Xem mẫu
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
by inversion - PCR. Five severe Hemophilia A patients were selected for this study; we use Inversion - PCR to analyse intron 22 inversion in F8 gene. 1/5 patients were found to have intron 22
inversion. In conclusion, intron 22 inversion was successfully identified in Vietnamese severe Hemophilia A patients by I - PCR technique.
Keywords: Hemophilia A, inversion intron 22, inversion - PCR
BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG CHUỘT
Tô Minh Quân1, Lê Thị Ngọc Hương1, Hoàng Đạo Bảo Trâm2
1
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
2
Trường Đại học Y - Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tế bào gốc tủy răng chuột nhắt trắng Mus musculus var albino được bảo quản trong môi trường DMEM/
F12 bổ sung DMSO 10%, FBS 20% theo 2 quy trình giảm nhiệt: (1) để trong điều kiện 4oC/20 phút, -20oC/30
phút, sau đó chuyển sang bảo quản ở -80oC; (2) để trong điều kiện -20oC/30 phút và bảo quản ở -80oC. Tế
bào đông lạnh được giải đông trong môi trường nuôi cấy DMEM/F12 bổ sung FBS 20% ở 370C. Các tế bào
được tiếp tục nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine
100µg/ml, ở điều kiện 37oC, CO2 5%. Tỷ lệ tế bào sống sau quá trình bảo quản đông lạnh ở thời điểm 1
ngày, 2 tuần, 4 tuần và 8 tuần được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue. Sự biểu hiện các
marker bề mặt tế bào được kiểm tra bằng phương pháp Flow Cytometry. Thử nghiệm cho thấy tế bào tủy
răng chuột được bảo tốt trong thời gian 4 tuần theo quy trình đông lạnh -20oC/20 phút và bảo quản ở -80oC.
Sau khi giải đông, các tế bào có khả năng bám, tăng trưởng và biểu hiện các marker của tế bào gốc trung
mô CD73, CD90, CD105 và không biểu hiện các marker của tế bào máu CD19, CD34, CD45.
Từ khóa: tế bào gốc tủy răng, bảo quản tế bào, nuôi cấy tế bào
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa
trong mô sống, có khả năng trở thành các tế
bào chuyên biệt với các chức năng đặc trưng
[1]. Trong điều kiện in vivo hoặc in vitro, mỗi tế
bào gốc có thể tự làm mới với các tính năng
riêng biệt mới. Ngày nay, tế bào gốc được
tách và thu nhận từ rất nhiều nguồn (phôi giai
đoạn tiền làm tổ, thai, cơ thể trưởng thành,..).
Tủy răng là vùng tế bào giúp răng sống và duy
Địa chỉ liên hệ: Hoàng Đạo Bảo Trâm, Đại học Y Dược Tp
Hồ Chí Minh, 217 Hồng Bàng, Quận 5, TpHCM
email: hoangdaobaotram@gmail.com
Ngày nhận: 13/03/2013
Ngày được chấp thuận: 20/6/2013
20
trì chức năng. Tương tự như tủy xương, tủy
răng chứa các tế bào gốc trung mô. Ngoài ra,
tủy răng còn chứa tế bào tiền nguyên bào
ngà, tế bào tạo máu. Tế bào tủy răng là
nguyên liệu quan trọng cho những nghiên cứu
trong lĩnh vực tái tạo răng. Sau thành công
của Gronthos năm 2000 trong việc phân lập
và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng người [2], trên
thế giới đã có nhiều nghiên cứu tiếp tục phát
triển theo hướng này. Tại Việt Nam, một số
nghiên cứu đã cho kết quả nuôi cấy thành
công tế bào từ mảnh mô tủy răng người [3; 4].
Song song với việc phân lập tế bào gốc, kỹ
thuật bảo quản tế bào gốc động vật cũng phát
triển và mở ra một kỷ nguyên mới trong công
nghệ tế bào động vật. Với mục tiêu xuyên suốt
TCNCYH 83 (3) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
là lưu giữ tế bào trong trạng thái nguyên vẹn
Tế bào gốc tủy răng được thu nhận bằng
theo thời gian và có thể sử dụng sau này cho
các mục đích nghiên cứu hay điều trị, việc bảo
phương pháp tách với Trypsin/EDTA 0,25%;
0,02%. Tế bào gốc tủy răng được bảo quản
quản tế bào gốc động vật bao hàm nhiều ý
nghĩa thực tiễn: giảm thiểu sự biến đổi gen,
trong môi trường DMEM/F12 bổ sung DMSO
(Dimethyl Sulfoxide) 10%, FBS 20%. Tế bào
ngăn cản biệt hóa tế bào, giảm nguy cơ nhiễm
khuẩn và chết tế bào, giảm nhiễm chéo các
được đông lạnh theo 2 quy trình nhiệt:
Quy trình 1: mẫu lần lượt trải qua các giai
dòng tế bào, giảm nguy cơ biến đổi cấu trúc
đoạn ở điều kiện 4oC trong 20 phút và -20oC
và thay đổi hình thái, giảm chi phí nuôi cấy [1].
Về lý thuyết, tế bào gốc có khả năng phân
trong 30 phút, sau đó chuyển sang bảo quản
ở điều kiện -80oC;
chia vô hạn, song nhiều nghiên cứu cho thấy
khi các tế bào phân chia nhiều lần trong
Quy trình 2: mẫu trải giai đoạn ở điều kiện
-20oC trong 20 phút, sau đó chuyển sang bảo
những khoản thời gian dài, có thể xảy ra các
bất thường về nhiễm sắc thể. Trong khi đó, kỹ
quản ở điều kiện -80oC.
thuật phân lập các dòng tế bào gốc rất khó
tuần, 8 tuần, tế bào được tiến hành giải đông
trong môi trường nuôi cấy DMEM/F12 bổ sung
khăn, do vậy việc bảo quản tế bào gốc là rất
cần thiết nhằm phục vụ các mục đích nghiên
cứu và ứng dụng. Một số kỹ thuật bảo quản tế
bào gốc được áp dụng phổ biến là kỹ thuật
đông lạnh và kỹ thuật đông khô [1]. Nghiên
cứu này được tiến hành nhằm mục tiêu: bảo
quản tế bào gốc của tủy răng chuột áp dụng
Sau thời gian đông lạnh 1 ngày, 2 tuần, 4
FBS 20%. Tỷ lệ sống chết tế bào được xác
định bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue,
sự biểu hiện marker CD73, CD90, CD105,
CD19, CD34, CD45 được đánh giá bằng
phương pháp Flow Cytometry.
quy trình nhiệt.
III. KẾT QUẢ
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
Tỷ lệ tế bào sống khi giải đông và nuôi
cấy sau bảo quản
Tế bào gốc tủy răng chuột nhắt trắng Mus
musculus var. albino được thu nhận bằng
Tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản đông lạnh
phương pháp nuôi cấy mảnh mô tủy răng
trong môi trường DMEM/F12 (Sigma) bổ sung
1 ngày theo hai quy trình đều cao (> 90%),
không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
huyết thanh bào thai bò (FBS) 10% (Sigma),
(p > 0,05) (bảng 1). Các tế bào đông lạnh sau
Peniciline 100UI/ml (Sigma), Streptomycine
100 µg/ml (Sigma) ở điều kiện 37oC, CO2 5%.
khi giải đông được tiếp tục nuôi cấy trong môi
trường có bổ sung huyết thanh.
Bảng 1. Tỷ lệ tế bào sống khi giải đông sau bảo quản một ngày
Tỷ lệ tế bào sống
TCNCYH 83 (3) - 2013
Quy trình 1
4oC/20’
-20oC/30’
-80oC
Quy trình 2
95%
94%
97%
97%
97%
98%
-20oC/30’
-80oC
21
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Sau 1 ngày, quan sát được hiện tượng các tế bào bám trên bề mặt đĩa nuôi cấy, tế bào có
hình dạng tương tự tế bào trước khi đưa vào bảo quản đông lạnh (hình 1). Các tế bào này tiếp
tục tăng sinh trong những ngày nuôi cấy tiếp theo.
Hình 1. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược: tế bào giải đông sau bảo quản
đông lạnh một ngày (a: x40; b: x200)
Hình 2. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược: tế bào giải đông sau bảo quản
hai tuần (a: x40; b: x200)
Kết quả thu nhận được sau 1 ngày cho
thấy hai quy trình đông lạnh có hiệu quả
tương đương nhau. Tuy nhiên, quy trình 2
đơn giản hơn và tiết kiệm thời gian, do đó
được tiếp tục áp dụng và đánh giá với thời
gian bảo quản dài hơn, ở các thời điểm sau 2
tuần, 4 tuần và 8 tuần.
Tỷ lệ tế bào sống trung bình sau 2 tuần, 4
tuần, 8 tuần bảo quản lần lượt là 95,2%,
65,6%, 17,3%. Sau 2 tuần bảo quản đông
lệ tế bào sống giảm còn dưới 20% (bảng 2).
Kết quả cho thấy hiệu quả đông lạnh tế bào
giảm dần theo thời gian.
Sự biểu hiện marker bề mặt tế bào sau
giải đông
Sau khi giải đông và nuôi cấy tế bào đã
được bảo quản đông lạnh trong thời gian 4
tuần, tế bào bám trên bề mặt đĩa nuôi cấy sau
1 ngày, các tế bào có hình thái tương tự tế
lạnh ở -80 C, trung bình tỷ lệ tế bào sống
giảm từ 96,3% còn 95,2%. Sau 4 tuần, tỷ lệ tế
bào trước bảo quản, với dạng hình thoi, dài
bào sống trung bình là 65,6%. Sau 8 tuần, tỷ
tăng trưởng tốt, thời gian đạt được mật độ
o
22
100 - 120 µm, rộng 10 - 30 µm. Các tế bào
TCNCYH 83 (3) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
hợp dòng là 7 ngày. Khi tiến hành đánh giá
biểu hiện dương tính với các marker CD73
đặc tính của tế bào bằng phương pháp Flow
(98,08%), CD90 (91,3%), CD105 (98,76%) và
Cytometry, các tế bào có biểu hiện marker bề
âm tính với các marker CD19 (0,72%), CD34
mặt của tế bào gốc trung mô, tiêu chuẩn của
(0,56%), CD45 (7,65%), tương tự như các tế
Hiệp hội Quốc tế về tế bào gốc [5]. Tế bào có
bào nuôi cấy trước bảo quản đông lạnh (hình 3).
Bảng 2. Mật độ và tỷ lệ tế bào sống khi giải đông sau bảo quản 2, 4 và 8 tuần
Thời gian bảo quản
2 tuần
4 tuần
8 tuần
Mẫu
Mật độ tế bào (tb/ống)
Tỷ lệ tế bào sống
1
4,88 x 106
95,7%
2
4,57 x 106
93,2%
3
4,34 x 106
96,6%
1
4,39 x 106
62,9%
2
4,06 x 106
63,5%
3
4,25 x 106
70,3%
1
5,01 x 106
15%
2
4,16 x 106
20%
3
6
17%
5,19 x 10
Hình 3. Kết quả đánh giá marker bề mặt tế bào tủy răng chuột P4 sau bảo quản 4 tuần
TCNCYH 83 (3) - 2013
23
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Trong điều kiện nghiên cứu, chúng tôi
o
hiện tế bào sinh ung thư. Bảo quản nhằm lưu
nhận thấy, đối với quy trình bảo quản ở -80 C,
thời gian bảo quản tốt nhất là trong vòng
giữ tế bào và duy trì các đặc tính của tế bào
giúp chúng ta có thể có được một nguồn tế
4 tuần.
bào gốc có sẵn với số lượng lớn, phục vụ cho
nghiên cứu và các liệu pháp điều trị khi cần.
IV. BÀN LUẬN
Tế bào gốc trưởng thành là các tế bào
được thu nhận từ cơ thể trưởng thành. Tế bào
Bên cạnh đó, quá trình nuôi cấy tế bào đạt
đến giai đoạn tối ưu thường không dễ dàng,
thường bao qua nhiều giai đoạn như nuôi cấy
gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells MSC) là những tế bào có nguồn gốc trung
sơ cấp từ mảnh mô, nuôi cấy thứ cấp qua
nhiều thế hệ. Do đó, việc lưu trữ các dòng tế
mô có khả năng tự phân chia và biệt hóa
bào giúp tiết kiệm công sức, tiền bạc và thời
gian trong nghiên cứu.
thành nhiều dòng tế bào như tế bào tạo sụn,
xương, mỡ, cơ và mô liên kết đệm. Do đó,
MSC được xem là nguồn tế bào gốc nhiều
triển vọng cho các phương pháp điều trị bằng
liệu pháp tế bào. MSC được thu từ nhiều
nguồn như tủy xương, máu cuống rốn, mô
mỡ, răng... Trong đó, MSC từ răng là nguồn
tế bào tự thân được thu nhận dễ dàng, ít gây
xâm lấn bệnh nhân và có tiềm năng biệt hóa
thành các loại tế bào răng.
Quần thể tế bào gốc trong tủy răng rất ít;
xấp xỉ 1% tổng số tế bào và quá trình tích tuổi
làm giảm dần khả năng tham gia tạo mô và
làm lành thương của tế bào [6]. Trong các
nghiên cứu in vitro hay các nghiên cứu tiền
lâm sàng hoặc trong các ứng dụng lâm sàng,
lượng tế bào gốc cần sử dụng thường rất lớn.
Việc nuôi cấy cho tế bào gốc tủy răng tăng
sinh có vai trò rất cần thiết trong liệu pháp tế
bào; tuy nhiên, trong quá trình được nuôi cấy
và tăng sinh, các tế bào có nguy cơ mất tính
gốc, cảm ứng tự biệt hóa… Do đó, tế bào gốc
cần được nuôi cấy để đạt được số lượng tế
bào cần thiết trong khoảng thời gian ngắn
nhất với số lần cấy chuyền ít nhất. Đối với
những tế bào đã đạt tới thời điểm tối ưu nhằm
sử dụng trong những nghiên cứu sau hoặc
cho những ứng dụng lâm sàng, việc kéo dài
thời gian nuôi cấy sẽ làm gia tăng khả năng
mất tính gốc tế bào và gia tăng khả năng xuất
24
Trong nghiên cứu của Ding và cộng sự,
các tế bào nhú chóp răng (SCAP) đã được
bảo quản đông lạnh 6 tháng trong nitrogen
lỏng. Các tác giả nhận thấy rằng quy trình
đông lạnh đã thực hiện không ảnh hưởng tới
các đặc điểm hình thái, khả năng tăng sinh và
các đặc tính về kiểu hình của tế bào. Trong 4
loại dung dịch bảo quản bao gồm DMSO 1% +
trehalose 9% + FBS 90%, DMSO 4% + trehalose 6% + FBS 90%, DMSO 8% + trehalose
2% + FBS 90%, DMSO 10% + FBS 90%,
dung dịch DMSO 4% + trehalose 6% + FBS
90% là loại dung dịch bảo quản ưu việt nhất,
cho mức độ tế bào sống cao, nâng khả năng
biệt hóa và giảm tác hại của DMSO [7,8].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng
nuôi cấy lại tế bào gốc tủy răng sau bảo quản,
các tế bào này duy trì được các đặc tính hình
thái chức năng và khả năng biệt hóa đa dòng
(m ultilineage differentiation) [9; 10; 11].
Nghiên cứu này hướng tới thiết lập quy trình
đông lạnh, giải đông đơn giản, phù hợp với
điều kiện của hầu hết các đơn vị nghiên cứu
và đơn vị lâm sàng. Đối với quá trình bảo
quản, trong môi trường đông lạnh, quy trình
hạ nhiệt, quy trình giải đông đóng vai trò rất
quan trọng trong tính chất tế bào. Môi trường
đông lạnh được sử dụng là môi trường DMSO
10%. DMSO (Dimethyl Sulfoxide) có những
TCNCYH 83 (3) - 2013
nguon tai.lieu . vn
by inversion - PCR. Five severe Hemophilia A patients were selected for this study; we use Inversion - PCR to analyse intron 22 inversion in F8 gene. 1/5 patients were found to have intron 22
inversion. In conclusion, intron 22 inversion was successfully identified in Vietnamese severe Hemophilia A patients by I - PCR technique.
Keywords: Hemophilia A, inversion intron 22, inversion - PCR
BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG CHUỘT
Tô Minh Quân1, Lê Thị Ngọc Hương1, Hoàng Đạo Bảo Trâm2
1
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
2
Trường Đại học Y - Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tế bào gốc tủy răng chuột nhắt trắng Mus musculus var albino được bảo quản trong môi trường DMEM/
F12 bổ sung DMSO 10%, FBS 20% theo 2 quy trình giảm nhiệt: (1) để trong điều kiện 4oC/20 phút, -20oC/30
phút, sau đó chuyển sang bảo quản ở -80oC; (2) để trong điều kiện -20oC/30 phút và bảo quản ở -80oC. Tế
bào đông lạnh được giải đông trong môi trường nuôi cấy DMEM/F12 bổ sung FBS 20% ở 370C. Các tế bào
được tiếp tục nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine
100µg/ml, ở điều kiện 37oC, CO2 5%. Tỷ lệ tế bào sống sau quá trình bảo quản đông lạnh ở thời điểm 1
ngày, 2 tuần, 4 tuần và 8 tuần được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue. Sự biểu hiện các
marker bề mặt tế bào được kiểm tra bằng phương pháp Flow Cytometry. Thử nghiệm cho thấy tế bào tủy
răng chuột được bảo tốt trong thời gian 4 tuần theo quy trình đông lạnh -20oC/20 phút và bảo quản ở -80oC.
Sau khi giải đông, các tế bào có khả năng bám, tăng trưởng và biểu hiện các marker của tế bào gốc trung
mô CD73, CD90, CD105 và không biểu hiện các marker của tế bào máu CD19, CD34, CD45.
Từ khóa: tế bào gốc tủy răng, bảo quản tế bào, nuôi cấy tế bào
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa
trong mô sống, có khả năng trở thành các tế
bào chuyên biệt với các chức năng đặc trưng
[1]. Trong điều kiện in vivo hoặc in vitro, mỗi tế
bào gốc có thể tự làm mới với các tính năng
riêng biệt mới. Ngày nay, tế bào gốc được
tách và thu nhận từ rất nhiều nguồn (phôi giai
đoạn tiền làm tổ, thai, cơ thể trưởng thành,..).
Tủy răng là vùng tế bào giúp răng sống và duy
Địa chỉ liên hệ: Hoàng Đạo Bảo Trâm, Đại học Y Dược Tp
Hồ Chí Minh, 217 Hồng Bàng, Quận 5, TpHCM
email: hoangdaobaotram@gmail.com
Ngày nhận: 13/03/2013
Ngày được chấp thuận: 20/6/2013
20
trì chức năng. Tương tự như tủy xương, tủy
răng chứa các tế bào gốc trung mô. Ngoài ra,
tủy răng còn chứa tế bào tiền nguyên bào
ngà, tế bào tạo máu. Tế bào tủy răng là
nguyên liệu quan trọng cho những nghiên cứu
trong lĩnh vực tái tạo răng. Sau thành công
của Gronthos năm 2000 trong việc phân lập
và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng người [2], trên
thế giới đã có nhiều nghiên cứu tiếp tục phát
triển theo hướng này. Tại Việt Nam, một số
nghiên cứu đã cho kết quả nuôi cấy thành
công tế bào từ mảnh mô tủy răng người [3; 4].
Song song với việc phân lập tế bào gốc, kỹ
thuật bảo quản tế bào gốc động vật cũng phát
triển và mở ra một kỷ nguyên mới trong công
nghệ tế bào động vật. Với mục tiêu xuyên suốt
TCNCYH 83 (3) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
là lưu giữ tế bào trong trạng thái nguyên vẹn
Tế bào gốc tủy răng được thu nhận bằng
theo thời gian và có thể sử dụng sau này cho
các mục đích nghiên cứu hay điều trị, việc bảo
phương pháp tách với Trypsin/EDTA 0,25%;
0,02%. Tế bào gốc tủy răng được bảo quản
quản tế bào gốc động vật bao hàm nhiều ý
nghĩa thực tiễn: giảm thiểu sự biến đổi gen,
trong môi trường DMEM/F12 bổ sung DMSO
(Dimethyl Sulfoxide) 10%, FBS 20%. Tế bào
ngăn cản biệt hóa tế bào, giảm nguy cơ nhiễm
khuẩn và chết tế bào, giảm nhiễm chéo các
được đông lạnh theo 2 quy trình nhiệt:
Quy trình 1: mẫu lần lượt trải qua các giai
dòng tế bào, giảm nguy cơ biến đổi cấu trúc
đoạn ở điều kiện 4oC trong 20 phút và -20oC
và thay đổi hình thái, giảm chi phí nuôi cấy [1].
Về lý thuyết, tế bào gốc có khả năng phân
trong 30 phút, sau đó chuyển sang bảo quản
ở điều kiện -80oC;
chia vô hạn, song nhiều nghiên cứu cho thấy
khi các tế bào phân chia nhiều lần trong
Quy trình 2: mẫu trải giai đoạn ở điều kiện
-20oC trong 20 phút, sau đó chuyển sang bảo
những khoản thời gian dài, có thể xảy ra các
bất thường về nhiễm sắc thể. Trong khi đó, kỹ
quản ở điều kiện -80oC.
thuật phân lập các dòng tế bào gốc rất khó
tuần, 8 tuần, tế bào được tiến hành giải đông
trong môi trường nuôi cấy DMEM/F12 bổ sung
khăn, do vậy việc bảo quản tế bào gốc là rất
cần thiết nhằm phục vụ các mục đích nghiên
cứu và ứng dụng. Một số kỹ thuật bảo quản tế
bào gốc được áp dụng phổ biến là kỹ thuật
đông lạnh và kỹ thuật đông khô [1]. Nghiên
cứu này được tiến hành nhằm mục tiêu: bảo
quản tế bào gốc của tủy răng chuột áp dụng
Sau thời gian đông lạnh 1 ngày, 2 tuần, 4
FBS 20%. Tỷ lệ sống chết tế bào được xác
định bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue,
sự biểu hiện marker CD73, CD90, CD105,
CD19, CD34, CD45 được đánh giá bằng
phương pháp Flow Cytometry.
quy trình nhiệt.
III. KẾT QUẢ
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
Tỷ lệ tế bào sống khi giải đông và nuôi
cấy sau bảo quản
Tế bào gốc tủy răng chuột nhắt trắng Mus
musculus var. albino được thu nhận bằng
Tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản đông lạnh
phương pháp nuôi cấy mảnh mô tủy răng
trong môi trường DMEM/F12 (Sigma) bổ sung
1 ngày theo hai quy trình đều cao (> 90%),
không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
huyết thanh bào thai bò (FBS) 10% (Sigma),
(p > 0,05) (bảng 1). Các tế bào đông lạnh sau
Peniciline 100UI/ml (Sigma), Streptomycine
100 µg/ml (Sigma) ở điều kiện 37oC, CO2 5%.
khi giải đông được tiếp tục nuôi cấy trong môi
trường có bổ sung huyết thanh.
Bảng 1. Tỷ lệ tế bào sống khi giải đông sau bảo quản một ngày
Tỷ lệ tế bào sống
TCNCYH 83 (3) - 2013
Quy trình 1
4oC/20’
-20oC/30’
-80oC
Quy trình 2
95%
94%
97%
97%
97%
98%
-20oC/30’
-80oC
21
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Sau 1 ngày, quan sát được hiện tượng các tế bào bám trên bề mặt đĩa nuôi cấy, tế bào có
hình dạng tương tự tế bào trước khi đưa vào bảo quản đông lạnh (hình 1). Các tế bào này tiếp
tục tăng sinh trong những ngày nuôi cấy tiếp theo.
Hình 1. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược: tế bào giải đông sau bảo quản
đông lạnh một ngày (a: x40; b: x200)
Hình 2. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược: tế bào giải đông sau bảo quản
hai tuần (a: x40; b: x200)
Kết quả thu nhận được sau 1 ngày cho
thấy hai quy trình đông lạnh có hiệu quả
tương đương nhau. Tuy nhiên, quy trình 2
đơn giản hơn và tiết kiệm thời gian, do đó
được tiếp tục áp dụng và đánh giá với thời
gian bảo quản dài hơn, ở các thời điểm sau 2
tuần, 4 tuần và 8 tuần.
Tỷ lệ tế bào sống trung bình sau 2 tuần, 4
tuần, 8 tuần bảo quản lần lượt là 95,2%,
65,6%, 17,3%. Sau 2 tuần bảo quản đông
lệ tế bào sống giảm còn dưới 20% (bảng 2).
Kết quả cho thấy hiệu quả đông lạnh tế bào
giảm dần theo thời gian.
Sự biểu hiện marker bề mặt tế bào sau
giải đông
Sau khi giải đông và nuôi cấy tế bào đã
được bảo quản đông lạnh trong thời gian 4
tuần, tế bào bám trên bề mặt đĩa nuôi cấy sau
1 ngày, các tế bào có hình thái tương tự tế
lạnh ở -80 C, trung bình tỷ lệ tế bào sống
giảm từ 96,3% còn 95,2%. Sau 4 tuần, tỷ lệ tế
bào trước bảo quản, với dạng hình thoi, dài
bào sống trung bình là 65,6%. Sau 8 tuần, tỷ
tăng trưởng tốt, thời gian đạt được mật độ
o
22
100 - 120 µm, rộng 10 - 30 µm. Các tế bào
TCNCYH 83 (3) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
hợp dòng là 7 ngày. Khi tiến hành đánh giá
biểu hiện dương tính với các marker CD73
đặc tính của tế bào bằng phương pháp Flow
(98,08%), CD90 (91,3%), CD105 (98,76%) và
Cytometry, các tế bào có biểu hiện marker bề
âm tính với các marker CD19 (0,72%), CD34
mặt của tế bào gốc trung mô, tiêu chuẩn của
(0,56%), CD45 (7,65%), tương tự như các tế
Hiệp hội Quốc tế về tế bào gốc [5]. Tế bào có
bào nuôi cấy trước bảo quản đông lạnh (hình 3).
Bảng 2. Mật độ và tỷ lệ tế bào sống khi giải đông sau bảo quản 2, 4 và 8 tuần
Thời gian bảo quản
2 tuần
4 tuần
8 tuần
Mẫu
Mật độ tế bào (tb/ống)
Tỷ lệ tế bào sống
1
4,88 x 106
95,7%
2
4,57 x 106
93,2%
3
4,34 x 106
96,6%
1
4,39 x 106
62,9%
2
4,06 x 106
63,5%
3
4,25 x 106
70,3%
1
5,01 x 106
15%
2
4,16 x 106
20%
3
6
17%
5,19 x 10
Hình 3. Kết quả đánh giá marker bề mặt tế bào tủy răng chuột P4 sau bảo quản 4 tuần
TCNCYH 83 (3) - 2013
23
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Trong điều kiện nghiên cứu, chúng tôi
o
hiện tế bào sinh ung thư. Bảo quản nhằm lưu
nhận thấy, đối với quy trình bảo quản ở -80 C,
thời gian bảo quản tốt nhất là trong vòng
giữ tế bào và duy trì các đặc tính của tế bào
giúp chúng ta có thể có được một nguồn tế
4 tuần.
bào gốc có sẵn với số lượng lớn, phục vụ cho
nghiên cứu và các liệu pháp điều trị khi cần.
IV. BÀN LUẬN
Tế bào gốc trưởng thành là các tế bào
được thu nhận từ cơ thể trưởng thành. Tế bào
Bên cạnh đó, quá trình nuôi cấy tế bào đạt
đến giai đoạn tối ưu thường không dễ dàng,
thường bao qua nhiều giai đoạn như nuôi cấy
gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells MSC) là những tế bào có nguồn gốc trung
sơ cấp từ mảnh mô, nuôi cấy thứ cấp qua
nhiều thế hệ. Do đó, việc lưu trữ các dòng tế
mô có khả năng tự phân chia và biệt hóa
bào giúp tiết kiệm công sức, tiền bạc và thời
gian trong nghiên cứu.
thành nhiều dòng tế bào như tế bào tạo sụn,
xương, mỡ, cơ và mô liên kết đệm. Do đó,
MSC được xem là nguồn tế bào gốc nhiều
triển vọng cho các phương pháp điều trị bằng
liệu pháp tế bào. MSC được thu từ nhiều
nguồn như tủy xương, máu cuống rốn, mô
mỡ, răng... Trong đó, MSC từ răng là nguồn
tế bào tự thân được thu nhận dễ dàng, ít gây
xâm lấn bệnh nhân và có tiềm năng biệt hóa
thành các loại tế bào răng.
Quần thể tế bào gốc trong tủy răng rất ít;
xấp xỉ 1% tổng số tế bào và quá trình tích tuổi
làm giảm dần khả năng tham gia tạo mô và
làm lành thương của tế bào [6]. Trong các
nghiên cứu in vitro hay các nghiên cứu tiền
lâm sàng hoặc trong các ứng dụng lâm sàng,
lượng tế bào gốc cần sử dụng thường rất lớn.
Việc nuôi cấy cho tế bào gốc tủy răng tăng
sinh có vai trò rất cần thiết trong liệu pháp tế
bào; tuy nhiên, trong quá trình được nuôi cấy
và tăng sinh, các tế bào có nguy cơ mất tính
gốc, cảm ứng tự biệt hóa… Do đó, tế bào gốc
cần được nuôi cấy để đạt được số lượng tế
bào cần thiết trong khoảng thời gian ngắn
nhất với số lần cấy chuyền ít nhất. Đối với
những tế bào đã đạt tới thời điểm tối ưu nhằm
sử dụng trong những nghiên cứu sau hoặc
cho những ứng dụng lâm sàng, việc kéo dài
thời gian nuôi cấy sẽ làm gia tăng khả năng
mất tính gốc tế bào và gia tăng khả năng xuất
24
Trong nghiên cứu của Ding và cộng sự,
các tế bào nhú chóp răng (SCAP) đã được
bảo quản đông lạnh 6 tháng trong nitrogen
lỏng. Các tác giả nhận thấy rằng quy trình
đông lạnh đã thực hiện không ảnh hưởng tới
các đặc điểm hình thái, khả năng tăng sinh và
các đặc tính về kiểu hình của tế bào. Trong 4
loại dung dịch bảo quản bao gồm DMSO 1% +
trehalose 9% + FBS 90%, DMSO 4% + trehalose 6% + FBS 90%, DMSO 8% + trehalose
2% + FBS 90%, DMSO 10% + FBS 90%,
dung dịch DMSO 4% + trehalose 6% + FBS
90% là loại dung dịch bảo quản ưu việt nhất,
cho mức độ tế bào sống cao, nâng khả năng
biệt hóa và giảm tác hại của DMSO [7,8].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng
nuôi cấy lại tế bào gốc tủy răng sau bảo quản,
các tế bào này duy trì được các đặc tính hình
thái chức năng và khả năng biệt hóa đa dòng
(m ultilineage differentiation) [9; 10; 11].
Nghiên cứu này hướng tới thiết lập quy trình
đông lạnh, giải đông đơn giản, phù hợp với
điều kiện của hầu hết các đơn vị nghiên cứu
và đơn vị lâm sàng. Đối với quá trình bảo
quản, trong môi trường đông lạnh, quy trình
hạ nhiệt, quy trình giải đông đóng vai trò rất
quan trọng trong tính chất tế bào. Môi trường
đông lạnh được sử dụng là môi trường DMSO
10%. DMSO (Dimethyl Sulfoxide) có những
TCNCYH 83 (3) - 2013