Xem mẫu
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
ĐA HÌNH THÁI ĐƠN GEN ADH1C
TRONG UNG THƯ TẾ BÀO GAN NGUYÊN PHÁT
Uông Thị Thu Hương1, Trần Huy Thịnh1,
Trần Vân Khánh1, Nguyễn Thanh Bình1, Vũ Trường Khanh2
1
Trường Đại Học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Bạch Mai
Enzyme có liên quan đến chuyển hóa rượu là alcohol dehydrogenase (ADH). ADH có nhiều isozyme
được mã hóa bởi nhiều gen khác nhau. Các alen ADH1C mã hóa cho các enzyme ADH có hoạt tính khác
nhau và kết quả là tốc độ phản ứng từ rượu chuyển thành acetaldehyde sẽ khác nhau. Alen ADH1C*1 của
gen ADH1C mã hóa cho enzym có khả năng tạo nồng độ acetaldehyde rất cao. Hơn nữa, có mối liên quan
giữa alen ADH1C*1 và một số loại ung thư có liên quan đến sử dụng rượu hiện vẫn còn đang bàn cãi.
Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: Xác định tỷ lệ kiểu gen và alen của gen ADH1C trên bệnh nhân
ung thư gan nguyên phát. Đa hình ADH1C được xác định bằng kỹ thuật PCR-RFLP (PCR-Restriction
fragment length polymorphism). Kết quả tỉ lệ kiểu gen ADH1C*1/*1, ADH1C*1/*2, ADH1C*2/*2 của nhóm
ung thư tế bào gan nguyên phát là 90%, 8,0%, 2,0% và nhóm chứng là 79,3%, 20,0%,0,7%. Kiểu gen
ADH1C*1/*1 và Alen ADH1C*1 trong nhóm bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát cao hơn trong
nhóm chứng với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với OR 2,34 (CI, 1,2 - 4,55), 1,87 (1,02 - 3,41). Bước
đầu khẳng định kiểu gen ADH1C*1/*1 và Alen ADH1C*1 là yếu tố nguy cơ độc lập với ung thư gan
nguyên phát ở bệnh nhân có sử dụng rượu.
Từ khóa: gen ADH1C, đa hình kiểu gen, ung thư gan tế bào gan nguyên phát
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư gan nguyên phát là một trong
những bệnh lý ác tính phổ biến nhất trên thế
giới, bệnh thường được phát hiện muộn, tiên
lượng rất xấu, tỷ lệ tử vong cao, thời gian
sống của người bệnh kể từ thời điểm phát
hiện bệnh ngắn [1; 2]. Nghiện rượu mạn tính
là nguyên nhân chính gây ung thư gan [3; 4].
Một vài nghiên cứu đã chỉ ra cùng lượng rượu
tiêu thụ nhưng nguy cơ ung thư là khác nhau
giữa mỗi cá thể, vậy ngoài yếu tố rượu tác
động gián tiếp gây ung thư thì yếu tố di truyền
đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành
các loại hình ung thư [5; 6]. Gen ADH1C có
các đa hình thái đơn (SNP) tạo ra các isoenĐịa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường
Đại học Y Hà Nội
Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn
zym có thuộc tính động học khác nhau. Đa
hình thái của gen mã hóa cho các enzym
ADH1C làm cho các enzym có hoạt tính thay
đổi nên nồng độ acetaldehyde (AA) tạo ra
khác nhau. Chất AA là chất trung gian được
tạo ra trong quá trình chuyển hóa rượu, đây
là chất độc và được chứng minh là chất gây
ung thư [5; 7]. Đã có nhiều nghiên cứu về
các đa hình kiểu gen ADH1C trên các loại
hình ung thư khác nhau, được thực hiện trên
thế giới [8 - 10]. Tại Việt Nam, nghiên cứu đa
hình thái gen ADH1C trên bệnh nhân ung thư
gan chưa được tìm hiều một cách đồng bộ
và bài bản. Vì vậy, nghiên cứu được thực
hiện với mục tiêu: Xác định tỷ lệ kiểu gen và
alen của gen ADH1C trên bệnh nhân ung thư
gan nguyên phát.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
Ngày nhận: 26/9/2017
Ngày được chấp thuận: 26/11/2017
TCNCYH 109 (4) - 2017
1. Đối tượng
1
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
150 bệnh nhân được chẩn đoán xác định
và được theo dõi điều trị ung thư gan nguyên
phát tại Bệnh viện K Trung ương từ tháng
1/2014 đến tháng 9/2014.
150 người mắc một số bệnh mạn tính
khám tại phòng khám Nội tại Bệnh viện Xanh
của bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên
phát và người lành đối chứng.
- Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ của
DNA được tách chiết bằng phương pháp đo
quang trên máy Nanodrop, dựa vào tỷ lệ
A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0.
Pôn Hà Nội. Đối tượng này được lựa chọn có
sử dụng rượu được khám kết luận không mắc
ung thư gan nguyên phát hay bất kỳ ung thư
nào khác, tình nguyện tham gia nghiên cứu,
được phỏng vấn và lấy mẫu cùng thời điểm
thực hiện nghiên cứu.
Các đối tượng nghiên cứu đều được khai
thác tiền sử sử dụng rượu. Phương pháp đo
lượng rượu tiêu thụ là hỏi trực tiếp bằng bảng
câu hỏi QF [11].
2.3. Kỹ thuật PCR-RFLP (PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism)
Khuyếch đại đoạn gen ADH1C bằng máy
PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Mồi xuôi: ADH3 ex8F: AAT AAT TAT TTT
TCA GGC TTT AAG AGT AAA TAT TCT GT.
Mồi ngược: ADH3 ex8R: AAT CTA CCT
CTT TCC AGA GC.
Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích
Dựa vào số lần sử dụng rượu trong tháng,
20μl gồm: 10 μl Taq polymerase, 1μl mồi xuôi,
thể tích cốc sử dụng, số gram rượu quy đổi
1μl mồi ngược, 2μl DNA và 6μl H2O. Chu trình
của từng loại rượu sẽ tính được lượng rượu
nhiệt của phản ứng PCR: [94oC/30 giây,
tiêu thụ trong tháng và theo ngày.
54oC/30 giây, 72oC/30 giây] 37 chu kỳ. Bảo
Mức độ tiêu thụ rượu được phân loại theo
quản mẫu ở 15oC.
hàm lượng tiêu thụ trong ngày: uống ít (nam ≤
Sản phẩm PCR được điện di trên gel
40g, nữ ≤ 20g), uống vừa (nam 41 - 60g, nữ
agarose 3% kiểm tra, sau đó được tiến hành
21 - 40g), nghiện rượu (nam ≥ 61g, nữ ≥ 41g).
giải trình tự theo quy trình thường quy. Kết
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm
Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại Học Y
Hà Nội.
2. Phương pháp
quả được so với trình tự Genebank.
Đoạn gen được khuếch đại với cặp mồi
đặc hiệu ADH3ex8F và ADH3ex8R là một
đoạn dài 162 bp trên exon 8 của gen ADH1C,
chứa SNP rs698. Vị trí SNP rs698 cách đầu
Thiết kết nghiên cứu: nghiên cứu bệnh
chứng.
2.1. Thu thập mẫu
- Thu thập mẫu máu của bệnh nhân ung
thư tế bào gan nguyên phát và mẫu chứng.
5' một đoạn 99 bp, cách đầu 3' một đoạn 62bp
và cách vị trí cắt đối chứng của enzym SspI
một đoạn 68 bp. Sản phẩm PCR sau khi
enzym SspI cho hình ảnh đoạn gen trên
điện di.
Alen ADH1C*2: 2 đoạn gen kích thước
2.2. Tách chiết DNA
31bp và 131bp. Alen ADH1C*1: 3 đoạn gen
- DNA được tách chiết theo phương pháp
kích thước 31bp và 68bp, 63bp, trong đó đoạn
phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi
68bp và 63bp trùng nhau cho hình ảnh 1 băng
2
TCNCYH 109 (4) - 2017
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
điện di.
hoàn toàn tự nguyện và có quyền rút khỏi
Kiểu gen ADH1C*1/*1: 2 băng tương ứng
nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham
đoạn gen 63bp, 68bp và 31bp. Kiểu gen
gia. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo
ADH1C*1/*2: 3 băng tương ứng đoạn gen
bí mật.
63bp, 68bp và 31bp, 131bp. Kiểu gen
III. KẾT QUẢ
ADH1C*2/*2: 2 băng tương ứng đoạn gen
131bp và 31bp.
1. Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu
2.4. Phân tích số liệu
Đối tượng nghiên cứu gồm 150 bệnh nhân
Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0
để phân tích số liệu. Dùng kiểm định χ2 để so
sánh tỷ lệ kiểu gen ADH1C của hai nhóm ung
thư tế bào gan nguyên phát và nhóm chứng.
Để ước tính mối liên quan giữa các kiểu gen
và khả năng mắc ung thư tế bào gan nguyên
phát dùng tỷ suất OR với khoảng tin cậy 95%.
ung thư tế bào gan nguyên phát và 150 người
bình thường làm đối chứng. Kết quả cho thấy
không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
(p > 0,05) về độ tuổi và giới tính giữa hai
nhóm bệnh và nhóm chứng. Điều này cho
thấy với việc nhóm bệnh và nhóm chứng khá
tương đồng nhau về tuổi và giới.
Trong nhóm bệnh, tỉ lệ nam mắc bệnh cao
Các kiểm định có ý nghĩa khi p < 0,05.
hơn nữ (tỉ lệ nam/nữ 4,18/1). Sử dụng rượu
3. Đạo đức trong nghiên cứu
với mức độ vừa và nghiện trong nhóm bệnh
Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức
chiếm tỉ lệ cao (tương ứng 40%, 36%). Tỷ lệ
nghiên cứu trong Y học theo Quyết định
bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát có
số
188/HĐĐĐ-ĐHYHN,
ngày
31/01/2013
của Hội đồng Đạo đức Y học Trường Đại học
HBV dương tính là khá cao chiếm tỉ lệ 66%
(bảng 1).
Y Hà Nội. Đối tượng tham gia nghiên cứu
Bảng 1. Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu
Bệnh
Chứng
Đặc điểm
p
n
%
n
%
Nam
121
80,7
131
87,3
Nữ
29
19,3
19
12,7
≤ 40
20
13,3
11
7,3
40 - 60
93
62,0
86
57,3
≥ 60
37
24,7
53
35,3
Nghiện
54
36,0
57
38,0
Uống vừa
60
40,0
53
35,3
Uống ít
36
24,0
40
26,7
99
66,0
84
56,0
Giới
Tuổi
Sử dụng
rượu
0,12
Nhiễm HBV
TCNCYH 109 (4) - 2017
0,06
0,69
0,08
3
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Đánh giá mối liên quan gen ADH1C với ung thư tế bào gan nguyên phát
Kết quả kiểu gen ADH1C bằng phương pháp PCR-RFLP. Sau khi cắt sản phẩm khuếch đại
của đoạn gen ADH1C, đem điện di trên gel agarose 3% thấy các băng rõ nét và phân tách rõ
ràng, kích thước phù hợp với các đoạn gen bị cắt (hình 1).
K21
K22
K23
K24
K25
K26
K61
K62
K63
K64 K65 K66
K27
K28
K29 K30
K31
M
131bp
63 - 68bp
31pb
K67
K68
K69
K70 K71
M
131bp
63 - 68bp
31pb
Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen ADH1C bằng enzym SspI
mẫu bệnh nhân ung thư gan nguyên phát
M: Marker 100bp; kiểu gen ADH1C*1/*1(K21- K29 và K31, K61, K64- K71), kiểu gen
ADH1C*1/*2 (K30), kiểu gen ADH1C*2/*2 (K63).
Sản phẩm cắt đoạn gen ADH1C bởi enzym SspI gồm các đoạn DNA có kích thước khác nhau
gồm 131bp, 63 - 68bp, 31bp chứng tỏ sản phẩm PCR được cắt hoàn toàn bởi enzym SspI. Mẫu
mang kiểu gen ADH1C*1/*1 gồm 2 băng DNA có kích thước 63 - 68bp và 31bp. Mẫu mang kiểu
gen ADH1C*1/*2 gồm 3 băng DNA có kích thước 131bp và 63 - 68bp, 31bp. Mẫu mang kiểu gen
ADH1C*2/*2 gồm 2 băng DNA có kích thước 31bp, 131bp.
Nghiên cứu trên 300 mẫu trong đó 150 mẫu chứng và 150 mẫu bệnh được kết quả như sau:
Kiểu gen ADH1C*1/*1 chiếm tỷ lệ cao trong cả nhóm bệnh (90,0%) và nhóm chứng (79,3%),
trong khi tỷ lệ kiểu gen dị hợp ADH1C*1/*2 kiểu gen đồng hợp ADH1C*2/*2 tỷ lệ thấp. Kiểu gen
đồng hợp ADH1C*2/*2 tỷ lệ rất thấp, nhóm bệnh gặp 3 trường hợp (2,0%) và nhóm chứng 1
trường hợp (0,7%) (bảng 2).
4
TCNCYH 109 (4) - 2017
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Bảng 2. Tỷ lệ kiểu gen ADH1C của nhóm bệnh và nhóm chứng
Kiểu gen
Nhóm bệnh (n = 150)
Nhóm chứng (n = 150)
Nhóm nghiên cứu (n = 300)
ADH1C*1/*1
135 (90,0%)
119 (79,3%)
254 (84,7%)
ADH1C*1/*2
12 (8,0%)
30 (20,0%)
42 (14,0%)
ADH1C*2/*2
(2,0%)
1,0 (0,7%)
4 (1,3%)
Bảng 3. Tỷ lệ kiểu gen và alen ADH1C của nhóm bệnh và nhóm chứng
Kiểu gen
Nhóm bệnh
Nhóm chứng
p
OR
CI 95%
ADH1C*1/*1
135 (90,0%)
119 (79,3%)
0,01
2,34
1,2 - 4,55
ADH1C*1/*2 và
ADH1C*2/*2
15 (10,0%)
31 (20,7%)
Tổng
150 (100%)
150 (100%)
ADH1C*1
282 (94,0%)
268 (89,3%)
ADH1C*2
18 (6,0%)
32 (10,7%)
300 (100%)
300 (100%)
1,00
Alen
Tổng
0,039
1,87
1,02 - 3,41
1,00
Tỷ lệ kiểu gen ADH1C*1/*1 ở nhóm bệnh cao hơn nhóm chứng và có sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê với kiểu gen ADH1C*1/*2 và ADH1C*2/*2 với p = 0,01 và OR = 2,34; CI 95%
(1,2 - 4,55).
Alen ADH1C*1 có nguy cơ bị ung thư tế bào gan nguyên phát cao hơn alen ADH1C*2, sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,039; OR = 1,87 CI 95% (1,02 - 3,41).
Hình 2. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen ADH1C
của bệnh nhân ung thư gan nguyên phát K131 và K132
Đoạn gen được khuếch đại là đoạn dài 162bp trên exon 8 của gen ADH1C, từ nucleotide vị trí
thứ 1033 đến 1195, đa hình thái (SNP rs698) ở vị trí nucleotide 1133 trên phân tử mARN. Tại vị
TCNCYH 109 (4) - 2017
5
nguon tai.lieu . vn
ĐA HÌNH THÁI ĐƠN GEN ADH1C
TRONG UNG THƯ TẾ BÀO GAN NGUYÊN PHÁT
Uông Thị Thu Hương1, Trần Huy Thịnh1,
Trần Vân Khánh1, Nguyễn Thanh Bình1, Vũ Trường Khanh2
1
Trường Đại Học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Bạch Mai
Enzyme có liên quan đến chuyển hóa rượu là alcohol dehydrogenase (ADH). ADH có nhiều isozyme
được mã hóa bởi nhiều gen khác nhau. Các alen ADH1C mã hóa cho các enzyme ADH có hoạt tính khác
nhau và kết quả là tốc độ phản ứng từ rượu chuyển thành acetaldehyde sẽ khác nhau. Alen ADH1C*1 của
gen ADH1C mã hóa cho enzym có khả năng tạo nồng độ acetaldehyde rất cao. Hơn nữa, có mối liên quan
giữa alen ADH1C*1 và một số loại ung thư có liên quan đến sử dụng rượu hiện vẫn còn đang bàn cãi.
Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: Xác định tỷ lệ kiểu gen và alen của gen ADH1C trên bệnh nhân
ung thư gan nguyên phát. Đa hình ADH1C được xác định bằng kỹ thuật PCR-RFLP (PCR-Restriction
fragment length polymorphism). Kết quả tỉ lệ kiểu gen ADH1C*1/*1, ADH1C*1/*2, ADH1C*2/*2 của nhóm
ung thư tế bào gan nguyên phát là 90%, 8,0%, 2,0% và nhóm chứng là 79,3%, 20,0%,0,7%. Kiểu gen
ADH1C*1/*1 và Alen ADH1C*1 trong nhóm bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát cao hơn trong
nhóm chứng với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với OR 2,34 (CI, 1,2 - 4,55), 1,87 (1,02 - 3,41). Bước
đầu khẳng định kiểu gen ADH1C*1/*1 và Alen ADH1C*1 là yếu tố nguy cơ độc lập với ung thư gan
nguyên phát ở bệnh nhân có sử dụng rượu.
Từ khóa: gen ADH1C, đa hình kiểu gen, ung thư gan tế bào gan nguyên phát
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư gan nguyên phát là một trong
những bệnh lý ác tính phổ biến nhất trên thế
giới, bệnh thường được phát hiện muộn, tiên
lượng rất xấu, tỷ lệ tử vong cao, thời gian
sống của người bệnh kể từ thời điểm phát
hiện bệnh ngắn [1; 2]. Nghiện rượu mạn tính
là nguyên nhân chính gây ung thư gan [3; 4].
Một vài nghiên cứu đã chỉ ra cùng lượng rượu
tiêu thụ nhưng nguy cơ ung thư là khác nhau
giữa mỗi cá thể, vậy ngoài yếu tố rượu tác
động gián tiếp gây ung thư thì yếu tố di truyền
đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành
các loại hình ung thư [5; 6]. Gen ADH1C có
các đa hình thái đơn (SNP) tạo ra các isoenĐịa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường
Đại học Y Hà Nội
Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn
zym có thuộc tính động học khác nhau. Đa
hình thái của gen mã hóa cho các enzym
ADH1C làm cho các enzym có hoạt tính thay
đổi nên nồng độ acetaldehyde (AA) tạo ra
khác nhau. Chất AA là chất trung gian được
tạo ra trong quá trình chuyển hóa rượu, đây
là chất độc và được chứng minh là chất gây
ung thư [5; 7]. Đã có nhiều nghiên cứu về
các đa hình kiểu gen ADH1C trên các loại
hình ung thư khác nhau, được thực hiện trên
thế giới [8 - 10]. Tại Việt Nam, nghiên cứu đa
hình thái gen ADH1C trên bệnh nhân ung thư
gan chưa được tìm hiều một cách đồng bộ
và bài bản. Vì vậy, nghiên cứu được thực
hiện với mục tiêu: Xác định tỷ lệ kiểu gen và
alen của gen ADH1C trên bệnh nhân ung thư
gan nguyên phát.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
Ngày nhận: 26/9/2017
Ngày được chấp thuận: 26/11/2017
TCNCYH 109 (4) - 2017
1. Đối tượng
1
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
150 bệnh nhân được chẩn đoán xác định
và được theo dõi điều trị ung thư gan nguyên
phát tại Bệnh viện K Trung ương từ tháng
1/2014 đến tháng 9/2014.
150 người mắc một số bệnh mạn tính
khám tại phòng khám Nội tại Bệnh viện Xanh
của bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên
phát và người lành đối chứng.
- Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ của
DNA được tách chiết bằng phương pháp đo
quang trên máy Nanodrop, dựa vào tỷ lệ
A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0.
Pôn Hà Nội. Đối tượng này được lựa chọn có
sử dụng rượu được khám kết luận không mắc
ung thư gan nguyên phát hay bất kỳ ung thư
nào khác, tình nguyện tham gia nghiên cứu,
được phỏng vấn và lấy mẫu cùng thời điểm
thực hiện nghiên cứu.
Các đối tượng nghiên cứu đều được khai
thác tiền sử sử dụng rượu. Phương pháp đo
lượng rượu tiêu thụ là hỏi trực tiếp bằng bảng
câu hỏi QF [11].
2.3. Kỹ thuật PCR-RFLP (PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism)
Khuyếch đại đoạn gen ADH1C bằng máy
PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Mồi xuôi: ADH3 ex8F: AAT AAT TAT TTT
TCA GGC TTT AAG AGT AAA TAT TCT GT.
Mồi ngược: ADH3 ex8R: AAT CTA CCT
CTT TCC AGA GC.
Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích
Dựa vào số lần sử dụng rượu trong tháng,
20μl gồm: 10 μl Taq polymerase, 1μl mồi xuôi,
thể tích cốc sử dụng, số gram rượu quy đổi
1μl mồi ngược, 2μl DNA và 6μl H2O. Chu trình
của từng loại rượu sẽ tính được lượng rượu
nhiệt của phản ứng PCR: [94oC/30 giây,
tiêu thụ trong tháng và theo ngày.
54oC/30 giây, 72oC/30 giây] 37 chu kỳ. Bảo
Mức độ tiêu thụ rượu được phân loại theo
quản mẫu ở 15oC.
hàm lượng tiêu thụ trong ngày: uống ít (nam ≤
Sản phẩm PCR được điện di trên gel
40g, nữ ≤ 20g), uống vừa (nam 41 - 60g, nữ
agarose 3% kiểm tra, sau đó được tiến hành
21 - 40g), nghiện rượu (nam ≥ 61g, nữ ≥ 41g).
giải trình tự theo quy trình thường quy. Kết
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm
Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại Học Y
Hà Nội.
2. Phương pháp
quả được so với trình tự Genebank.
Đoạn gen được khuếch đại với cặp mồi
đặc hiệu ADH3ex8F và ADH3ex8R là một
đoạn dài 162 bp trên exon 8 của gen ADH1C,
chứa SNP rs698. Vị trí SNP rs698 cách đầu
Thiết kết nghiên cứu: nghiên cứu bệnh
chứng.
2.1. Thu thập mẫu
- Thu thập mẫu máu của bệnh nhân ung
thư tế bào gan nguyên phát và mẫu chứng.
5' một đoạn 99 bp, cách đầu 3' một đoạn 62bp
và cách vị trí cắt đối chứng của enzym SspI
một đoạn 68 bp. Sản phẩm PCR sau khi
enzym SspI cho hình ảnh đoạn gen trên
điện di.
Alen ADH1C*2: 2 đoạn gen kích thước
2.2. Tách chiết DNA
31bp và 131bp. Alen ADH1C*1: 3 đoạn gen
- DNA được tách chiết theo phương pháp
kích thước 31bp và 68bp, 63bp, trong đó đoạn
phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi
68bp và 63bp trùng nhau cho hình ảnh 1 băng
2
TCNCYH 109 (4) - 2017
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
điện di.
hoàn toàn tự nguyện và có quyền rút khỏi
Kiểu gen ADH1C*1/*1: 2 băng tương ứng
nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham
đoạn gen 63bp, 68bp và 31bp. Kiểu gen
gia. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo
ADH1C*1/*2: 3 băng tương ứng đoạn gen
bí mật.
63bp, 68bp và 31bp, 131bp. Kiểu gen
III. KẾT QUẢ
ADH1C*2/*2: 2 băng tương ứng đoạn gen
131bp và 31bp.
1. Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu
2.4. Phân tích số liệu
Đối tượng nghiên cứu gồm 150 bệnh nhân
Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0
để phân tích số liệu. Dùng kiểm định χ2 để so
sánh tỷ lệ kiểu gen ADH1C của hai nhóm ung
thư tế bào gan nguyên phát và nhóm chứng.
Để ước tính mối liên quan giữa các kiểu gen
và khả năng mắc ung thư tế bào gan nguyên
phát dùng tỷ suất OR với khoảng tin cậy 95%.
ung thư tế bào gan nguyên phát và 150 người
bình thường làm đối chứng. Kết quả cho thấy
không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
(p > 0,05) về độ tuổi và giới tính giữa hai
nhóm bệnh và nhóm chứng. Điều này cho
thấy với việc nhóm bệnh và nhóm chứng khá
tương đồng nhau về tuổi và giới.
Trong nhóm bệnh, tỉ lệ nam mắc bệnh cao
Các kiểm định có ý nghĩa khi p < 0,05.
hơn nữ (tỉ lệ nam/nữ 4,18/1). Sử dụng rượu
3. Đạo đức trong nghiên cứu
với mức độ vừa và nghiện trong nhóm bệnh
Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức
chiếm tỉ lệ cao (tương ứng 40%, 36%). Tỷ lệ
nghiên cứu trong Y học theo Quyết định
bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát có
số
188/HĐĐĐ-ĐHYHN,
ngày
31/01/2013
của Hội đồng Đạo đức Y học Trường Đại học
HBV dương tính là khá cao chiếm tỉ lệ 66%
(bảng 1).
Y Hà Nội. Đối tượng tham gia nghiên cứu
Bảng 1. Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu
Bệnh
Chứng
Đặc điểm
p
n
%
n
%
Nam
121
80,7
131
87,3
Nữ
29
19,3
19
12,7
≤ 40
20
13,3
11
7,3
40 - 60
93
62,0
86
57,3
≥ 60
37
24,7
53
35,3
Nghiện
54
36,0
57
38,0
Uống vừa
60
40,0
53
35,3
Uống ít
36
24,0
40
26,7
99
66,0
84
56,0
Giới
Tuổi
Sử dụng
rượu
0,12
Nhiễm HBV
TCNCYH 109 (4) - 2017
0,06
0,69
0,08
3
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Đánh giá mối liên quan gen ADH1C với ung thư tế bào gan nguyên phát
Kết quả kiểu gen ADH1C bằng phương pháp PCR-RFLP. Sau khi cắt sản phẩm khuếch đại
của đoạn gen ADH1C, đem điện di trên gel agarose 3% thấy các băng rõ nét và phân tách rõ
ràng, kích thước phù hợp với các đoạn gen bị cắt (hình 1).
K21
K22
K23
K24
K25
K26
K61
K62
K63
K64 K65 K66
K27
K28
K29 K30
K31
M
131bp
63 - 68bp
31pb
K67
K68
K69
K70 K71
M
131bp
63 - 68bp
31pb
Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen ADH1C bằng enzym SspI
mẫu bệnh nhân ung thư gan nguyên phát
M: Marker 100bp; kiểu gen ADH1C*1/*1(K21- K29 và K31, K61, K64- K71), kiểu gen
ADH1C*1/*2 (K30), kiểu gen ADH1C*2/*2 (K63).
Sản phẩm cắt đoạn gen ADH1C bởi enzym SspI gồm các đoạn DNA có kích thước khác nhau
gồm 131bp, 63 - 68bp, 31bp chứng tỏ sản phẩm PCR được cắt hoàn toàn bởi enzym SspI. Mẫu
mang kiểu gen ADH1C*1/*1 gồm 2 băng DNA có kích thước 63 - 68bp và 31bp. Mẫu mang kiểu
gen ADH1C*1/*2 gồm 3 băng DNA có kích thước 131bp và 63 - 68bp, 31bp. Mẫu mang kiểu gen
ADH1C*2/*2 gồm 2 băng DNA có kích thước 31bp, 131bp.
Nghiên cứu trên 300 mẫu trong đó 150 mẫu chứng và 150 mẫu bệnh được kết quả như sau:
Kiểu gen ADH1C*1/*1 chiếm tỷ lệ cao trong cả nhóm bệnh (90,0%) và nhóm chứng (79,3%),
trong khi tỷ lệ kiểu gen dị hợp ADH1C*1/*2 kiểu gen đồng hợp ADH1C*2/*2 tỷ lệ thấp. Kiểu gen
đồng hợp ADH1C*2/*2 tỷ lệ rất thấp, nhóm bệnh gặp 3 trường hợp (2,0%) và nhóm chứng 1
trường hợp (0,7%) (bảng 2).
4
TCNCYH 109 (4) - 2017
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Bảng 2. Tỷ lệ kiểu gen ADH1C của nhóm bệnh và nhóm chứng
Kiểu gen
Nhóm bệnh (n = 150)
Nhóm chứng (n = 150)
Nhóm nghiên cứu (n = 300)
ADH1C*1/*1
135 (90,0%)
119 (79,3%)
254 (84,7%)
ADH1C*1/*2
12 (8,0%)
30 (20,0%)
42 (14,0%)
ADH1C*2/*2
(2,0%)
1,0 (0,7%)
4 (1,3%)
Bảng 3. Tỷ lệ kiểu gen và alen ADH1C của nhóm bệnh và nhóm chứng
Kiểu gen
Nhóm bệnh
Nhóm chứng
p
OR
CI 95%
ADH1C*1/*1
135 (90,0%)
119 (79,3%)
0,01
2,34
1,2 - 4,55
ADH1C*1/*2 và
ADH1C*2/*2
15 (10,0%)
31 (20,7%)
Tổng
150 (100%)
150 (100%)
ADH1C*1
282 (94,0%)
268 (89,3%)
ADH1C*2
18 (6,0%)
32 (10,7%)
300 (100%)
300 (100%)
1,00
Alen
Tổng
0,039
1,87
1,02 - 3,41
1,00
Tỷ lệ kiểu gen ADH1C*1/*1 ở nhóm bệnh cao hơn nhóm chứng và có sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê với kiểu gen ADH1C*1/*2 và ADH1C*2/*2 với p = 0,01 và OR = 2,34; CI 95%
(1,2 - 4,55).
Alen ADH1C*1 có nguy cơ bị ung thư tế bào gan nguyên phát cao hơn alen ADH1C*2, sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,039; OR = 1,87 CI 95% (1,02 - 3,41).
Hình 2. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen ADH1C
của bệnh nhân ung thư gan nguyên phát K131 và K132
Đoạn gen được khuếch đại là đoạn dài 162bp trên exon 8 của gen ADH1C, từ nucleotide vị trí
thứ 1033 đến 1195, đa hình thái (SNP rs698) ở vị trí nucleotide 1133 trên phân tử mARN. Tại vị
TCNCYH 109 (4) - 2017
5