Xem mẫu
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC BẠC LIÊU
KHOA NÔNG NGHIỆP - MÔN DI TRUYỀN ĐẠI CƯƠNG
LỚP 2NT1 – TỔ 1
Báo cáo chuyên đề
KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP ADN
CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP ADN LÀ GÌ?
Khái niệm:
ADN tái tổ hợp được dùng để chỉ các phân tử
ADN được tạo ra từ hai hay nhiều phân đoạn ADN
xuất xứ từ các nguồn gốc khác nhau.
Kỹ thuật tái tổ hợp ADN còn được gọi là tạo
dòng phân tử (molecular cloning)
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Kỹ thuật tái tổ hợp ADN được thực hiện như thế nào?
Bao gồm 6 bước:
1. Hai loại ADN được ly trích: ADN có chứa gen cần tạo dòng và
plasmid của vi khuẩn đóng vai trò của một vector.
2. Cả ADN và plasmid được xử lý với cùng một loại enzyme giới hạn.
Enzyme giới hạn tạo ra đầu dính ở plasmid và ADN cần tạo dòng.
3. Đoạn ADN cần tạo dòng được trộn với plasmid.
4. Nhờ enzyme ligase, các base ở đầu dính của plasmid sẽ gắn với
các base bổ sung ở đầu dính của ADN tạo thành plasmid tái tổ hợp.
5. Plasmid tái tổ hợp được chèn vào tế bào vi khuẩn.
6. Sự tạo dòng gen. Vi khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp sẽ sinh sản.
Khi vi khuẩn tạo thành một dòng tế bào, tất cả các gen của plasmid tái
tổ hợp cũng được tạo dòng.
Hình 1: tr49
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- NỘI DUNG:
Các enzyme giới hạn
Phương pháp điện di
Các vector chuyển gen
Sự tạo ADN tái tổ hợp
Chèn ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Các enzyme giới hạn: (retriction enzyme)
Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận
biết những đoạn trình tự ADN nhất định và cắt
ADN ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận.
Có 2 đặc tính:
- Không cắt các liên kết photphodieste
ở đầu tận cùng, thay vào đó là cắt bên trong phân
tử ADN.
- Chỉ cắt khi nhận ra các trình tự đặc
thù (trình tự nhận biết) bao gồm 4 đến 8 nucleotide
( thường là 4 hay 6).
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- 1. Hiện tượng giới hạn:
Các phage xâm nhiễm tế bào vi khuẩn
và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn.
Khi số lượng phage tăng lên hàng triệu bản sao,
chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, trong
một số trường hợp tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn
và phage cũng không sinh sôi. Nguyên nhân là do
ADN của phage bị một hệ thống bảo vệ của vi
khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập. Đây chính là
hiện tượng giới hạn.
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Gồm 2 loại enzyme:
Các enzyme giới hạn cắt ADN của phage
ở những vị trí chuyên biệt, tạo thành những trình tự
có kích thước xác định.
Methylase là enzyme có vai trò gắn nhóm
methyl (-CH3) vào base A hoặc C ở vị trí cắt của
các enzyme giới hạn. Khi A và C được methyl hoá,
enzyme giới hạn không còn nhận biết được vị trí
cắt. Nhờ cơ chế này mà ADN của vi khuẩn không
bị phá huỷ bởi chính các enzyme giới hạn của
chúng.
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- 2. Tên gọi:
Nguyên tắc:
- Chữ thứ nhất viết hoa là chữ đầu tên của giống vi khuẩn từ
đó enzyme giới hạn được ly trích.
- Chữ thứ hai và thứ ba không viết hoa, ứng với tên loài của vi
khuẩn nói trên.
- Chữ thứ tư viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng (nếu có).
- Chữ số La mã chỉ thứ tự enzyme giới hạn được phát hiện
( trong trường hợp nhiều enzyme giới hạn cùng được tìm th ấy ở một
loài vi khuẩn).
☺Ví dụ tr50: enzyme EcoRI
E = giống Escherichia
co = loài coli
R = chủng RYI3
I = enzyme đầu tiên được tìm thấy ở E.coli
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- 3. Phân loại:
Có 3 nhóm chính:
- Loại I: Khi enzyme nhận biết được trình tự, nó sẽ di chuyển
trên ADN đến cách đó khoảng 1000 -5000nucleotide.
- Loại II: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.
- Loại III: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ADN ở vị trí cách
đó khoảng 20 nucleotide.
Enzyme giới hạn loại II được sử dụng chủ yếu vì nó cắt tại vị trí giới
hạn. Thường cắt ở trình tự chiều xuôi – ngược như nhau. VD: EcoRI
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Bảng 1: Nguồn, trình tự nhận biết và vị trí cắt của một số enzyme giới hạn. (tr51)
NGUỒN TRÌNH TỰ NHẬN BIẾT VÀ VỊ TRÍ CẮT
ENZYME
5’ ------- A G C T ------ 3’
Alu I Athrobacter lutues
3’ ------- T C G A ------ 5’
5’ ------- T G G C C A ------ 3’
Bal I Brevibaterium
3’ ------- A C C G G T ------ 5’
5’ ------- G G A T C C ------ 3’
Bam H I Bacillus amyloliquefaciens
3’ ------- C C T A G G ------ 5’
5’ ------- G A A T T C ------ 3’
Eco RI Escherichia coli
3’ ------- C T T A A G ------ 5’
5’ ------- G G C C ------ 3’
Hae III Haemophylus aegypticus
3’ ------- C C G G ------ 5’
5’ ------- A A G C T T ------ 3’
Hind III Haemophylus influenzae
3’ ------- T T C G A A ------ 5’
5’ ------- G A T C ------ 3’
Sau 3A Staphylococcus aureus
3’ ------- C T A G------ 5’
5’ ------- T C G A ------ 3’
Taq I Thermus aquaticus
3’ ------- A G C T ------ 5’
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Phương pháp điện di: (electrophoresis)
Phương pháp điện di là quá trình phân tách m ột h ỗn
hợp các phân tử ADN nhờ một chất nền cố định (gel) trong
một điện trường.
Điện di ADN:
- Ở độ pH gần trung tính, ADN tích điện âm nên khi
chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển về điện
dương của điện trường.
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Điện di ADN
- Bản gel hoạt động như một giá thể phân tách các
đoạn ADN.
- Các lỗ được tạo ra trong bản gel được xem như các
giếng chứa dung dich ADN.
- Hai loại gel thường được sử dụng trong nghiên cứu
ADN là gel polyacrylamide và gel agarose
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Gel polyacrylamide và gel agarose:
Agarose:
Có khả năng phân tách các phân
tử AND có chiều dài giữa 70 cặp và
10.000 cặp nucleotide. Không độc
Polyacrylamide:
Có độ phân giả cao hơn song chỉ
phân tách được các đoạn AND có kích
thước từ 6 cặp đến 1000 cặp nucleotide.
Rất độc
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Điện di ADN
- Dung dịch ADN chứa hỗn
hợp các đoạn ADN có
kích thước khác nhau
được đổ vào các giếng
trong bản gel.
- Chất nền gel hoạt động
như một tấm sàng
(sieve). Các phân tử AND
lớn đi qua các lỗ trong
bản gel khó khăn hơn và
sẽ bị chậm lại so với các
phân tử AND nhỏ.
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Điện di ADN
Tốc độ di chuyển phụ thuộc bào kích thước của
đoạn ADN, điện thế, thành phần dung dịch đệm, nồng
độ của gel và nhiệt độ.
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Phương pháp điện di: (electrophoresis)
Các đoạn ADN trong gel sẽ được hiện hình dưới tia tử
ngoại nhờ một hoá chất có tên là ethidium bromide. Thuốc thử
này tạo liên kết nhuộm với các base nitơ và chúng sẽ phát
huỳnh quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (bước sóng 260
nm), các đoạn ADN hiện hình dưới dạng những vạch màu đỏ
cam.
Ngoài ra thì còn một phương pháp khác để hiện hình các
đoạn ADN trên bản gel điện di đó là phương pháp nhuộm bạc.
Phương pháp nhuộm bạc:
Bản gel sau điện di được ngâm vào dung dich AgNO3,
ADN sẽ tương tác với AgNO3, khi bổ sung formaldehyt ở pH
kiềm, ion bạc chuyển thành bạc nguyên tử, tạo các hạt bạc
kết tủa có màu xám, có thể phát hiện dễ dàng.
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Điện di:
- Gel được đặc trên giá đỡ, cho
vào hộp điện di có dung dich đệm.
- Dung dịch ADN được cho vào
các giếng.
- Cho điện trường chạy qua gel.
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Các đoạn ADN sau khi điện di được nhuôm ethidium bromide.
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Các vector chuyển gen:
Muốn chuyển được gen mong muốn từ thể cho
sang thể nhận hoặc tách dòng gen, điều cơ bản là cần
phải có vật chuyển gen (vector chuyển gen).
Vector chuyển gen là phân tử ADN có khả năng
mang được gen cần thiết, thường có dạng vòng và có
một số đặc tính sau:
- Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication)
để tự sao chép mà tồn tại độc lập trong tế bào.
- Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzyme giới
hạn rồi để hỡ tạo nơi lắp ráo cho các đoạn gen lạ.
- Cos trình tự khởi điểm (promoter).
- Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát
hiện nhận biết chúng trong tế bào chủ nhận. Thông
thường đó là tính kháng với kháng sinh giúp vi khu ẩn có
mang vector sống được trên môi trường có kháng sinh.
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
- Các vector chuyển gen:
Có nhiều loại vector: plasmid, thực khuẩn thể, cosmid, YAC…
Loại vector được chọn sử dụng tùy thuộc vào kích thước của đoạn
ADN cần tạo dòng và mục đích tạo dòng.
Plasmid là những đoạn ADN ngắn (2-5 kb), dạngv òng, mạch
đôi, nằm ngoài NST, sao chép độc lập với sự sao chép NST của vi
khuẩn. Có thể nhận các ADN tạo dòng tới 10 kb.
Thực khuẩn thể (phage) là virus xâm nhiễm và làm phân giải
vi khuẩn. Phần lớn các phage được dùng làm vector hiện nay đều
λ .Việc dùng phage làm vector có nhiều ưu
bắt nguồn từ phage
điểm hơn so với các vector plasmid vì:
- Hiệu quả xâm nhiễm của thực khuẩn thể vào tế bào cao hơn
nhiều so với chuyển plasmid vào tế bào vi khuẩn.
- Kích thước đoạn ADN mà vector có thể tiếp nhận lớn hơn
(20 kb)
LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
nguon tai.lieu . vn