th áp n g cho th gi i khi có i
d ch x y ra, c bi t v i các nư c nghèo, nư c ang phát tri n l i càng khó khăn
hơn.
T ch c Y t th gi i (TCYTTG) ã khuy n cáo các nư c nên t nghiên c u
s n xu t vacxin cúm A/H5N1 có th ch ng trong công tác phòng ch ng d ch,
b o v s c kho c ng ng [3]. Cùng v i vi c t o ra các ch ng s n xu t vacxin cúm
A/H5N1 thích h p b ng k thu t di truy n ngư c, các trung tâm nghiên c u b nh
cúm qu c t cũng ưa ra nh ng hư ng s n xu t vacxin cúm khác nhau (s n xu t
trên tr ng gà có phôi, t bào ng v t…). Trên cơ s ó, tuỳ thu c vào i u ki n
c a t ng qu c gia mà l a ch n con ư ng s n xu t cho phù h p nhưng ph i m
b o tính an toàn và hi u qu cao.
T i Vi t Nam, vi n V c xin và sinh ph m y t Nha Trang ã nghiên c u s n
xu t vacxin cúm A/H5N1 cho ngư i b ng phương pháp nuôi c y trên tr ng gà có
phôi. Vi n ã s n xu t th 9 lo t vacxin thành công. Trư c khi ưa vào s d ng,
vacxin cúm ph i t ư c các tiêu chu n an toàn, mi n d ch c n thi t theo quy nh
- -2-
c a B Y t Vi t Nam và TCYTTG. M t trong s các tiêu chu n ó là hàm lư ng
ovalbumin, protein trong lòng tr ng tr ng, là thành ph n có kh năng gây d ng r t
cao. Theo tiêu chu n c a TCYTTG, lư ng ovalbumin trong m i li u vacxin cúm
A/H5N1 s n xu t t tr ng gà có phôi không ư c vư t quá 1 µg [10]. Chính vì th ,
vi c tìm ra m t phương pháp xác nh hàm lư ng ovalbumin v i nh y và
chính xác cao là m t i u tiên quy t. Có nhi u phương pháp khác nhau nh
lư ng ovalbumin như: ELISA, i n di mi n d ch…Tuy nhiên, các nghiên c u trư c
ó cho th y, phương pháp ELISA là phương pháp cho c hi u và chính xác
r t cao, có kh năng phát hi n ovalbumin mc nanogam (ng) [10-13]. Các b
kít ELISA dùng xác nh hàm lư ng ovalbumin r t t ti n và không phù h p
khi ti n hành các ki m nh trong quá trình s n xu t. Chính vì v y, v i i u ki n
trang thi t b hi n có, chúng tôi ti n hành nghiên c u tài “ NGHIÊN C U S N
XU T KHÁNG TH TH KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HI N
OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1” .
M c tiêu tài:
1. S n xu t kh ng th th kháng ovalbumin.
2. Tinh ch kháng th (IgG) kháng ovalbumin.
3. ng d ng kháng th kháng ovalbumin tinh ch nh lư ng ovalbumin trong
các m u vacxin cúm A/H5N1 b ng phương pháp ELISA và phương pháp
i n di mi n d ch i lưu.
.
- -3-
CHƯƠNG 1: T NG QUAN TÀI LI U
- -4-
1.1. TÌNH HÌNH B NH CÚM A/H5N1 [3], [6]
Cúm gà hay cúm gia c m do virus cúm typ A gây nên. Chúng thư ng gây
b nh trên các loài gia c m và có th lây nhi m sang m t s loài ng v t có vú.
Cúm gia c m lây lan r t nhanh và khó ki m soát. Chúng thư ng lây nhi m nhanh
các loài lông vũ và gây ch t trên di n r ng.
Năm 1996, virus cúm A/H5N1 l n u tiên ư c phân l p ng ng t i t nh
Giang ông, Trung Qu c. Sau ó ti p t c lan r ng ra nhi u nư c châu Á và m t s
nư c châu Âu.
T năm 2003, d ch cúm gia c m H5N1 bùng phát m nh t i Thái Lan, Vi t
Nam, Hàn Qu c, Nh t B n sau ó lan kh p châu Á. Thái Lan và Vi t Nam là hai
qu c gia b nh hư ng n ng n nh t. Không ch gây b nh trên gia c m, virus cúm
A/H5N1 còn là m i e d a cho s c kh e con ngư i.
Theo th ng kê c a TCYTTG, tính n ngày 04/07/2006 ã có 229 ngư i b
nhi m cúm A/H5N1 10 qu c gia trong ó có 131 ngư i t vong chi m t l 58%
[6]. Vi t Nam v n là nư c có s ngư i nhi m cúm A/H5N1 r t cao. Tính n tháng
6/2007, t i 32 t nh thành trong c nư c có 98 ngư i b m c b nh, trong ó có 42
ngư i b ch t [3].
T năm 2003 n nay, tình hình lây nhi m virus cúm A/H5N1 di n bi n r t
ph c t p. Không ch gây b nh trên gia c m, nó còn gây nhi m sang m t s ng v t
khác như h (Thái Lan), mèo (Thái Lan, Indonesia, Iraq, c), l n (Indonesia, Vi t
Nam), ch n (bi n Baltic, c). S ngư i nhi m do H5N1 cũng gia tăng không
ng ng c v s lư ng l n ph m vi nh hư ng. M c dù các trư ng h p nhi m virus
cúm A/H5N1 trên ngư i trong su t nh ng mùa d ch v a qua cho th y, s nhi m
virus ch x y ra khi có s ti p xúc khá ch t ch gi a ngư i v i các loài gia c m
b nh. Tuy nhiên, vi n c nh xu t hi n nh ng ch ng virus cúm có kh năng lây t
ngư i sang ngư i là m t i u có th tiên li u ư c.
TCYTTG ã ưa ra c nh báo r ng i d ch cúm ang n g n và nhi u kh
năng là do m t bi n ch ng c a virus cúm gia c m H5N1. Vì v y, công tác phòng
ch ng d ch ang di n ra nhi u nư c trên th gi i. Hi n nay, gi i pháp ư c nhi u
nư c trên th gi i ang th c hi n là s n xu t vacxin phòng cúm cho ngư i.
- -5-
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN C U S N XU T VACXIN CÚM A/H5N1 HI N
NAY [1], [3], [6]
Trư c nguy cơ i d ch cúm ang n g n, công tác phòng ch ng d ch ang
di n ra r t kh n trương nhi u nư c trên th gi i. phòng ch ng i d ch thì vi c
s d ng vacxin là phương th c h u hi u nh t b o v c ng ng, làm gi m t l
m c b nh và t l ch t.
Tình hình th gi i:
TCYTTG và t ch c Nông lương th gi i khuy n cáo t t c các nư c, c
bi t là các nư c ang phát tri n ph i t nghiên c u và s n xu t vacxin cúm A/H5N1
ch ng ngu n vacxin ph c v cho nhu c u b o v s c kh e c ng ng khi i
d ch x y ra.
TCYTTG ã ưa ra ba lo i vacxin cúm sau cho các nư c l a ch n s n xu t:
Vacxin b t ho t trên tr ng gà có phôi và nuôi c y t bào; vacxin s ng trên tr ng gà
có phôi và nuôi c y t bào; vacxin s ng d ng phun mù, hít qua mũi [3].
Hi n nay, trên th gi i m c dù ã có r t nhi u nư c nghiên c u và s n xu t
vacxin cúm A/H5N1 nhưng chưa có nư c nào ư c c p gi y phép lưu hành. Nhi u
hãng s n xu t vacxin l n như hãng Sanofi Pasteur (M , Pháp), hai hãng Nobilon,
Sovay Pharmaceutials c a Hà Lan vv... ang nghiên c u s n xu t vacxin cúm
A/H5N1 b ng phương pháp nuôi c y trên tr ng gà có phôi ho c nuôi c y trên các
dòng t bào (như t bào Vero, MDCK .v.v...).
Tình hình Vi t Nam:
Vi t Nam là nư c có khí h u nhi t i gió mùa nên r t d cho d ch cúm bùng
phát và lây lan ra di n r ng. Ngoài ra, àn gia c m v i s lư ng l n cũng là m t
y ut nh hư ng r t l n n vi c bùng n d ch cúm. Trư c nguy cơ i d ch cúm
ang n g n, v n cân nh c và l a ch n m t dây chuy n s n xu t vacxin cúm
sao cho phù h p v i tình hình th c t t nư c mà v n m b o ch t lư ng ang là
m i quan tâm hàng u c a nư c ta hi n nay. V n càng tr nên g p rút hơn khi
d ch cúm m i ngày m t ti n g n hơn. Trư c tình hình ó, căn c vào ưu như c
- -6-
i m c a t ng phương pháp mà hi n nay Vi t Nam ã có nhi u ơn v s n xu t
vacxin cúm H5N1 như:
Năm 2004, vi n V sinh d ch t Trung ương nghiên c u s n xu t vacxin cúm
A/H5N1 dùng cho ngư i b ng phương pháp nuôi c y trên t bào th n kh .
Ngày 18/03/2006, vi n Pasteur Tp.HCM ph i h p v i vi n V c xin và sinh
ph m y t Nha Trang và vi n Công ngh sinh h c Hà N i ã b o v thành công
tài c p nhà nư c mang tên “Nghiên c u quy trình s n xu t vacxin cúm A/H5N1
dùng cho ngư i b ng k thu t nuôi c y trên tr ng gà có phôi và trên t bào Vero”
ng Khoa h c, B khoa h c công ngh [6].
t iH i
Ti p theo ó, năm 2007, Vi n V c xin và sinh ph m y t Nha Trang ã xây
d ng quy trình s n xu t vacxin cúm t tiêu chu n GMP v i s h tr ca
TCYTTG, quy mô s n xu t là 1 tri u li u/năm.
1.3. GI I THI U VACXIN CÚM A/H5N1 S N XU T TRÊN TR NG GÀ
CÓ PHÔI [3], [4]
1.3.1. Nguyên li u s n xu t
Nguyên li u s n xu t vacxin cúm theo phương pháp này là tr ng gà s ch có
phôi 10 n 11 ngày tu i. Tr ng ư c cung c p t nh ng cơ s s n xu t tr ng s ch
t tiêu chu n trong và ngoài nư c.
1.3.2. Ch ng s n xu t
Hi n nay, Vi n V c xin và sinh ph m y t Nha Trang ang s d ng ch ng
s n xu t NIBRG-14 (Vi n NIBSC-Anh), ư c tái t h p t hai ch ng virus cúm
A/VietNam/1194/2004 (H5N1) và A/PR/8/34 (H1N1), trong ó gen mã hóa H5 và
N1 l y t ch ng A/VietNam/1194/2004. Vùng quy t nh tính c trên gen H5 g m
4 axit amin mang tính ki m b c t b , 6 gen còn l i l y t ch ng A/PR/8/34. Ch ng
NIBRG-14 có kháng nguyên b m t (H5 và N1) g n gũi v i ch ng virus cúm
A/H5N1 ã phân l p ư c Vi t Nam và ư c TCYTTG cho phép s d ng làm
vacxin [3].
- -7-
1.3.3. Quy trình s n xu t và ki m nh vacxin cúm A/H5N1 trên tr ng gà có
phôi
Tr ng gà s ch có phôi 10÷11 ngày tu i ư c c y ch ng virus cúm. Sau khi
vào trong tr ng, virus cúm s nhân lên v i s lư ng l n. n khi s lư ng, ti n
hành ti n hành thu g t d ch ni u nang. D ch ni u nang ư c tinh ch sau ó ư c
hoàn nguyên và b t ho t b ng formandehyde. S n ph m ư c em i h p ph tá
ch t và pha bán thành ph m. Sau ó, s n ph m ư c óng l t o thành vacxin thành
ph m.
Song song v i quy trình s n xu t, quy trình ki m nh cũng di n ra theo sơ (ph
l c 1).
1.3.4. Tiêu chu n ch t lư ng c a vacxin cúm A/H5N1 [10]
M i lô vacxin cúm A/H5N1 trong quá trình s n xu t cũng như khi thành
ph m, trư c khi ưa vào s d ng u ph i tr i qua quá trình ki m n h r t ch t ch .
Các tiêu chí ki m tra u d a trên các tiêu chu n hi n hành c a B Y t Vi t Nam
và các quy nh c a TCYTTG cho vacxin cúm u ng cho ngư i. i v i vacxin cúm
s n xu t trên tr ng gà có phôi, có m t ch tiêu ki m tra c trưng mà i v i các
vacxin s n xu t trên t bào không có ó là ki m tra hàm lư ng ovalbumin. ây là
m t ch tiêu r t quan tr ng trong s hàng lo t các ch tiêu ki m nh vacxin cúm s n
xu t trên tr ng gà có phôi. Ovalbumin là protein có trong lòng tr ng tr ng, trong
quá trình s n xu t vacxin cúm trên tr ng gà, thành ph n này có th còn t n t i trong
vacxin cúm thành ph m. Ovalbumin là ch t gây d ng cho cơ th ngư i và ng
v t nên vi c ki m tra hàm lư ng ovalbumin c a các lô vacxin cúm thành ph m là
m t yêu c u b t bu c. Theo TCYTTG (WHO/TRS 927/2005) thì hàm lư ng
ovalbumin ph i ≤ 1 µ g/1 li u ơn cho ngư i [10], (ph l c 2).
- -8-
1.4. OVALBUMIN
1.4.1. c tính [17], [18], [19]
Ovalbumin là m t protein chính ư c tìm th y trong lòng tr ng tr ng (chi m
60÷65% protein t ng s ), có tr ng lư ng phân t là 45kDa [17]. Trong i n di
ovalbumin có i m ng i n (pHi) t i pH= 4,6 [19].
Hi n nay ã có m t s nghiên c u v ovalbumin trong m t s lĩnh v c khác
nhau như:
− Nh ng nghiên c u chung v c u trúc và c tính
− Nh ng nghiên c u v c u trúc serpin và ch c năng
− Proteomic
− Nh ng nghiên c u trong lĩnh v c mi n d ch h c
Tuy nhiên, ây m i ch là nh ng nghiên c u ban u, ch c năng c a
ovalbumin v n chưa ư c bi t n m c dù nó ư c d oán là m t protein có nhi u
ti m năng. M t trong nh ng ng d ng c a ovalbumin hi n nay là dùng trong i n di
trên gel, nó ư c dùng như m t phân t chu n làm m c ánh d u. Bên c nh ó,
ovalbumin cũng ư c dùng trong ch a b nh. Trong trư ng h p b nghi ng ng c
kim lo i n ng (ví d như s t) ovalbumin có th ch a tr ư c vì ovalbumin có kh
năng b y các ion này trong liên k t sulfuhydrin c a nó. i u này ã ngăn c n s thu
hút kim lo i xâm nh p vào trong h tiêu hóa (d dày và ru t) và ngăn c n s nhi m
c [17].
Tuy nhiên, trong lĩnh v c mi n d ch h c thì ovalbumin là ch t gây d ng i
v i ngư i và ng v t. Do ó, ây là thành ph n b t bu c ph i ki m tra i v i các
s n ph m b nghi ng là có ch a ovalbumin như các dư c ph m: thu c, vacxin…,
các s n ph m th c ph m có ngu n g c t : tr ng, s a…
Ovabumin có th n nh trong th i gian 1 năm khi b o qu n nhi t t
2÷8OC [19].
- -9-
1.4.2. C u t o [17], [18], [19]
Ovalbumin trong lòng tr ng tr ng ư c c u t o b i 385 amino acid. Nó là
m t glycoprotein v i 4 v trí g n glucoza. Là m t protein ti t ra t t bào m c dù nó
thi u 1 u nitơ (-N) trong trình t c a nó.
C u trúc c a ovalbumin thu c v d ng c u trúc serpin c a protein, m c dù
không gi ng ph n l n các serpin khác - ovalbumin không có kh năng c ch b t kì
m t enzym th y phân protein nào. i u này ư c làm rõ khi so sánh c u trúc c a
nó v i các serpin.
1.4.3. Tính sinh mi n d ch [2], [5], [8]
Ovalbumin là m t ch t sinh mi n d ch m nh vì nó có các y u t c a m t
ch t sinh mi n d ch. ó là:
Tính l :
Thông thư ng m t ch t ư c g i là kháng nguyên trư c h t ph i là m t ch t
l i v i cơ th vì bình thư ng cơ th không áp ng b o v v i m t ch t c a b n
thân. Ovalbumin là m t protein có trong lòng tr ng tr ng, do ó i v i các cơ th
ng v t nó là m t protein l (ch t l ). Khi protein này ư c ưa vào cơ th ng
v t (gây mi n d ch) nó s kích thích cơ th ng v t s n xu t ra kháng th .
l n:
Tr ng lư ng phân t
Các kháng nguyên thông thư ng có tr ng lư ng phân t trên 6.000 dalton.
V i tr ng lư ng phân t 45.000 dalton, ovalbumin i u ki n tr thành m t
kháng nguyên m nh.
C u trúc ph c t p:
B t kì m t ch t sinh mi n d ch nào cũng ph i có c u trúc phân t tương i
ph c t p. Các ch t có c u trúc càng ph c t p thì tính sinh mi n d ch càng cao,
ovalbumin cũng th a mãn tính ch t này b i vì ovalbumin có b n ch t là protein.
C u trúc c a nó ph c t p do nó ư c c u t o t các acid amin s p x p theo các t
h p khác nhau.
- - 10 -
Như v y, v i các c i m trên, ovalbumin là m t kháng nguyên m nh hay
nó có tính sinh mi n d ch m nh. Do nó là thành ph n gây d ng i v i cơ th nên
m b o an toàn i v i ngư i và ông v t, thì các s n ph m là thu c, vacxin có
ngu n g c t tr ng, s a b t bu c ph i ki m tra thành ph n này.
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HI N OVALBUMIN VÀ KHUY N CÁO
V CÁCH PHÁT TRI N VÀ TH M NH PHƯƠNG PHÁP [5], [8], [14],
[15], [16]
1.5.1. Các phương pháp phát hi n ovalbumin [5], [8], [14]
So v i các tiêu chu n các ch t và thành ph n khác thì ki m tra hàm lư ng
ovalbumin tương i khó. V i hàm lư ng phát hi n th p ≤ 1 µ g/1 li u ơn cho
ngư i, òi h i ph i có m t phương pháp phát hi n phù h p. T b n ch t c a
ovalbumin là m t kháng nguyên, không th th y b ng m t thư ng nên ch có th
phát hi n ư c khi g n v i kháng th c hi u. Do s liên k t gi a kháng nguyên và
kháng th luôn mang tính c hi u cao nên phát hi n s có m t và nh lư ng kháng
nguyên hay kháng th cho chính xác cao.
Có nhi u phương pháp khác nhau dùng xác nh m i tương tác gi a
kháng nguyên và kháng th như:
– Ph n ng k t t a (Precipitation test)
– Ph n ng ngưng k t (Agglutination test)
– Ph n ng k t h p b th
– M i n d ch i n d i
– K thu t huỳnh quang mi n d ch (Immunofluorescent technique)
– Thí nghi m mi n d ch phóng x (Radioimmunoassay-RIA)
– ELISA- K thu t ch t h p ph g n enzyme (Enzyme-Linked immunosorbent
Assay).
Các k thu t này u d a vào s tương tác gi a kháng nguyên và kháng th
xác nh s có m t và nh lư ng kháng nguyên ho c kháng th trong m u
nghiên c u.
Trong ph m vi tài này, 4 phương pháp sau s ư c miêu t chi ti t hơn.
- - 11 -
1.5.1.1. Phương pháp Ouchterlony (khuy ch tán mi n d ch kép) [5]
Nguyên lý:
K thu t là s ngưng k t c hi u gi a kháng nguyên và kháng th x y ra khi
chúng di chuy n trên gel agarose khi cho kháng nguyên và kháng th pha
loãng thích h p ( n ng x y ra ph n ng ngưng k t). N u kháng th và
kháng nguyên ngưng k t c hi u s cho cung k t t a màu tr ng và ngư c l i, s
không có cung k t t a n u kháng nguyên và kháng th không ngưng k t c hi u.
Ưu i m : ây là k thu t ơn gi n nh t, d th c hi n, ít t n kém do không ph i s
d ng nhi u máy móc, hoá ch t.
Như c i m: Th i gian hoàn thành m t th nghi m kéo dài t 3 n 4 ngày; s phát
hi n kháng nguyên ho c kháng th ch mang tính nh tính, không nh lư ng chính
xác ư c hàm lư ng; hàm lư ng kháng nguyên t i a có th phát hi n ư c r t l n
(t 20÷30µg/ml) nên không th xác nh ư c nh ng m u có hàm lư ng kháng
nguyên nh hơn.
V i nh ng ưu và như c i m như trên, k thu t này ư c ng d ng phát
hi n kháng th ho c kháng nguyên trong nghiên c u chu n oán b nh, trong nh ng
trư ng h p xu t hi n kháng nguyên l .
1.5.1.2. Phương pháp i n di mi n d ch i lưu [5], [15]
Nguyên lý:
K thu t này tương t như k thu t khuy ch tán Ouchterlony nhưng thay cho
khuy ch tán t nhiên ngư i ta ã dùng m t l c i n di hư ng d n cho kháng
nguyên và kháng th g p nhau nhanh hơn trên gel agarose. Trong phương pháp này,
kháng th IgG và IgM s di chuy n v phía c c âm, dư i tác d ng c a dòng i n
kháng nguyên và kháng th g p nhau trên gel.
Ưu i m: Th i gian cho k t qu nhanh ch sau 1 gi .
Như c i m: Cũng gi ng phương pháp Ouchterlony, phương pháp này ch mang
tính nh tính; t n chi phí nhi u hơn vì ph i s d ng thêm máy móc, hoá ch t.
- - 12 -
1.5.1.3. Phương pháp mi n d ch phóng x (Radioimmunoassay- RIA) [8]
Nguyên lý:
Phương pháp d a trên s c nh tranh gi a kháng nguyên ánh gi u ng v
phóng x v i kháng nguyên không ánh d u ng v phóng x g n vào kháng th
c hi u.
lô i ch ng l y m t lư ng nh t nh kháng nguyên tinh khi t ánh d u
phóng x . Kháng nguyên này cùng lo i v i m u th nghi m. Tr n kháng nguyên
ánh d u trên v i lư ng kháng nguyên tương ương kháng th c h i u, r i . R a
kháng nguyên ánh d u t do (không g n v i kháng th ). o phóng x c a ph c
h kháng nguyên - kháng th (A).
lô ki m nghi m, ngoài kháng nguyên ánh d u và kháng th như trên còn
tr n thêm kháng nguyên c n th không ánh d u g n vào kháng th . R a kháng
nguyên ánh d u t do. o phóng x c a ph c h kháng nguyên - kháng th (B).
D a vào t l phóng x o ư c A/B xác nh n ng kháng nguyên
trong m u th so v i ư ng cong chu n.
Ưu i m: Phương pháp này cho k t qu nhanh và có chính xác cao.
Như c i m: Phương pháp này r t t n kém, s d ng ch t phóng x nên không an
toàn v i ngư i th c hi n.
1.5.1.4. Phương pháp ELISA – K thu t ch t h p ph mi n d ch g n enzyme
(Enzyme – Linked immunosorbent Assay) [5], [7], [8]
Enzyme – linked immunosorbent Assay (ELISA) là m t kĩ thu t sinh hoá
ư c s d ng chính trong lĩnh v c mi n d ch h c tìm ra m t kháng nguyên ho c
m t kháng th trong m u v i chính xác cao. ELISA ư c dùng như m t công c
h u hi u chu n oán trong y h c và tìm các tác nhân gây b nh [5].
Vì ELISA có th xác nh ư c lư ng kháng nguyên và kháng th trong m u
nên nó là m t công c h u ích xác nh n ng c a kháng th có trong huy t
thanh [7]. Nó còn ư c dùng tìm kháng nguyên [8]. Trong công nghi p th c
ph m, ELISA ư c ng d ng tìm các ch t gây d ng có trong m t s lo i th c
ph m như: s a, l c, qu óc chó, qu h nh và tr ng.
nguon tai.lieu . vn
