Xem mẫu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
Nghiên cứu Y học
PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DNA TI THỂ TRONG BỆNH LÝ THẦN KINH
THỊ GIÁC DI TRUYỀN LEBER BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN
Hoàng Hiếu Ngọc*, Phạm Hùng Vân**, Huỳnh Viết Lộc**
TÓMTẮT
Đặt vấn đề: Bệnh thần kinh thị giác di truyền LEBER là một rối loạn di truyền ti thể gây mất thị lực hoàn
toàn mà không gây đau. Bệnh do những đột biến điểm trong DNA ti thể làm thay đổi protein thuộc chuỗi vận
chuyển điện tử thuộc ti thể.
Mục tiêu: Phát hiện các điểm đột biến trong DNA ti thể thường gặp như G11778A, T14484C, G3460A
trong DNA ti thể của người bằng cách giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR.
Phương pháp: DNA của những bệnh nhân bị giảm hoặc mất thị lực hoàn toàn được tách chiết từ mẫu máu
toàn phần. Sau đó, dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại từng vùng gen có chứa các điểm đột biến thường gặp. Sản
phẩm khuếch đại sau đó được giải trình tự trực tiếp bằng bộ kit BigDye®Terminator. Phân tích kết quả giải trình
tự bằng cách so sánh với trình tự DNA ti thể chuẩn để phát hiện điểm đột biến.
Kết quả: Từ tháng 08/2011 đến tháng 12/2012 chúng tôi thu thập được 37 ca nghi ngờ bệnh LHON. Trong
đó phát hiện được 18 trường hợp có đột biến DNA ti thể, 14 trường hợp mang đột biến G11778A là đột biến
nặng và thường gặp nhất, 8 trường hợp còn lại mang đột biến T14484C.
Kết luận: Bằng việc ứng dụng kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, chúng tôi đã
xây dựng thành công qui trình xét nghiệm chẩn đoán đột biến DNA ti thể trong bệnh LHON; đồng thời mở ra
một hướng nghiên cứu mới đối với các bệnh di truyền theo DNA ti thể.
Từ khóa: bệnh Lebel, đột biến DNA ti thể, LHON, PCR
ABSTRACT
DETECT MUTATION IN MITOCHONDRIAL DNA IN PATIENTS WITH LEBER’S HEREDITARY
OPTIC NEUROPATHY BY GENE SEQUENCING
Hoang Hieu Ngoc, Pham Hung Van, Huynh Viet Loc
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 - 2014: 81 - 85
Background: Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) is a mitochondrial inherited disorder that causes
completely loss vision without pain in healthy adults. This disease caused by point mutations in human
mitochondrial DNA that lead to change protein in the electron transfer chain of the mitochondria.
Objective: Detecting highly prevalent mutation points such as G11778A, T14484C, G3460A in human
mitochondrial DNA by direct sequencing PCR products.
Method: Patients’ DNA were extracted from whole blood samples and then perform PCR reactions of which
primers designed to amplify DNA fragments that include mitochondrial point mutations. Amplified products will
be sequenced directly by using BigDye®Terminator kit. Analyse results to detect point mutations of patients.
Result: From 08/2011 to 12/2012, we have 37 patients who loss vision without pain. There are 18 cases
which have point mutations; 14 cases have severe point mutation of G11778A and the last four cases have point
* Bộ môn Hoá Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TPHCM ,
** Công ty Nam Khoa
Tác giả liên lạc: ThS. BS. Hoàng Hiếu Ngọc ĐT: 0988937406
Email: hoanghieungoc@yahoo.com
Mắt
81
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
mutation of T14484C.
Conclusion: By using PCR and gene sequencing, we build up the examination to detect point mutations in
LHON successfully. Since, we open up the new trend of research mitochondrial inherited disorders in Vietnam.
Keywords: Lebel, mutations in mitochondrial DNA, LHON, PCR.
chung một cách chính xác và nhanh chóng; từ đó
ĐẶT VẤNĐỀ
mở ra thêm những hướng nghiên cứu mới về
Bệnh thần kinh thị giác di truyền LEBER
bệnh di truyền tại Việt Nam.
được xác định về mặt lâm sàng là do teo thần
ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
kinh thị giác gây mất thị lực trung tâm(7). Bệnh
thường xuất hiện ở nam trong độ tuổi 20 –
Mẫu bệnh phẩm
40(7,8) nhưng cũng có thể xuất hiện ở độ tuổi từ
Mẫu máu toàn phần chống đông bằng
5 đến 65(8,2). Triệu chứng bệnh thường gặp là
EDTA của những bệnh nhân nghi ngờ bệnh
mất thị lực trung tâm cấp hoặc bán cấp ở
LHON hoặc cần được chẩn đoán phân biệt với
người trẻ đôi khi các triệu chứng về thần kinh,
các bệnh gây xơ hóa võng mạc khác.
tim mạch và cơ xương cũng đi kèm. Nam giới
Trích biệt DNA bạch cầu từ máu toàn phần
mắc bệnh chiếm đến hơn 80% các trường hợp
chống đông bằng EDTA
bệnh(2). Nguyên nhân gây bệnh được xác định
Chúng tôi sử dụng bộ tách chiết DNA bằng
là do đột biến DNA của ti thể thuộc các vùng
kit thương mại QIAGEN DNA Blood Mini kit.
gen ND (mitochondrial encoded NADH
Phương pháp tách chiết DNA được thực hiện
dehydrogenase genes) là mtND1, mtND2,
theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lấy 200 µl
mtND3, mtND4, mtND4L, mtND5, mtND6
máu toàn phần cho vào 1 tube Eppendorf, lần
gây thay đổi các protein thuộc phức hợp I của
lượt cho vào tube 20 µl proteinase K và 200 µl
chuỗi hô hấp tế bào(9). Các nghiên cứu về bệnh
AL buffer. Lắc trộn mẫu thật kỹ trong 15 giây,
LHON trên thế giới cho thấy 95% các ca bệnh
sau đó đem ủ ở 560C trong 10 phút. Thêm vào
đều mang một trong ba điểm đột biến
200 µl ethanol 100%, lắc trộn thật đều rồi cho
G11778A, T14484C, G3460A; trong đó
toàn bộ hỗn hợp vào cột silica được cung cấp của
G11778A chiếm tỉ lệ cao nhất và bệnh nhân
hãng Qiagen. Ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, đổ
mang đột biến này sẽ có khả năng tiến triển
bỏ dịch lọc và tube thu thập, giữ lại cột. Đặt cột
bệnh rất nặng và không hồi phục. Cả 3 điểm
vào tube thu thập mới, rửa cột lần thứ nhất bằng
đột biến này đều có liên quan đến các gen ND
(4).
cách cho 500 µl dung dịch rửa 1 có bổ sung
mã hóa protein cho phức hợp
ethanol 100% (theo hướng dẫn của nhà sản xuất)
Nhiều nghiên cứu dịch tễ về bệnh LHON
vào cột và ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, đổ bỏ
trên thế giới đã cho thấy tỉ lệ bệnh LHON là rất
dịch rửa và tube thu thập, giữ lại cột, đặt vào
khác nhau tùy dân số chẳng hạn ở Phần Lan là
một tube thu thập mới. Rửa cột lần thứ nhì với
1:50,000(2) trong khi ở Anh là 1:25,000(4). Tại Việt
500 µl dung dịch rửa 2 cũng có bổ sung ethanol
Nam chưa có nghiên cứu khảo sát tỉ lệ bệnh
100% (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) và ly
LHON trong dân số và các kỹ thuật sinh học
tâm 14000 rpm trong 3 phút. Đổ bỏ dịch rửa 2
phân tử vẫn chưa được triển khai để nghiên cứu
cùng với tube thu thập. Đặt cột vào một tube thu
về căn bệnh này. Chính vì vậy, chúng tôi xây
thập khác, quay ly tâm 14000 rpm trong 1 phút
dựng đề tài này với mục đích phát hiện đột biến
để làm khô cột. Cuối cùng, đặt cột vào một tube
DNA ti thể gây mất thị lực do teo thần kinh thị
Eppendorf tinh sạch, cho 200 µl dung dịch thoi
đồng thời cung cấp cho các bác sĩ lâm sàng Việt
DNA, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút, ly tâm
Nam có được một công cụ chẩn đoán bệnh
14000 rpm trong 2 phút. Dịch cuối cùng thu
LHON nói riêng và các bệnh di truyền ti thể nói
82
Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
được chính là DNA bạch cầu được hòa tan trong
đệm thoi DNA, có thể dùng để thực hiện phản
ứng PCR.
Khuếch đại các đoạn gen trong DNA ti thể có
chứa vị trí đột biến
Chúng tôi sử dụng các loại hóa chất sau:
(1) PCR master mix 2X của công ty Nam Khoa
(được pha sẵn từ những nguồn nguyên liệu
mua từ các hãng BioRad, Merck, Sigma,
Proligo); (2) MgCl2 50mM do BioRad sản xuất;
(3) UNG của Invitrogen; (4) dUTP của
Promega; (5) Các cặp mồi được thiết kế đặc
hiệu trên các vùng gen có chứa điểm đột biến
của ti thể lần lượt là 3460F/R phát hiện đột
biến G3460A (gen MT-ND1), 11778F/R phát
hiện đột biến G11778A (gen MT-ND4),
10663F/R phát hiện đột biến T10663C (gen
MT-ND4L), 14484F/R phát hiện đột biến
T14484C (gen MT-ND6), 9804F/R phát hiện
đột biến G9804A, 15257F/R phát hiện đột biến
G15257A. Như vậy, với từng mẫu bệnh phẩm,
chúng tôi thực hiện 6 phản ứng PCR. Sản
phẩm khuếch đại lần lượt có kích thước như
sau: 417 bp, 297 bp, 410 bp, 210 bp, 470 bp, 250
bp. Phương pháp khuếch đại DNA được thực
hiện trong những tube PCR 0.2 ml với thể tích
dung dịch phản ứng là 50 µl bao gồm 2.5U
Taq Polymerase, 3,5mM MgCl2, 50 µM mồi
xuôi, 50 µM mồi ngược, UNG 0.1U, dNTP
25mM, dUTP 20mM. Phản ứng được thực hiện
trong máy luân nhiệt MyCycler của BioRad có
buồng ủ nhiệt 96 giếng với chu kỳ nhiệt như
sau: 1 chu kỳ 40oC trong 10 phút, 1 chu kỳ
95oC trong 5 phút, 40 chu kỳ 950C 30 giây –
55oC 30 giây – 72oC 1 phút, 1 chu kỳ 72oC 10
phút. Sản phẩm PCR được phát hiện trên gel
agarose 2%.
Giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại
từ các vùng gen ti thể
Sau khi xác định có sự hiện diện của các sản
phẩm khuếch đại, chúng tôi thực hiện tinh sạch
sản phẩm PCR bằng cách sử dụng enzym tinh
sạch Exonuclease (IllustraTM) và Alkaline
Mắt
Nghiên cứu Y học
Phosphatase (IllustraTM). Sản phẩm PCR sau
khi tinh sạch sẽ được lấy ra 5 µl điện di gel
agarose để kiểm tra sự hiện diện của băng DNA
và sau đó xác định hàm lượng DNA bằng máy
BioPhotometer của hãng Eppendorf. Sau đó,
chúng tôi thực hiện phản ứng giải trình tự bằng
cách sử dụng bộ thuốc thử của hãng ABI là
BigDye®Terminator v3.1 Cycler Sequencing Kit
với các mồi xuôi hoặc mồi ngược của chúng tôi
thiết kế. Sản phẩm giải trình tự được làm tủa và
tinh sạch bằng phương pháp tủa với ethanol.
Cuối cùng thực hiện điện di mao quản sản phẩm
giải trình tự trên máy ABI3130XL. Kết quả giải
trình tự sau đó sẽ được so sánh với trình tự DNA
chuẩn của ti thể đã được công bố trên ngân hàng
gen NBCI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
hoặc trang web www.mitomap.org từ đó phát
hiện ra điểm đột biến trên gen ti thể của bệnh
nhân bằng phần mềm SeqScape của hãng ABI.
KẾT QUẢ
Trong thời gian từ tháng 08/2011 đến tháng
12/2012, chúng tôi thu thập được 37 mẫu máu
bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh LHON hoặc cần
chẩn đoán phân biệt bệnh LHON với các bệnh
gây xơ hóa võng mạc khác.
Hình 1: Kết quả điện di trên gel agarose 2% sản
phẩm PCR khuếch đại 6 vùng gen ti thể có chứa các
điểm đột biến tương ứng. (A) là đoạn khuếch đại chứa
vị trí nucleotid 3460, (B) chứa vị trí 9804, (C) chứa vị
trí 10663, (D) chứa vị trí 11778, (E) chứa vị trí
83
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
14484, (F) chứa vị trí 15257
(A)
(B)
Hình 2: Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự DNA ti thể chuẩn của người. (A) mẫu giải trình tự có
điểm đột biến T14484C. (B) mẫu giải trình tự có điểm đột biến G11778A.
trình tự DNA chuẩn của ti thể bằng phần mềm
Sau khi ly trích DNA bạch cầu từ những
SeqScape của hãng ABI.
mẫu máu toàn phần, nồng độ DNA tách chiết
đo được nằm trong khoảng 30 – 60 ng/µl với
độ tinh sạch OD 260/280 từ 1.8 đến 2.
Nồng độ và độ tinh sạch như trên đảm bảo
cho phản ứng PCR được thực hiện tốt.
Những sản phẩm PCR này sau đó được
tiến hành giải trình tự trên hệ thống ABI
3130XL. Kết quả giải trình tự được so sánh với
84
Khảo sát trên 37 mẫu máu của bệnh nhân
nghi ngờ bệnh LHON, chúng tôi nhận thấy có 18
trường hợp mang đột biến. Trong đó, 14 mẫu
mang đột biến G11778A và 4 trường hợp còn lại
mang đột biến T14484C.
Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
KẾT LUẬN
Kỹ thuật sinh học sinh tử nói chung và kỹ
thuật giải trình tự nói riêng giờ đây trở thành
một công cụ hữu ích trong việc chẩn đoán xác
định các bệnh lý di truyền nói chung và bệnh
ty thể nói riêng, trong có đó bệnh di truyền
thần kinh thị giác Leber. Bằng việc ứng dụng
kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự trực tiếp
sản phẩm PCR, chúng tôi đã xây dựng thành
công qui trình xét nghiệm chẩn đoán đột biến
DNA ti thể trong bệnh LHON. Điều này sẽ
giúp ích rất nhiều cho các bác sĩ lâm sàng ở
Việt Nam trong việc chẩn đoán bệnh LHON,
đồng thời bệnh nhân không phải tốn công ra
nước ngoài để làm xét nghiệm này. Ưu điểm
của kỹ thuật giải trình tự là có thể khảo sát
toàn bộ trình tự trong một vùng gen mong
muốn, từ đó so sánh với trình tự gen chuẩn để
tìm ra điểm đột biến. Đây là một lợi thế so với
việc dùng men cắt giới hạn vốn dĩ có thể gây
sai sót nếu xuất hiện đột biến nằm ngoài vị trí
cần tìm làm thay đổi khả năng cắt hoặc không
cắt của men cắt tại vị trí đột biến.
Trong số 18 trường hợp phát hiện đột biến
(48,7%), 14 ca mang đột biến tại điểm
G11778A là điểm đột biến chiếm tỉ lệ cao nhất
trong bệnh LHON (77,78%) và khi bệnh mắt
đã tiến triển thì khả năng hồi phục là rất thấp.
Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi cũng
cho thấy tỉ lệ mang đột biến này chiếm đa số
và phù hợp với y văn trên thế giới. Chính vì
thế, cùng với việc xây dựng thành công kỹ
thuật sinh học phân tử dùng trong chẩn đoán
bệnh LHON, chúng tôi cũng rất mong muốn
mở ra một nghiên cứu lớn hơn nhằm tầm soát
bệnh LHON trong dân số Việt Nam đồng thời
Mắt
Nghiên cứu Y học
tư vấn di truyền cho những người mang gen
bệnh để định hướng nghề nghiệp cũng như
chế độ ăn uống nhằm hạn chế sự phát triển
của bệnh trong tương lai.
TÀI LIỆU THAMKHẢO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Hsu TK, Wang AG, Yen MY, Liu JH (2013). “Leber's
hereditary optic neuropathy masquerading as optic neuritis
with spontaneous visual recovery”. Clin Exp Optom. doi:
10.1111/cxo.12100.
Huoponen K (2001). “Leber hereditary optic neuropathy:
clinical and molecular genetic findings”. Neurogenetics 3: 119
– 125.
Istikharah R, et al (2013).”Identification of the variants in
PARL, the nuclear modifier gene, responsible for the
expression of LHON patients in Thailand”. Exp Eye Res. 116:
55-57.
Johns DR et al (1993). “Pitfalls in the molecular genetic
diagnosis of Leber’s hereditary optic neuropathy. Am”. J.
Hum. Genet, 53: 916 – 920.
Mackey DA, Oostra RJ, Rosenberg T, et al (1996). “Primary
pathogenic mtDNA mutations in multigeneration pedigrees
with Leber hereditary optic neuropathy”. Am J Hum Genet;
59:481 – 485.
Man PY, Turnbull DM, Chinnery PF (2002). “Leber hereditary
optic neuropathy”. J Med Genet; 39:162 – 169.
Oostra RJ, et al (1993). “Mitochondrial DNA analysis as a
diagnostic tool in singleton cases of Leber’s hereditary optic
neuropathy”. Ophthalmic Paediatrics and Genetic, Vol. 14,
No3, pp. 109 – 115.
Oostra RJ, et al (1994). “Leber’s hereditary optic neuropathy:
correlations between mitochondrial genotype and visual
outcome”. J Med Genet; 31: 280 – 286.
Spruijt L (2008). Leber’s hereditary optic neuropathy – an
interaction between two genomes. Maastricht University,
Netherlands.
Ziccardi L, Sadun F, et al (2013). “Retinal function and neural
conduction along the visual pathways in affected and
unaffected carriers with Leber's hereditary optic neuropathy”.
Invest Ophthalmol Vis Sci.2013.
Ngày nhận bài báo:01/11/2013
Ngày phản biện nhận xét bài báo:26/11/2013
Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014
85
nguon tai.lieu . vn
Nghiên cứu Y học
PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DNA TI THỂ TRONG BỆNH LÝ THẦN KINH
THỊ GIÁC DI TRUYỀN LEBER BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN
Hoàng Hiếu Ngọc*, Phạm Hùng Vân**, Huỳnh Viết Lộc**
TÓMTẮT
Đặt vấn đề: Bệnh thần kinh thị giác di truyền LEBER là một rối loạn di truyền ti thể gây mất thị lực hoàn
toàn mà không gây đau. Bệnh do những đột biến điểm trong DNA ti thể làm thay đổi protein thuộc chuỗi vận
chuyển điện tử thuộc ti thể.
Mục tiêu: Phát hiện các điểm đột biến trong DNA ti thể thường gặp như G11778A, T14484C, G3460A
trong DNA ti thể của người bằng cách giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR.
Phương pháp: DNA của những bệnh nhân bị giảm hoặc mất thị lực hoàn toàn được tách chiết từ mẫu máu
toàn phần. Sau đó, dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại từng vùng gen có chứa các điểm đột biến thường gặp. Sản
phẩm khuếch đại sau đó được giải trình tự trực tiếp bằng bộ kit BigDye®Terminator. Phân tích kết quả giải trình
tự bằng cách so sánh với trình tự DNA ti thể chuẩn để phát hiện điểm đột biến.
Kết quả: Từ tháng 08/2011 đến tháng 12/2012 chúng tôi thu thập được 37 ca nghi ngờ bệnh LHON. Trong
đó phát hiện được 18 trường hợp có đột biến DNA ti thể, 14 trường hợp mang đột biến G11778A là đột biến
nặng và thường gặp nhất, 8 trường hợp còn lại mang đột biến T14484C.
Kết luận: Bằng việc ứng dụng kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, chúng tôi đã
xây dựng thành công qui trình xét nghiệm chẩn đoán đột biến DNA ti thể trong bệnh LHON; đồng thời mở ra
một hướng nghiên cứu mới đối với các bệnh di truyền theo DNA ti thể.
Từ khóa: bệnh Lebel, đột biến DNA ti thể, LHON, PCR
ABSTRACT
DETECT MUTATION IN MITOCHONDRIAL DNA IN PATIENTS WITH LEBER’S HEREDITARY
OPTIC NEUROPATHY BY GENE SEQUENCING
Hoang Hieu Ngoc, Pham Hung Van, Huynh Viet Loc
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 - 2014: 81 - 85
Background: Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) is a mitochondrial inherited disorder that causes
completely loss vision without pain in healthy adults. This disease caused by point mutations in human
mitochondrial DNA that lead to change protein in the electron transfer chain of the mitochondria.
Objective: Detecting highly prevalent mutation points such as G11778A, T14484C, G3460A in human
mitochondrial DNA by direct sequencing PCR products.
Method: Patients’ DNA were extracted from whole blood samples and then perform PCR reactions of which
primers designed to amplify DNA fragments that include mitochondrial point mutations. Amplified products will
be sequenced directly by using BigDye®Terminator kit. Analyse results to detect point mutations of patients.
Result: From 08/2011 to 12/2012, we have 37 patients who loss vision without pain. There are 18 cases
which have point mutations; 14 cases have severe point mutation of G11778A and the last four cases have point
* Bộ môn Hoá Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TPHCM ,
** Công ty Nam Khoa
Tác giả liên lạc: ThS. BS. Hoàng Hiếu Ngọc ĐT: 0988937406
Email: hoanghieungoc@yahoo.com
Mắt
81
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
mutation of T14484C.
Conclusion: By using PCR and gene sequencing, we build up the examination to detect point mutations in
LHON successfully. Since, we open up the new trend of research mitochondrial inherited disorders in Vietnam.
Keywords: Lebel, mutations in mitochondrial DNA, LHON, PCR.
chung một cách chính xác và nhanh chóng; từ đó
ĐẶT VẤNĐỀ
mở ra thêm những hướng nghiên cứu mới về
Bệnh thần kinh thị giác di truyền LEBER
bệnh di truyền tại Việt Nam.
được xác định về mặt lâm sàng là do teo thần
ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
kinh thị giác gây mất thị lực trung tâm(7). Bệnh
thường xuất hiện ở nam trong độ tuổi 20 –
Mẫu bệnh phẩm
40(7,8) nhưng cũng có thể xuất hiện ở độ tuổi từ
Mẫu máu toàn phần chống đông bằng
5 đến 65(8,2). Triệu chứng bệnh thường gặp là
EDTA của những bệnh nhân nghi ngờ bệnh
mất thị lực trung tâm cấp hoặc bán cấp ở
LHON hoặc cần được chẩn đoán phân biệt với
người trẻ đôi khi các triệu chứng về thần kinh,
các bệnh gây xơ hóa võng mạc khác.
tim mạch và cơ xương cũng đi kèm. Nam giới
Trích biệt DNA bạch cầu từ máu toàn phần
mắc bệnh chiếm đến hơn 80% các trường hợp
chống đông bằng EDTA
bệnh(2). Nguyên nhân gây bệnh được xác định
Chúng tôi sử dụng bộ tách chiết DNA bằng
là do đột biến DNA của ti thể thuộc các vùng
kit thương mại QIAGEN DNA Blood Mini kit.
gen ND (mitochondrial encoded NADH
Phương pháp tách chiết DNA được thực hiện
dehydrogenase genes) là mtND1, mtND2,
theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lấy 200 µl
mtND3, mtND4, mtND4L, mtND5, mtND6
máu toàn phần cho vào 1 tube Eppendorf, lần
gây thay đổi các protein thuộc phức hợp I của
lượt cho vào tube 20 µl proteinase K và 200 µl
chuỗi hô hấp tế bào(9). Các nghiên cứu về bệnh
AL buffer. Lắc trộn mẫu thật kỹ trong 15 giây,
LHON trên thế giới cho thấy 95% các ca bệnh
sau đó đem ủ ở 560C trong 10 phút. Thêm vào
đều mang một trong ba điểm đột biến
200 µl ethanol 100%, lắc trộn thật đều rồi cho
G11778A, T14484C, G3460A; trong đó
toàn bộ hỗn hợp vào cột silica được cung cấp của
G11778A chiếm tỉ lệ cao nhất và bệnh nhân
hãng Qiagen. Ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, đổ
mang đột biến này sẽ có khả năng tiến triển
bỏ dịch lọc và tube thu thập, giữ lại cột. Đặt cột
bệnh rất nặng và không hồi phục. Cả 3 điểm
vào tube thu thập mới, rửa cột lần thứ nhất bằng
đột biến này đều có liên quan đến các gen ND
(4).
cách cho 500 µl dung dịch rửa 1 có bổ sung
mã hóa protein cho phức hợp
ethanol 100% (theo hướng dẫn của nhà sản xuất)
Nhiều nghiên cứu dịch tễ về bệnh LHON
vào cột và ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, đổ bỏ
trên thế giới đã cho thấy tỉ lệ bệnh LHON là rất
dịch rửa và tube thu thập, giữ lại cột, đặt vào
khác nhau tùy dân số chẳng hạn ở Phần Lan là
một tube thu thập mới. Rửa cột lần thứ nhì với
1:50,000(2) trong khi ở Anh là 1:25,000(4). Tại Việt
500 µl dung dịch rửa 2 cũng có bổ sung ethanol
Nam chưa có nghiên cứu khảo sát tỉ lệ bệnh
100% (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) và ly
LHON trong dân số và các kỹ thuật sinh học
tâm 14000 rpm trong 3 phút. Đổ bỏ dịch rửa 2
phân tử vẫn chưa được triển khai để nghiên cứu
cùng với tube thu thập. Đặt cột vào một tube thu
về căn bệnh này. Chính vì vậy, chúng tôi xây
thập khác, quay ly tâm 14000 rpm trong 1 phút
dựng đề tài này với mục đích phát hiện đột biến
để làm khô cột. Cuối cùng, đặt cột vào một tube
DNA ti thể gây mất thị lực do teo thần kinh thị
Eppendorf tinh sạch, cho 200 µl dung dịch thoi
đồng thời cung cấp cho các bác sĩ lâm sàng Việt
DNA, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút, ly tâm
Nam có được một công cụ chẩn đoán bệnh
14000 rpm trong 2 phút. Dịch cuối cùng thu
LHON nói riêng và các bệnh di truyền ti thể nói
82
Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
được chính là DNA bạch cầu được hòa tan trong
đệm thoi DNA, có thể dùng để thực hiện phản
ứng PCR.
Khuếch đại các đoạn gen trong DNA ti thể có
chứa vị trí đột biến
Chúng tôi sử dụng các loại hóa chất sau:
(1) PCR master mix 2X của công ty Nam Khoa
(được pha sẵn từ những nguồn nguyên liệu
mua từ các hãng BioRad, Merck, Sigma,
Proligo); (2) MgCl2 50mM do BioRad sản xuất;
(3) UNG của Invitrogen; (4) dUTP của
Promega; (5) Các cặp mồi được thiết kế đặc
hiệu trên các vùng gen có chứa điểm đột biến
của ti thể lần lượt là 3460F/R phát hiện đột
biến G3460A (gen MT-ND1), 11778F/R phát
hiện đột biến G11778A (gen MT-ND4),
10663F/R phát hiện đột biến T10663C (gen
MT-ND4L), 14484F/R phát hiện đột biến
T14484C (gen MT-ND6), 9804F/R phát hiện
đột biến G9804A, 15257F/R phát hiện đột biến
G15257A. Như vậy, với từng mẫu bệnh phẩm,
chúng tôi thực hiện 6 phản ứng PCR. Sản
phẩm khuếch đại lần lượt có kích thước như
sau: 417 bp, 297 bp, 410 bp, 210 bp, 470 bp, 250
bp. Phương pháp khuếch đại DNA được thực
hiện trong những tube PCR 0.2 ml với thể tích
dung dịch phản ứng là 50 µl bao gồm 2.5U
Taq Polymerase, 3,5mM MgCl2, 50 µM mồi
xuôi, 50 µM mồi ngược, UNG 0.1U, dNTP
25mM, dUTP 20mM. Phản ứng được thực hiện
trong máy luân nhiệt MyCycler của BioRad có
buồng ủ nhiệt 96 giếng với chu kỳ nhiệt như
sau: 1 chu kỳ 40oC trong 10 phút, 1 chu kỳ
95oC trong 5 phút, 40 chu kỳ 950C 30 giây –
55oC 30 giây – 72oC 1 phút, 1 chu kỳ 72oC 10
phút. Sản phẩm PCR được phát hiện trên gel
agarose 2%.
Giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại
từ các vùng gen ti thể
Sau khi xác định có sự hiện diện của các sản
phẩm khuếch đại, chúng tôi thực hiện tinh sạch
sản phẩm PCR bằng cách sử dụng enzym tinh
sạch Exonuclease (IllustraTM) và Alkaline
Mắt
Nghiên cứu Y học
Phosphatase (IllustraTM). Sản phẩm PCR sau
khi tinh sạch sẽ được lấy ra 5 µl điện di gel
agarose để kiểm tra sự hiện diện của băng DNA
và sau đó xác định hàm lượng DNA bằng máy
BioPhotometer của hãng Eppendorf. Sau đó,
chúng tôi thực hiện phản ứng giải trình tự bằng
cách sử dụng bộ thuốc thử của hãng ABI là
BigDye®Terminator v3.1 Cycler Sequencing Kit
với các mồi xuôi hoặc mồi ngược của chúng tôi
thiết kế. Sản phẩm giải trình tự được làm tủa và
tinh sạch bằng phương pháp tủa với ethanol.
Cuối cùng thực hiện điện di mao quản sản phẩm
giải trình tự trên máy ABI3130XL. Kết quả giải
trình tự sau đó sẽ được so sánh với trình tự DNA
chuẩn của ti thể đã được công bố trên ngân hàng
gen NBCI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
hoặc trang web www.mitomap.org từ đó phát
hiện ra điểm đột biến trên gen ti thể của bệnh
nhân bằng phần mềm SeqScape của hãng ABI.
KẾT QUẢ
Trong thời gian từ tháng 08/2011 đến tháng
12/2012, chúng tôi thu thập được 37 mẫu máu
bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh LHON hoặc cần
chẩn đoán phân biệt bệnh LHON với các bệnh
gây xơ hóa võng mạc khác.
Hình 1: Kết quả điện di trên gel agarose 2% sản
phẩm PCR khuếch đại 6 vùng gen ti thể có chứa các
điểm đột biến tương ứng. (A) là đoạn khuếch đại chứa
vị trí nucleotid 3460, (B) chứa vị trí 9804, (C) chứa vị
trí 10663, (D) chứa vị trí 11778, (E) chứa vị trí
83
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
14484, (F) chứa vị trí 15257
(A)
(B)
Hình 2: Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự DNA ti thể chuẩn của người. (A) mẫu giải trình tự có
điểm đột biến T14484C. (B) mẫu giải trình tự có điểm đột biến G11778A.
trình tự DNA chuẩn của ti thể bằng phần mềm
Sau khi ly trích DNA bạch cầu từ những
SeqScape của hãng ABI.
mẫu máu toàn phần, nồng độ DNA tách chiết
đo được nằm trong khoảng 30 – 60 ng/µl với
độ tinh sạch OD 260/280 từ 1.8 đến 2.
Nồng độ và độ tinh sạch như trên đảm bảo
cho phản ứng PCR được thực hiện tốt.
Những sản phẩm PCR này sau đó được
tiến hành giải trình tự trên hệ thống ABI
3130XL. Kết quả giải trình tự được so sánh với
84
Khảo sát trên 37 mẫu máu của bệnh nhân
nghi ngờ bệnh LHON, chúng tôi nhận thấy có 18
trường hợp mang đột biến. Trong đó, 14 mẫu
mang đột biến G11778A và 4 trường hợp còn lại
mang đột biến T14484C.
Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
KẾT LUẬN
Kỹ thuật sinh học sinh tử nói chung và kỹ
thuật giải trình tự nói riêng giờ đây trở thành
một công cụ hữu ích trong việc chẩn đoán xác
định các bệnh lý di truyền nói chung và bệnh
ty thể nói riêng, trong có đó bệnh di truyền
thần kinh thị giác Leber. Bằng việc ứng dụng
kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự trực tiếp
sản phẩm PCR, chúng tôi đã xây dựng thành
công qui trình xét nghiệm chẩn đoán đột biến
DNA ti thể trong bệnh LHON. Điều này sẽ
giúp ích rất nhiều cho các bác sĩ lâm sàng ở
Việt Nam trong việc chẩn đoán bệnh LHON,
đồng thời bệnh nhân không phải tốn công ra
nước ngoài để làm xét nghiệm này. Ưu điểm
của kỹ thuật giải trình tự là có thể khảo sát
toàn bộ trình tự trong một vùng gen mong
muốn, từ đó so sánh với trình tự gen chuẩn để
tìm ra điểm đột biến. Đây là một lợi thế so với
việc dùng men cắt giới hạn vốn dĩ có thể gây
sai sót nếu xuất hiện đột biến nằm ngoài vị trí
cần tìm làm thay đổi khả năng cắt hoặc không
cắt của men cắt tại vị trí đột biến.
Trong số 18 trường hợp phát hiện đột biến
(48,7%), 14 ca mang đột biến tại điểm
G11778A là điểm đột biến chiếm tỉ lệ cao nhất
trong bệnh LHON (77,78%) và khi bệnh mắt
đã tiến triển thì khả năng hồi phục là rất thấp.
Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi cũng
cho thấy tỉ lệ mang đột biến này chiếm đa số
và phù hợp với y văn trên thế giới. Chính vì
thế, cùng với việc xây dựng thành công kỹ
thuật sinh học phân tử dùng trong chẩn đoán
bệnh LHON, chúng tôi cũng rất mong muốn
mở ra một nghiên cứu lớn hơn nhằm tầm soát
bệnh LHON trong dân số Việt Nam đồng thời
Mắt
Nghiên cứu Y học
tư vấn di truyền cho những người mang gen
bệnh để định hướng nghề nghiệp cũng như
chế độ ăn uống nhằm hạn chế sự phát triển
của bệnh trong tương lai.
TÀI LIỆU THAMKHẢO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Hsu TK, Wang AG, Yen MY, Liu JH (2013). “Leber's
hereditary optic neuropathy masquerading as optic neuritis
with spontaneous visual recovery”. Clin Exp Optom. doi:
10.1111/cxo.12100.
Huoponen K (2001). “Leber hereditary optic neuropathy:
clinical and molecular genetic findings”. Neurogenetics 3: 119
– 125.
Istikharah R, et al (2013).”Identification of the variants in
PARL, the nuclear modifier gene, responsible for the
expression of LHON patients in Thailand”. Exp Eye Res. 116:
55-57.
Johns DR et al (1993). “Pitfalls in the molecular genetic
diagnosis of Leber’s hereditary optic neuropathy. Am”. J.
Hum. Genet, 53: 916 – 920.
Mackey DA, Oostra RJ, Rosenberg T, et al (1996). “Primary
pathogenic mtDNA mutations in multigeneration pedigrees
with Leber hereditary optic neuropathy”. Am J Hum Genet;
59:481 – 485.
Man PY, Turnbull DM, Chinnery PF (2002). “Leber hereditary
optic neuropathy”. J Med Genet; 39:162 – 169.
Oostra RJ, et al (1993). “Mitochondrial DNA analysis as a
diagnostic tool in singleton cases of Leber’s hereditary optic
neuropathy”. Ophthalmic Paediatrics and Genetic, Vol. 14,
No3, pp. 109 – 115.
Oostra RJ, et al (1994). “Leber’s hereditary optic neuropathy:
correlations between mitochondrial genotype and visual
outcome”. J Med Genet; 31: 280 – 286.
Spruijt L (2008). Leber’s hereditary optic neuropathy – an
interaction between two genomes. Maastricht University,
Netherlands.
Ziccardi L, Sadun F, et al (2013). “Retinal function and neural
conduction along the visual pathways in affected and
unaffected carriers with Leber's hereditary optic neuropathy”.
Invest Ophthalmol Vis Sci.2013.
Ngày nhận bài báo:01/11/2013
Ngày phản biện nhận xét bài báo:26/11/2013
Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014
85