Xem mẫu
- Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2019. ISBN: 978-604-82-2981-8
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ BETA HCG
TRÊN BỀ MẶT GIẾNG POLYSTYRENE
Trần Khánh Hòa
Trường Đại học Thủy lợi, email: hoatk@wru.vn
1. GIỚI THIỆU CHUNG phải lựa chọn điều kiện cố định kháng thể
beta hCG phù hợp đảm bảo phép phân tích
hCG (hormone Chorionic gonadotropin) là nhanh chóng với chi phí thấp nhưng vẫn đảm
một glycoprotein do nhau thai tiết ra gồm hai bảo tính chính xác của phép đo.
tiểu đơn vị: alpha và beta. Nồng độ beta hCG Ở đề tài này, chúng tôi nghiên cứu khả
được phát hiện trong huyết thanh của thai năng cố định kháng thể beta hCG trên bề mặt
phụ vào khoảng 8 - 9 ngày sau khi rụng trứng giếng polystyrene.
nên thường dùng để chẩn đoán có thai khi
chậm kinh. Trong sản khoa, định lượng hCG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
còn được chỉ định khi theo dõi sảy thai, thai
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu này đều
lưu, chửa ngoài tử cung và sàng lọc dị tật
là dạng tinh khiết dùng cho phân tích y sinh:
bẩm sinh [5]. Ngoài ra, beta hCG còn là chất
đĩa 96 giếng (bề mặt Polystyren); polyclonal
chỉ điểm sinh học khi sàng lọc sớm ung thư
Antibody beta hCG (4750µg/mL); dung dịch
tinh hoàn, buồng trứng. Do đó, việc định
đệm phosphate (PBS buffer 0,01M); NaN3
lượng beta hCG có ý nghĩa quan trọng trong
0,5%; dung dịch khóa giếng BSA 1% [3].
công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
Định lượng beta hCG bằng phương pháp
Phương pháp miễn dịch huỳnh quang là
miễn dịch huỳnh quang được mô tả qua hình
phương pháp định lượng thường được sử
1 gồm các bước cơ bản [3]:
dụng trong các phòng xét nghiệm y sinh. Cơ
sở của phương pháp dựa trên liên kết đặc
hiệu giữa cặp kháng thể với chất phân tích,
trong đó kháng thể dò được gắn với các chất
đánh dấu phát huỳnh quang của một số
nguyên tố thuộc họ Lantanoit như Eu3+; Tb3+,
Sm3+…, còn kháng thể cố định được gắn lên
bề mặt giếng [1, 3].
Cố định kháng thể beta hCG lên bề mặt
các giếng nhờ sự hấp phụ của kháng thể lên Hình 1. Quy trình định lượng beta hGC
bề mặt của giếng nên tính chất, chức năng bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang
của protein không bị biến tính trong quá trình 1 – Cố định kháng thể beta hCG lên bề
cố định [2, 4]. Tuy nhiên, độ bền của tương mặt giếng polystyren.
tác lại bị phụ thuộc nhiều vào nhiều yếu tố 2 – Khóa giếng bằng dung dịch BSA 1%
như: tính chất bề mặt giếng, pH, thời gian trong PBS 0,01M, ủ trong 2 giờ ở 4oC.
hấp phụ và nồng độ kháng thể... Những 3 – Thêm kháng nguyên beta hCG để phản
nhược điểm này làm cho kháng thể dễ bị rửa ứng đặc hiệu với kháng thể đã cố định.
trôi bởi một số dung dịch đệm hoặc dung 4 – Thêm kháng thể dò đã được đánh dấu
dịch rửa khi thực hiện phân tích. Do đó, cần huỳnh quang.
487
- Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2019. ISBN: 978-604-82-2981-8
5 – Đo cường độ huỳnh quang thu được trôi làm cường độ huỳnh quang giảm. Nồng
trên máy Victor 2D (PerkinElmer). độ tối ưu của kháng thể beta hCG để cố định
Chúng tôi đã khảo sát độ bền và các yếu tố trên giếng polystyren là 2,5 µg/mL.
ảnh hưởng đến độ bền của kháng thể hCG
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian cố
khi được cố định trên bề mặt giếng
định kháng thể beta hCG lên bề mặt giếng
polystyren và độ lặp của phép phân tích.
Chúng tôi đã tiến hành cố định với 5
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU khoảng thời gian khác nhau (2; 5; 10; 20 và
3.1. Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể 24 giờ) với nồng độ kháng thể beta hCG là
beta hCG cố định trên bề mặt giếng 2,5µg/mL và tại nhiệt độ 4oC. Kết quả cường
độ huỳnh quang phụ thuộc vào thời gian cố
Chúng tôi đã khảo sát với 4 nồng độ khác định kháng thể được trình bày trong Hình 3.
nhau của kháng thể hCG (1,25; 2,50; 5,00 và
10 µg/mL) được cố định lên bề mặt
polystyrene trong 20h ở 4oC. Kết quả được
trình bày trong Bảng 1 và Hình 2 dưới đây.
Bảng 1. Sự phụ thuộc cường độ
huỳnh quang của mẫu hCG chuẩn
vào nồng độ kháng thể hCG
Mẫu Nồng độ kháng thể hCG (µg/mL) Hình 3. Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang
chuẩn của mẫu hCG chuẩn vào
hCG 1,25 2,5 5,0 10 thời gian cố định kháng thể
(ng/mL)
0 1337 1528 1873 1856 Thời gian cố định kháng thể tăng từ 2 đến
20 giờ thì cường độ huỳnh quang tăng, tuy
10,6 1866 3063 4230 3223
nhiên khi tăng thời gian cố định lên đến 24
106 4102 19123 28588 23199
giờ thì cường độ huỳnh quang gần như đổi.
1030 13896 192435 179829 167366 Do đó, 20 giờ là khoảng thời gian phù hợp để
5180 26854 584593 466527 339070 cố định các kháng thể hCG trên bề mặt giếng
10100 37291 626791 448644 396931 polystyren.
3.3. Khảo sát độ lặp của phép phân tích
Nghiên cứu sử dụng 10 giếng với nồng độ
kháng thể beta hCG 2,5µg/mL, được cố
kháng trong 20 giờ và mẫu chuẩn beta hCG
có nồng độ là 1030 ng/ml. Kết quả cường độ
huỳnh quang thu được được trình bày trong
Bảng 2 và Hình 4.
Bảng 2. Cường độ huỳnh quang của 10 mẫu
Hình 2. Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang chuẩn hCG có nồng độ 1030 ng/mL
của mẫu beta hCG chuẩn vào nồng độ Giếng Cường độ Giếng Cường độ
kháng thể beta hCG 1 251948 6 220720
Khi tăng nồng độ kháng thể trên 5µg/mL, 2 230271 7 218217
cường độ huỳnh quang giảm. Điều này có thể 3 239183 8 213751
được giải thích do các kháng thể xếp chồng 4 219991 9 199458
lên nhau. Khi phản ứng bắt cặp xong bị rửa 5 225152 10 241396
488
- Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2019. ISBN: 978-604-82-2981-8
Kết quả nghiên cứu ở Bảng 3 cho thấy
kháng thể beta hCG được cố định bền trong
khoảng thời gian một tháng và độ bền của
kháng thể beta hCG trên giếng polystyren
giảm dần theo thời gian.
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Chúng tôi bước đầu đã cố định được kháng
thể beta hCG trên bề mặt của giếng
polystyren với các điều kiện tối ưu: nồng độ
Hình 4. Cường độ huỳnh quang của 10 mẫu
kháng thể beta hCG là 2,5µg/mL, thời gian
chuẩn beta hCG có nồng độ 1030 ng/mL
cố định: 20 giờ. Kết quả phân tích bằng
Sử dụng Excel 2013 để tính hệ số biến phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ
thiên của phép phân tích cho thấy kết quả có lặp tốt (CV bằng 6,7%) và độ bền cao của
độ lặp tốt (CV bằng 6,7%). giếng cố định beta hCG cho khả năng ứng
dụng của nghiên cứu để định lượng nồng độ
3.4. Khảo sát độ bền của kháng thể hCG
beta hCG trong huyết thanh của bệnh nhân.
Nghiên cứu sử dụng 40 giếng được cố Ở nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sẽ khảo
kháng thể hCG với nồng độ 2,5µg/mL trong sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng,
20 giờ để xác định mẫu chuẩn hCG có nồng độ đặc hiệu của phép phân tích, xây dựng
độ là 1030 ng/ml. đường chuẩn để định lượng beta hCG bằng
Các giếng sau khi cố định được cất giữ cẩn phương pháp miễn dịch huỳnh quang để xác
thận trong túi zip ở nhiệt độ khoảng 4oC. định hàm lượng beta hCG trong mẫu huyết
Hàng tuần, nghiên cứu lấy 10 giếng và đo thanh thực tế của bệnh nhân.
cùng mẫu chuẩn beta hCG có nồng độ 1030
ng/mL trong cùng 1 ngày. Cường độ huỳnh 5. TÀI LIỆU THAM KHẢO
quang đo được được trình bày trong Bảng 3 [1] Analytical Biochemistry, Optimization of
dưới đây: Time-Resolved Fluorescence Assay for
Detection of Eu-DOTA-labeled Ligand-
Bảng 3. Kết quả cường độ huỳnh quang
Receptor Interactions; Channa R. De Silva,
của 10 mẫu chuẩn hCG nồng độ 1030 ng/mL Volume 398, Issue 1, 1 March 2010, Pages
trong mỗi tuần 15-23.
Lần Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 [2] Kunzelmann, S., Solscheid, C., and Webb,
1 251948 216442 234070 206586 M. R. (2014), “Fluorescent biosensors:
design and application to motor proteins.”,
2 230271 238218 235044 208298
EXS105, 25–47.doi:10.1007/978-3-0348-
3 239183 200895 192435 219910 0856-9_2
4 219991 230419 203588 217766 [3] Perkin Elmer, 2012, Delfia hCG, A007-101.
5 225152 197279 179548 225069 [4] Scienedirect, 2005, Surface modification of
6 220720 224254 208033 198144 polystyrene particles for specificantibody
7 218217 201567 207425 261320 adsorption, Emmanuelle Imbert-
Laurenceaua, Polymer 46 (2005) 1277–
8 213751 249106 222197 183027
1285.
9 199458 215342 210759 217487 [5] Võ Văn Đức, 2010, Tài liệu hướng dẫn sàng
10 241396 211436 227471 234086 lọc & chẩn đoán trước sinh, Trường Đại học
TB 226009 218496 212057 216279 Y Dược Huế.
SD 15210 17035 17970 21146
CV 6,7% 7,8% 8,5% 9,7%
489
nguon tai.lieu . vn
