Xem mẫu
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
TÌM HIỂU TÍNH KHÁNG THUỐC KIỂU GEN CỦA HIV‐1
TRÊN BỆNH NHÂN CHƯA ĐIỀU TRỊ ARV TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Huỳnh Minh Tuấn*,**, Nguyễn Kim Huyền*, Phạm Hùng Vân**, Nguyễn Thanh Bảo**
TÓM TẮT
Mở đầu: Các chủng HIV‐1 đột biết kháng thuốc thoạt đầu xuất hiện bên trong một người bệnh đang được
điều trị thuốc ARV, tạo nên hiện tượng kháng thuốc mắc phải (ADR = Acquired Drug Resistance); sau đó chúng
có khả năng lây nhiễm vào người bệnh mới chưa từng điều trị, tạo nên hiện tượng kháng thuốc tiên phát (TDR =
Transmitted Drug Resistance). Tỷ lệ TDR ngày càng tăng trong nhóm người bệnh mới càng làm tăng nguy cơ
thất bại điều trị.
Mục tiêu: Khảo sát tỷ lệ, các kiểu đột biến của HIV‐1 ở người bệnh chưa từng điều trị ARV tại TP. Hồ Chí
Minh trong năm 2010‐1011.
Phương pháp: Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp mô tả, tiền cứu, thực hiện tại Bệnh Viện Bệnh
Nhiệt Đới TP. Hồ Chí Minh từ 1/2010 đến 12/2011. Cỡ mẫu: 250 mẫu. Tiêu chuẩn chọn mẫu: người bệnh được
chẩn đoán xác định nhiễm HIV‐1 theo tiêu chuẩn chẩn đoán của Bộ Y Tế 2009, chưa từng được điều trị thuốc
kháng siêu vi. Tiến hành ly trích RNA từ huyết tương, tổng hợp cDNA, khuếch đại và giải trình tự nucleotid
vùng gen reverse transcriptase, protease.S au đó, phân tích trình tự và tìm đột biến kháng thuốc dựa vào ngân
hàng dữ liệu kháng thuốc Stanford (Hoa Kỳ) và ANRS (Pháp).
Kết quả: Trong 216 mẫu khuếch đại thành công, có 44 mẫu (20,37%) mang ít nhất một đột biến kháng
thuốc; trong đó 6 mẫu (2,78%) mang hai đột biến kháng thuốc. Tần suất của đột biến kháng thuốc NRTI là 20
trường hợp (9,2%), NNRTI là 10 (7,8%), và PI là 7 (3,3%). Các đột biến được ghi nhận nhóm NRTIlà L74I,
M184V/I, K219Q, T69N/S, T215D, M184V, T69N; NNRTI là K103N/T, E138A, Y181C, G190A, V106I,
Y181C, V106I; PI là M46I, M36I, H69K.
Kết luận: Tỷ lệ các chủng HIV‐1 đột biến kháng thuốc tiếp tục tăng cao so với các nghiên cứu trước, hình
thái đột biến đa dạng hơn.
Từ khóa: HIV‐1, kháng thuốc tiên phát, kháng thuốc thứ phát, ADR, TDR,NRTI, NNRTI, PI.
ABSTRACT
GENOTYPIC RESISTANT PROFILE OF HIV‐1 IN ARV‐NAÏVE PATIENT IN HO CHI MINH CITY
Huynh Minh Tuan, Nguyen Kim Huyen, Pham Hung Van, Nguyen Thanh Bao
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 384 ‐ 391
Background:The drug‐resistant HIV‐1 strains appear in patients who are treated with ARV drug firstly,
creating the phenomenon of acquired drug resistance (ADR), then they have the ability to infect into new
persons, creating naïve drug resistance (TDR = Transmitted Drug Resistance). TDR rate is growing in new
HIV‐1 infections, trigger the high risk for treatment failure.
Objectives: Surveil the rate of drug‐resistant HIV‐1, types of mutations in naïve patients in Ho Chi Minh
City during 2010‐2011.
Methods: The study was designed according to the descriptive and prospective method, performed at
*Khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn Bệnh viện Đại học Y Dược Tp. HCM
** Bộ môn Vi sinh – Khoa Y – Đại học Y Dược Tp. HCM
Tác giả liên lạc: ThS Huỳnh Minh Tuấn ĐT: 0909349918 Email: huynhtuan@yds.edu.vn.
384
Chuyên Đề Nội Khoa
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
Nghiên cứu Y học
HCMC Hospital for Tropical Diseases from 1/2010 to 12/2011. Sample size: 250. Criteria for screening:
naïve patients were diagnosed with HIV infection following Vietnam Ministry of Health 2009 Guildelines
for diagnosing and treatment HIV/AIDS (10). Total whole blood samples were extracted RNA from plasma,
synthesized cDNA, amplified and sequenced reverse transcriptase and protease gene. Then, we analysed
sequences and found out the drug‐resistant mutations, basing on drug resistance database Stanford (USA)
and the ANRS AC11 group (France).
Results: Among 216 successful samples, there are 44 individuals (20.37%) carrying at least one drug‐
resistant mutation type; in which 6 individuals (2.78%) carrying two drug‐resitant mutations. The frequency of
NRTI mutations is 20 cases (9.2%), of NNRTI is 10 (7.8%), and of PI is 7 (3.3%). NRTI‐resistant mutations
detected are M184V, T69NL74I, M184V/I, K219Q, T69N/S, T215D; NNRTI‐ resistant mutations are Y181C,
V106I, K103N/T, E138A, Y181C, G190A, V106I; PI‐resistant mutations are M46I, M36I, H69K.
Conclusion: The rate of ARV drug‐resistant HIV‐1 mutations is increasing not only in the term of quantity
of virus but also of number of mutant strains.
Key words: HIV‐1, naïve, ADR, TDR, NRTIs, NNRTIs, Pis.
trên toàn quốc có 69.882 người bệnh được điều
ĐẶT VẤN ĐỀ
trị ARV (chiếm tỷ lệ 33,17%), các thông tin cụ thể
Kể từ trường hợp bệnh đầu tiên được phát
khác về vấn đề điều trị như sau:
hiện vào cuối thập kỷ 90 của thế kỷ trước, đại
Bảng 2: Tình hình điều trị thuốc ARV tại Việt Nam
dịch nhiễm HIV/AIDS vẫn là vấn đề nóng bỏng
năm 2012
trong ngành y tế Việt Nam cho đến hiện nay.
Tổng số người bệnh được điều trị
69.882
Theo Báo cáo tổng kết công tác phòng, chống
Người bệnh điều trị tại TP.HCM
21.350
HIV/AIDS năm 2012 của Cục Phòng Chống
Phác đồ bậc 1
96,82%
HIV/AIDS(5) thì số liệu cụ thể cho đến cuối năm
Phác đồ bậc 2
3,05%
2012 trên toàn quốc là:
Theo “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị
Bảng 1: Số liệu tình hình HIV/AIDS tại Việt Nam
năm 2012(5)
Số trường hợp nhiễm HIV hiện
vẫn còn sống
Số bệnh nhân AIDS hiện còn
sống
Số bệnh nhân AIDS tử vong
Tỉ lệ nhiễm HIV toàn quốc
Nhiễm mới HIV năm 2012
Chuyển AIDS năm 2012
Tử vong năm 2012
210.703
61.699
63.372
239 người/ 100.000 dân
11.102
3.716
961
Về điều trị thuốc kháng siêu vi ARV (Anti
Retrovirus), kể từ năm 2005, Việt Nam bắt đầu
nhận được tài trợ chính thức của hai quỹ United
States President’s Emergency Plan for AIDS
Relief (PEPFAR) và Global Fund để bắt đầu áp
dụng chương trình điều trị kháng siêu vi (ART =
Anti Retroviral Therapy) cho người bệnh nhiễm
HIV/AIDS trên toàn quốc, và cho đến hiện nay,
số lượng người bệnh nhiễm HIV/AIDS tiếp cận
được với thuốc điều trị ARV ngày một tăng lên.
Cũng theo báo cáo trên(5), tính đến 30/9/2012,
Nhiễm
HIV/AIDS” năm 2009(10) và “Sửa đổi, bổ sung
hướng dẫn chẩn đoán và điều trị HIV/AIDS”
năm 2011(11) của Bộ Y Tế, thuốc ARV chính thức
sử dụng tại Việt Nam thuộc ba nhóm sau đây:
‐ Nhóm ức chế men sao chép ngược
nucleoside và nucleotide (NRTIs = Nucleoside
Reverse Transcripatase Inhibitors; NtRTIs =
Nucleotide Reverse Transcriptase Inhibitors)
gồm các thuốc: Zidovudine (AZT, ZDV),
Stavudine (d4T), Didanosine (ddI), Lamivudine
(3TC), Abacavir (ABC), Tenofovir (TDF)…
‐ Nhóm ức chế men sao chép ngược không
phải là nucleoside (NNRTIs = Non‐Nucleoside
Reverse Transcripatase Inhibitors) gồm các
thuốc: Efavirenz (EFV), Nevirapine (NVP),
Etravirine (ETR), Rilpivirine (RPV)…
‐ Nhóm ức chế men protease (PIs =
Protease Inhibitors) gồm các thuốc: Atanazavir
+ ritonavir (ATV/r), Lopinavir + ritonavir
(LPV/r), Ritonavi (RTV)…
385
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
Trên bình diện thế giới và khu vực, y văn
đã ghi nhận tình hình kháng thuốc ARV do sự
xuất hiện của các chủng HIV‐1 đột biến kháng
thuốc ngày một tăng lên theo số lượng người
bệnh được điều trị thuốc ARV, cả kháng thuốc
thứ phát, mắc phải do chọn lọc trong quá trình
điều trị (ADR = Acquired Drug Resistance) và
kháng thuốc tiên phát do lây nhiễm chủng siêu
vi đột biến kháng thuốc (TDR = Transmitted
Drug Resistance). Tổ Chức Y Tế Thế Giới
(WHO = World Health Organization) đã có
khuyến cáo về tầm soát các trường hợp kháng
thuốc tiên phát do lây nhiễm phải chủng siêu
vi kháng thuốc(3). Các kết quả nghiên cứu ở
Trung Quốc đã công bố số liệu về tỷ lệ lưu
hành của các chủng HIV‐1 đột biến kháng
thuốc khoảng 3,8%(7). Tại Thái Lan, một đất
nước rất gần và có rất nhiều điểm tương đồng
với đất nước chúng ta, các kết quả nghiên cứu
cũng cho thấy tỷ lệ lưu hành của các chủng
HIV‐1 đột biết kháng thuốc tăng dần từ khi bắt
đầu chương trình ART trên người bệnh Thái
nhiễm HIV/AIDS năm 2002, đã vượt lên hơn
ngưỡng 5% (5,2% vào năm 2006)(1,14).
Tại Việt Nam, ngay từ năm 2005 khi bắt đầu
chương trình quốc gia ART, một nghiên cứu của
tác giả Trương Thị Xuân Liên và cộng sự ở TP.
Hồ Chí Minh(15) đã báo cáo về một trường hợp
nhiễm chủng HIV‐1 mang đột biến kháng thuốc
NRTI trên người bệnh là phụ nữ mang thai chưa
điều trị ARV.Năm 2006, một nghiên cứu khác
của tác giả Ayouba và cộng sự cũng ở TP. Hồ
Chí Minh(2) báo cáo về các trường hợp nhiễm các
chủng HIV‐1 mang các đột biến kháng thuốc
NNRTI và PI trên nhóm người bệnh là thanh
niên trẻ đến tầm soát nhiễm HIV tại các phòng
tham vấn xét nghiệm tự nguyện (VCT =
Voluntary Counseling and Testing).Cũng năm
2006, một nghiên cứu của tác giả Nguyễn Trần
Hiển và cộng sự tại Hà Nội(8) báo cáo về các
trường hợp nhiễm chủng HIV‐1 mang đột biến
kháng thuốc cả NRTI và NNRTI trên nhóm
người bệnh đến tầm soát nhiễm HIV tại các
phòngVCT.Tiếp theo sau đó, vào các năm 2007
và 2008, tác giả Yang và cộng sự công bố kết quả
386
nghiên cứu ở TP. Hồ Chí Minh(19) cho thấy tỷ lệ
người bệnh mang các chủng HIV‐1 đột biến
kháng thuốc có thể lên đến 5‐15% người trẻ đến
tầm soát nhiễm HIV tại các phòng VCT. Ngoài
ra, còn một số kết quả nghiên cứu của các tác giả
khác ở cả hai miền nam bắc cho thấy khoảng 6,3‐
6,7% người nhiễm HIV‐1 mạn tính chưa điều trị
ARV có mang các chủng siêu vi đột biến kháng
thuốc trên toàn bộ Việt Nam(4,6,8,16,16).
Tổng kết từ các nghiên cứu này, xét về các
nhóm thuốc ARV, đột biến kháng NRTI là nhiều
nhất (có thể lên đến 8‐9%), và đột biến kháng PI
là thấp nhất (ít hơn 2%). Khi xét cụ thể các đột
biến thì, trong các đột biến kháng thuốc nhóm
NRTI, chiếm tỷ lệ cao nhất là đột biến M184I/V
và các đột biến TAMs (Thymidine‐Analogue
Mutations), bao gồm M41L, D67N, K70R, T215F,
L210W, và K219E/Q, tiếp theo sau đó là đột biến
L74I/V; trong các đột biến kháng thuốc nhóm
NNRTI, thường gặp nhất là các đột biến Y181C,
K103N, và G190A; trong các đột biến kháng
thuốc nhóm PI, thường gặp nhất là M46I/I.
Khả năng đột biến để thích nghi và tồn tại
dưới áp lực thuốc ARV của HIV‐1 là siêu việt, và
chắc chắn sẽ còn tiếp diễn. Đây cũng là một
trong những thách thức to lớn cho con người
trong công cuộc tìm kiếm vũ khí (thuốc) hữu
hiệu để khống chế căn bệnh thế kỷ này. Đó cũng
là lý do để chúng tôi tiến hành nghiên cứu này,
tiếp tục tìm hiểu đặc tính kháng thuốc trên
những người bệnh chưa điều trị ARV, nhằm
mục đích đóng góp vào kiến thức dịch tể nói
chúng, và góp phần giúp các bác sĩ điều trị có
nhiều thông tin hơn trong việc chọn lựa phác đồ
điều trị cho người bệnh.
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp
mô tả, tiền cứu, thực hiện tại Bệnh Viện Bệnh
Nhiệt Đới TP. Hồ Chí Minh từ 1/2010 đến
12/2011.
Chuyên Đề Nội Khoa
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
Đối tượng
Tổng cộng nhóm nghiên cứu chúng tôi đã
thu thập được 250 mẫu máu toàn phần người
bệnh HIV‐1 đến khám và điều trị tại phòng
khám ngoại trú của Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới
TP.HCM. Mẫu được lấy theo phương pháp
ngẫu nhiên liên tục cho đến khi kết thúc. Tiêu
chuẩn chọn mẫu vào nghiên cứu là người bệnh
được chẩn đoán xác định nhiễm HIV‐1 theo tiêu
chuẩn chẩn đoán của Bộ Y Tế 2009(10), chưa được
điều trị thuốc kháng siêu vi trước đó, trưởng
thành (≥ 18 tuổi tính đến thời điểm tham gia
nghiên cứu) và đồng ý tham gia nghiên cứu;
không phân biệt tuổi, giới, tiền sử lây truyền, và
giai đoạn tiến triển của bệnh.
Ly trích huyết tương
Mẫu máu toàn phần (8‐10ml) được cho vào
ống chống đông EDTAK3 (Nam Khoa Biotek,
HCMC, Vietnam), được vận chuyển từ Bệnh
Viện Bệnh Nhiệt Đới TP. Hồ Chí Minh về Đại
Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh trong thùng xốp
kín có đá khô không quá hai (02) giờ kể từ khi
lấy mẫu, và được ly tách huyết tương ngay.
Nghiên cứu Y học
Mẫu máu được ly tách huyết tương bằng
phương pháp ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút,
trong 10 phút ở nhịêt độ 4oC. Huyết tương ly
tách được khoảng 3‐4ml, được aliquot vào các
ống Effpendof 1,5ml và lưu ở ‐70°C đến khi thực
hiện bước tiếp theo.
Ly trích RNA siêu vi HIV‐1
Rã đông tự nhiên huyết tương đã lưu ở trên,
ly trích RNA bằng cách sử dụng 150µl huyết
tương và bộ kit RNAPrep (Nam Khoa Biotek,
HCMC, Vietnam). Nguyên tắc của bộ kit này là
sử dụng hợp chất phenol‐chloroform làm biến
tính protein và dùng ethanol lạnh để làm tủa
RNA của siêu vi HIV‐1.
Tổng hợp cDNA từ RNA được ly trích ở trên
Sản phẩm RNA ly trích ở bước trên được
sử dụng để tổng hợp thành cDNA bằng bộ kit
cDNA Synthesis (Nam Khoa Biotek, HCMC,
Vietnam). Chu kỳ nhiệt được sử dụng là: 25oC
trong 5 phút, 42oC trong 30 phút, 85oC trong
5 phút.
Khuếch đại các vùng gen reverse transcriptase (rt) và protease (pr) của HIV‐1 bằng phương pháp
“nested” PCR và tinh sạch sản phẩm sau khuếch đại
Vùng gen
rt
pr
Mồi ngoài
Mồi trong
MJ3:
A(35):
5’-AGTAGGACCTACACCTGTCA-3’
5’-TTGGTTGCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCCTATT-3’
(2480 to 2499)
(2530 to 2558)
MJ4:
NE1(35):
5’-CTGTTAGTGCTTTGGTTCCTCT-3’
5’-CCTACTAACTTCTGTATGTCATTGACAGTCCAGCT(3399 to 3420)
3’ (3300 to 3334) (kích thước 805 bp)
5’ prot 1:
5’ prot 2:
5’-TAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCC-3’
5’-TCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCA-3’
(2082 to 2109)
(2136 to 2163)
3’ prot 1:
3’ prot 2:
5’-GCAAATACTGGAGTATTGTATGGATTTTCAGG5’-AATGCTTTTATTTTTTCTTCTGTCAATGGC-3’
3’ (2703 to 2734)
(2621 to 2650) (kích thước 515 bp)
Trình tự mồi tham khảo từ tổ chức ANRS (http://www.hivfrenchresistance.org)
giây, 61 oC trong 30 giây và 72 oC trong 1 phút;
Chu kỳ nhiệt PCR khi sử dụng “mồi ngoài”:
sau cùng là 72 oC trong 10 phút.
95 oC trong 5 phút; 40 chu kỳ gồm 94 oC trong 30
Khi đã thực hiện khuếch đại vùng gen rt, pr,
giây, 50 oC trong 30 giây và 72 oC trong 1 phút;
sau cùng là 72 oC trong 10 phút.
chúng tôi cho sản phẩm PCR chạy điện di trên
Chu kỳ nhiệt PCR khi sử dụng “mồi trong”:
oC trong 5 phút; 40 chu kỳ gồm 94 oC trong 30
95
gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide để xác
Nhiễm
387
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
định sản phẩm chính là gen rt, pr (dựa vào kích
thước đoạn khuếch đại).
Tinh sạch toàn bộ sản phẩm PCR bằng bộ kit
Purification (Qiagen, Hilden, Germany).
Giải trình tự gen rt, pr
Sản phẩm từ bước tinh sạch ở trên sẽ được
thực hiện giải trình tự nucleotid cả 2 mạch bằng
bộ kit BigDye Terminator Cycle Sequencing v3.1
(Applied Biosystems, Foster CA, USA) với mồi
“xuôi” và “ngược” là A(35), NE1(35) đối với gen
rt; 5’prot2, 3’prot2 đối với gen pr, sau khi tất cả
sản phẩm PCR được đánh dấu huỳnh quang, sẽ
được “cô đặc” lại và huyền phù trong 20µl
formamid để được phân tích trình tự nucleotide
bằng máy giải trình tự tự động ABI Prism 3130xl
(Applied Biosystems, Foster CA, USA).
Tinh sạch trình tự và tìm đột biến kháng
thuốc
Trình tự nucleotid “thô” sau khi giải sẽ được
“tinh sạch” bằng phần mềm Mega 5.05, sau đó
so sánh với dữ liệu HIV kháng thuốc Stanford
(http://hivdb.Stanford.edu/)
và
ANRS
(http://www.hivfrenchresistance.org) để xác
định đột biến kháng thuốc chính, phụ đối với
thuốc ARV (antiretrovirus) gồm các nhóm NRTI,
NNRTI, PI.
trong việc khuếch đại, giải và phân tích trình
tự của 216 mẫu (chiếm 86,4%).
Trong tổng số 216 mẫu được phân tích, có
44 cá thể người bệnh (chiếm 20,37%) mang ít
nhất một kiểu đột biến kháng thuốc của cả ba
nhóm NRTI, NNRTI, và PI; trong đó 6 cá thể
người bệnh (2,78%) mang chủng HIV‐1 có hai
đột biến kháng thuốc đã được ghi nhận. Tần
suất xuất hiện của các đột biến kháng thuốc
NRTI là 20 trường hợp (9,2%), NNRTI là 10
trường hợp (7,8%), và PI là 7 trường hợp
(3,3%). Các kết quả cụ thể được trình bày trong
những bảng dưới đây.
Dữ liệu tham khảo về vị trí đột biến, kiểu
đột biến chính‐phụ được tham khảo từ các kết
quả đã công bố của nhóm ANRS (Pháp) và từ
ngân hàng dữ liệu Stanford (Hoa Kỳ).
Khi so sánh với các kết quả nghiên cứu
kháng thuốc đã công bố tại Việt Nam(2,4,6,8 ,15,16,19),
chúng tôi thấy: trong các nghiên cứu đã công bố
ở trên, các đột biến kháng thuốc nhóm NRTI đã
được ghi nhận là: M41L, K65R, D67N, T69D,
K70R, L74V/I, V75A/M, M184V/I,L210W, T215F,
K219E/Q/R; so với nghiên cứu của chúng tôi, các
vị trí và kiểu đột biến được phát hiện là L74I,
M184V/I, K219Q, T69N/S, T215D, cho thấy có sự
tương đồng với các nghiên cứu đã công bố.
KẾT QUẢ & BÀN LUẬN
Trong 250 mẫu bệnh phẩm thu thập được,
nhóm nghiên cứu chúng tôi đã thành công
Kết quả phân tích đột biến kháng thuốc nhóm NRTI
Bảng 3: Kết quả đột biến kháng thuốc nhóm NRTI
TT
Loại đột biến
1
L74I
2
3
4
Tổng đột biến chính
T69N
T69S
T215D
3
Tỷ lệ %
Loại thuốc bị kháng
ABC¥, ddI¥
0,93
3
4
2
11
M184I
M184V
K219Q
4
1
2
3
Tổng đột biến phụ
Tần suất
Chính
2
¥
1,39
1,85
0,93
5,10
3TC , FTC¥, ABC, ddI
3TC¥, FTC¥, ABC, ddI
d4T
6
2
1
9
2,78
0,93
0,46
4,17
TDF
TDF
ZDV, d4T
Phụ
¥
Thuốc ARV bị kháng ở mức độ cao
388
Chuyên Đề Nội Khoa
nguon tai.lieu . vn
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
TÌM HIỂU TÍNH KHÁNG THUỐC KIỂU GEN CỦA HIV‐1
TRÊN BỆNH NHÂN CHƯA ĐIỀU TRỊ ARV TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Huỳnh Minh Tuấn*,**, Nguyễn Kim Huyền*, Phạm Hùng Vân**, Nguyễn Thanh Bảo**
TÓM TẮT
Mở đầu: Các chủng HIV‐1 đột biết kháng thuốc thoạt đầu xuất hiện bên trong một người bệnh đang được
điều trị thuốc ARV, tạo nên hiện tượng kháng thuốc mắc phải (ADR = Acquired Drug Resistance); sau đó chúng
có khả năng lây nhiễm vào người bệnh mới chưa từng điều trị, tạo nên hiện tượng kháng thuốc tiên phát (TDR =
Transmitted Drug Resistance). Tỷ lệ TDR ngày càng tăng trong nhóm người bệnh mới càng làm tăng nguy cơ
thất bại điều trị.
Mục tiêu: Khảo sát tỷ lệ, các kiểu đột biến của HIV‐1 ở người bệnh chưa từng điều trị ARV tại TP. Hồ Chí
Minh trong năm 2010‐1011.
Phương pháp: Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp mô tả, tiền cứu, thực hiện tại Bệnh Viện Bệnh
Nhiệt Đới TP. Hồ Chí Minh từ 1/2010 đến 12/2011. Cỡ mẫu: 250 mẫu. Tiêu chuẩn chọn mẫu: người bệnh được
chẩn đoán xác định nhiễm HIV‐1 theo tiêu chuẩn chẩn đoán của Bộ Y Tế 2009, chưa từng được điều trị thuốc
kháng siêu vi. Tiến hành ly trích RNA từ huyết tương, tổng hợp cDNA, khuếch đại và giải trình tự nucleotid
vùng gen reverse transcriptase, protease.S au đó, phân tích trình tự và tìm đột biến kháng thuốc dựa vào ngân
hàng dữ liệu kháng thuốc Stanford (Hoa Kỳ) và ANRS (Pháp).
Kết quả: Trong 216 mẫu khuếch đại thành công, có 44 mẫu (20,37%) mang ít nhất một đột biến kháng
thuốc; trong đó 6 mẫu (2,78%) mang hai đột biến kháng thuốc. Tần suất của đột biến kháng thuốc NRTI là 20
trường hợp (9,2%), NNRTI là 10 (7,8%), và PI là 7 (3,3%). Các đột biến được ghi nhận nhóm NRTIlà L74I,
M184V/I, K219Q, T69N/S, T215D, M184V, T69N; NNRTI là K103N/T, E138A, Y181C, G190A, V106I,
Y181C, V106I; PI là M46I, M36I, H69K.
Kết luận: Tỷ lệ các chủng HIV‐1 đột biến kháng thuốc tiếp tục tăng cao so với các nghiên cứu trước, hình
thái đột biến đa dạng hơn.
Từ khóa: HIV‐1, kháng thuốc tiên phát, kháng thuốc thứ phát, ADR, TDR,NRTI, NNRTI, PI.
ABSTRACT
GENOTYPIC RESISTANT PROFILE OF HIV‐1 IN ARV‐NAÏVE PATIENT IN HO CHI MINH CITY
Huynh Minh Tuan, Nguyen Kim Huyen, Pham Hung Van, Nguyen Thanh Bao
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 384 ‐ 391
Background:The drug‐resistant HIV‐1 strains appear in patients who are treated with ARV drug firstly,
creating the phenomenon of acquired drug resistance (ADR), then they have the ability to infect into new
persons, creating naïve drug resistance (TDR = Transmitted Drug Resistance). TDR rate is growing in new
HIV‐1 infections, trigger the high risk for treatment failure.
Objectives: Surveil the rate of drug‐resistant HIV‐1, types of mutations in naïve patients in Ho Chi Minh
City during 2010‐2011.
Methods: The study was designed according to the descriptive and prospective method, performed at
*Khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn Bệnh viện Đại học Y Dược Tp. HCM
** Bộ môn Vi sinh – Khoa Y – Đại học Y Dược Tp. HCM
Tác giả liên lạc: ThS Huỳnh Minh Tuấn ĐT: 0909349918 Email: huynhtuan@yds.edu.vn.
384
Chuyên Đề Nội Khoa
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
Nghiên cứu Y học
HCMC Hospital for Tropical Diseases from 1/2010 to 12/2011. Sample size: 250. Criteria for screening:
naïve patients were diagnosed with HIV infection following Vietnam Ministry of Health 2009 Guildelines
for diagnosing and treatment HIV/AIDS (10). Total whole blood samples were extracted RNA from plasma,
synthesized cDNA, amplified and sequenced reverse transcriptase and protease gene. Then, we analysed
sequences and found out the drug‐resistant mutations, basing on drug resistance database Stanford (USA)
and the ANRS AC11 group (France).
Results: Among 216 successful samples, there are 44 individuals (20.37%) carrying at least one drug‐
resistant mutation type; in which 6 individuals (2.78%) carrying two drug‐resitant mutations. The frequency of
NRTI mutations is 20 cases (9.2%), of NNRTI is 10 (7.8%), and of PI is 7 (3.3%). NRTI‐resistant mutations
detected are M184V, T69NL74I, M184V/I, K219Q, T69N/S, T215D; NNRTI‐ resistant mutations are Y181C,
V106I, K103N/T, E138A, Y181C, G190A, V106I; PI‐resistant mutations are M46I, M36I, H69K.
Conclusion: The rate of ARV drug‐resistant HIV‐1 mutations is increasing not only in the term of quantity
of virus but also of number of mutant strains.
Key words: HIV‐1, naïve, ADR, TDR, NRTIs, NNRTIs, Pis.
trên toàn quốc có 69.882 người bệnh được điều
ĐẶT VẤN ĐỀ
trị ARV (chiếm tỷ lệ 33,17%), các thông tin cụ thể
Kể từ trường hợp bệnh đầu tiên được phát
khác về vấn đề điều trị như sau:
hiện vào cuối thập kỷ 90 của thế kỷ trước, đại
Bảng 2: Tình hình điều trị thuốc ARV tại Việt Nam
dịch nhiễm HIV/AIDS vẫn là vấn đề nóng bỏng
năm 2012
trong ngành y tế Việt Nam cho đến hiện nay.
Tổng số người bệnh được điều trị
69.882
Theo Báo cáo tổng kết công tác phòng, chống
Người bệnh điều trị tại TP.HCM
21.350
HIV/AIDS năm 2012 của Cục Phòng Chống
Phác đồ bậc 1
96,82%
HIV/AIDS(5) thì số liệu cụ thể cho đến cuối năm
Phác đồ bậc 2
3,05%
2012 trên toàn quốc là:
Theo “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị
Bảng 1: Số liệu tình hình HIV/AIDS tại Việt Nam
năm 2012(5)
Số trường hợp nhiễm HIV hiện
vẫn còn sống
Số bệnh nhân AIDS hiện còn
sống
Số bệnh nhân AIDS tử vong
Tỉ lệ nhiễm HIV toàn quốc
Nhiễm mới HIV năm 2012
Chuyển AIDS năm 2012
Tử vong năm 2012
210.703
61.699
63.372
239 người/ 100.000 dân
11.102
3.716
961
Về điều trị thuốc kháng siêu vi ARV (Anti
Retrovirus), kể từ năm 2005, Việt Nam bắt đầu
nhận được tài trợ chính thức của hai quỹ United
States President’s Emergency Plan for AIDS
Relief (PEPFAR) và Global Fund để bắt đầu áp
dụng chương trình điều trị kháng siêu vi (ART =
Anti Retroviral Therapy) cho người bệnh nhiễm
HIV/AIDS trên toàn quốc, và cho đến hiện nay,
số lượng người bệnh nhiễm HIV/AIDS tiếp cận
được với thuốc điều trị ARV ngày một tăng lên.
Cũng theo báo cáo trên(5), tính đến 30/9/2012,
Nhiễm
HIV/AIDS” năm 2009(10) và “Sửa đổi, bổ sung
hướng dẫn chẩn đoán và điều trị HIV/AIDS”
năm 2011(11) của Bộ Y Tế, thuốc ARV chính thức
sử dụng tại Việt Nam thuộc ba nhóm sau đây:
‐ Nhóm ức chế men sao chép ngược
nucleoside và nucleotide (NRTIs = Nucleoside
Reverse Transcripatase Inhibitors; NtRTIs =
Nucleotide Reverse Transcriptase Inhibitors)
gồm các thuốc: Zidovudine (AZT, ZDV),
Stavudine (d4T), Didanosine (ddI), Lamivudine
(3TC), Abacavir (ABC), Tenofovir (TDF)…
‐ Nhóm ức chế men sao chép ngược không
phải là nucleoside (NNRTIs = Non‐Nucleoside
Reverse Transcripatase Inhibitors) gồm các
thuốc: Efavirenz (EFV), Nevirapine (NVP),
Etravirine (ETR), Rilpivirine (RPV)…
‐ Nhóm ức chế men protease (PIs =
Protease Inhibitors) gồm các thuốc: Atanazavir
+ ritonavir (ATV/r), Lopinavir + ritonavir
(LPV/r), Ritonavi (RTV)…
385
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
Trên bình diện thế giới và khu vực, y văn
đã ghi nhận tình hình kháng thuốc ARV do sự
xuất hiện của các chủng HIV‐1 đột biến kháng
thuốc ngày một tăng lên theo số lượng người
bệnh được điều trị thuốc ARV, cả kháng thuốc
thứ phát, mắc phải do chọn lọc trong quá trình
điều trị (ADR = Acquired Drug Resistance) và
kháng thuốc tiên phát do lây nhiễm chủng siêu
vi đột biến kháng thuốc (TDR = Transmitted
Drug Resistance). Tổ Chức Y Tế Thế Giới
(WHO = World Health Organization) đã có
khuyến cáo về tầm soát các trường hợp kháng
thuốc tiên phát do lây nhiễm phải chủng siêu
vi kháng thuốc(3). Các kết quả nghiên cứu ở
Trung Quốc đã công bố số liệu về tỷ lệ lưu
hành của các chủng HIV‐1 đột biến kháng
thuốc khoảng 3,8%(7). Tại Thái Lan, một đất
nước rất gần và có rất nhiều điểm tương đồng
với đất nước chúng ta, các kết quả nghiên cứu
cũng cho thấy tỷ lệ lưu hành của các chủng
HIV‐1 đột biết kháng thuốc tăng dần từ khi bắt
đầu chương trình ART trên người bệnh Thái
nhiễm HIV/AIDS năm 2002, đã vượt lên hơn
ngưỡng 5% (5,2% vào năm 2006)(1,14).
Tại Việt Nam, ngay từ năm 2005 khi bắt đầu
chương trình quốc gia ART, một nghiên cứu của
tác giả Trương Thị Xuân Liên và cộng sự ở TP.
Hồ Chí Minh(15) đã báo cáo về một trường hợp
nhiễm chủng HIV‐1 mang đột biến kháng thuốc
NRTI trên người bệnh là phụ nữ mang thai chưa
điều trị ARV.Năm 2006, một nghiên cứu khác
của tác giả Ayouba và cộng sự cũng ở TP. Hồ
Chí Minh(2) báo cáo về các trường hợp nhiễm các
chủng HIV‐1 mang các đột biến kháng thuốc
NNRTI và PI trên nhóm người bệnh là thanh
niên trẻ đến tầm soát nhiễm HIV tại các phòng
tham vấn xét nghiệm tự nguyện (VCT =
Voluntary Counseling and Testing).Cũng năm
2006, một nghiên cứu của tác giả Nguyễn Trần
Hiển và cộng sự tại Hà Nội(8) báo cáo về các
trường hợp nhiễm chủng HIV‐1 mang đột biến
kháng thuốc cả NRTI và NNRTI trên nhóm
người bệnh đến tầm soát nhiễm HIV tại các
phòngVCT.Tiếp theo sau đó, vào các năm 2007
và 2008, tác giả Yang và cộng sự công bố kết quả
386
nghiên cứu ở TP. Hồ Chí Minh(19) cho thấy tỷ lệ
người bệnh mang các chủng HIV‐1 đột biến
kháng thuốc có thể lên đến 5‐15% người trẻ đến
tầm soát nhiễm HIV tại các phòng VCT. Ngoài
ra, còn một số kết quả nghiên cứu của các tác giả
khác ở cả hai miền nam bắc cho thấy khoảng 6,3‐
6,7% người nhiễm HIV‐1 mạn tính chưa điều trị
ARV có mang các chủng siêu vi đột biến kháng
thuốc trên toàn bộ Việt Nam(4,6,8,16,16).
Tổng kết từ các nghiên cứu này, xét về các
nhóm thuốc ARV, đột biến kháng NRTI là nhiều
nhất (có thể lên đến 8‐9%), và đột biến kháng PI
là thấp nhất (ít hơn 2%). Khi xét cụ thể các đột
biến thì, trong các đột biến kháng thuốc nhóm
NRTI, chiếm tỷ lệ cao nhất là đột biến M184I/V
và các đột biến TAMs (Thymidine‐Analogue
Mutations), bao gồm M41L, D67N, K70R, T215F,
L210W, và K219E/Q, tiếp theo sau đó là đột biến
L74I/V; trong các đột biến kháng thuốc nhóm
NNRTI, thường gặp nhất là các đột biến Y181C,
K103N, và G190A; trong các đột biến kháng
thuốc nhóm PI, thường gặp nhất là M46I/I.
Khả năng đột biến để thích nghi và tồn tại
dưới áp lực thuốc ARV của HIV‐1 là siêu việt, và
chắc chắn sẽ còn tiếp diễn. Đây cũng là một
trong những thách thức to lớn cho con người
trong công cuộc tìm kiếm vũ khí (thuốc) hữu
hiệu để khống chế căn bệnh thế kỷ này. Đó cũng
là lý do để chúng tôi tiến hành nghiên cứu này,
tiếp tục tìm hiểu đặc tính kháng thuốc trên
những người bệnh chưa điều trị ARV, nhằm
mục đích đóng góp vào kiến thức dịch tể nói
chúng, và góp phần giúp các bác sĩ điều trị có
nhiều thông tin hơn trong việc chọn lựa phác đồ
điều trị cho người bệnh.
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp
mô tả, tiền cứu, thực hiện tại Bệnh Viện Bệnh
Nhiệt Đới TP. Hồ Chí Minh từ 1/2010 đến
12/2011.
Chuyên Đề Nội Khoa
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
Đối tượng
Tổng cộng nhóm nghiên cứu chúng tôi đã
thu thập được 250 mẫu máu toàn phần người
bệnh HIV‐1 đến khám và điều trị tại phòng
khám ngoại trú của Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới
TP.HCM. Mẫu được lấy theo phương pháp
ngẫu nhiên liên tục cho đến khi kết thúc. Tiêu
chuẩn chọn mẫu vào nghiên cứu là người bệnh
được chẩn đoán xác định nhiễm HIV‐1 theo tiêu
chuẩn chẩn đoán của Bộ Y Tế 2009(10), chưa được
điều trị thuốc kháng siêu vi trước đó, trưởng
thành (≥ 18 tuổi tính đến thời điểm tham gia
nghiên cứu) và đồng ý tham gia nghiên cứu;
không phân biệt tuổi, giới, tiền sử lây truyền, và
giai đoạn tiến triển của bệnh.
Ly trích huyết tương
Mẫu máu toàn phần (8‐10ml) được cho vào
ống chống đông EDTAK3 (Nam Khoa Biotek,
HCMC, Vietnam), được vận chuyển từ Bệnh
Viện Bệnh Nhiệt Đới TP. Hồ Chí Minh về Đại
Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh trong thùng xốp
kín có đá khô không quá hai (02) giờ kể từ khi
lấy mẫu, và được ly tách huyết tương ngay.
Nghiên cứu Y học
Mẫu máu được ly tách huyết tương bằng
phương pháp ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút,
trong 10 phút ở nhịêt độ 4oC. Huyết tương ly
tách được khoảng 3‐4ml, được aliquot vào các
ống Effpendof 1,5ml và lưu ở ‐70°C đến khi thực
hiện bước tiếp theo.
Ly trích RNA siêu vi HIV‐1
Rã đông tự nhiên huyết tương đã lưu ở trên,
ly trích RNA bằng cách sử dụng 150µl huyết
tương và bộ kit RNAPrep (Nam Khoa Biotek,
HCMC, Vietnam). Nguyên tắc của bộ kit này là
sử dụng hợp chất phenol‐chloroform làm biến
tính protein và dùng ethanol lạnh để làm tủa
RNA của siêu vi HIV‐1.
Tổng hợp cDNA từ RNA được ly trích ở trên
Sản phẩm RNA ly trích ở bước trên được
sử dụng để tổng hợp thành cDNA bằng bộ kit
cDNA Synthesis (Nam Khoa Biotek, HCMC,
Vietnam). Chu kỳ nhiệt được sử dụng là: 25oC
trong 5 phút, 42oC trong 30 phút, 85oC trong
5 phút.
Khuếch đại các vùng gen reverse transcriptase (rt) và protease (pr) của HIV‐1 bằng phương pháp
“nested” PCR và tinh sạch sản phẩm sau khuếch đại
Vùng gen
rt
pr
Mồi ngoài
Mồi trong
MJ3:
A(35):
5’-AGTAGGACCTACACCTGTCA-3’
5’-TTGGTTGCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCCTATT-3’
(2480 to 2499)
(2530 to 2558)
MJ4:
NE1(35):
5’-CTGTTAGTGCTTTGGTTCCTCT-3’
5’-CCTACTAACTTCTGTATGTCATTGACAGTCCAGCT(3399 to 3420)
3’ (3300 to 3334) (kích thước 805 bp)
5’ prot 1:
5’ prot 2:
5’-TAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCC-3’
5’-TCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCA-3’
(2082 to 2109)
(2136 to 2163)
3’ prot 1:
3’ prot 2:
5’-GCAAATACTGGAGTATTGTATGGATTTTCAGG5’-AATGCTTTTATTTTTTCTTCTGTCAATGGC-3’
3’ (2703 to 2734)
(2621 to 2650) (kích thước 515 bp)
Trình tự mồi tham khảo từ tổ chức ANRS (http://www.hivfrenchresistance.org)
giây, 61 oC trong 30 giây và 72 oC trong 1 phút;
Chu kỳ nhiệt PCR khi sử dụng “mồi ngoài”:
sau cùng là 72 oC trong 10 phút.
95 oC trong 5 phút; 40 chu kỳ gồm 94 oC trong 30
Khi đã thực hiện khuếch đại vùng gen rt, pr,
giây, 50 oC trong 30 giây và 72 oC trong 1 phút;
sau cùng là 72 oC trong 10 phút.
chúng tôi cho sản phẩm PCR chạy điện di trên
Chu kỳ nhiệt PCR khi sử dụng “mồi trong”:
oC trong 5 phút; 40 chu kỳ gồm 94 oC trong 30
95
gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide để xác
Nhiễm
387
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014
định sản phẩm chính là gen rt, pr (dựa vào kích
thước đoạn khuếch đại).
Tinh sạch toàn bộ sản phẩm PCR bằng bộ kit
Purification (Qiagen, Hilden, Germany).
Giải trình tự gen rt, pr
Sản phẩm từ bước tinh sạch ở trên sẽ được
thực hiện giải trình tự nucleotid cả 2 mạch bằng
bộ kit BigDye Terminator Cycle Sequencing v3.1
(Applied Biosystems, Foster CA, USA) với mồi
“xuôi” và “ngược” là A(35), NE1(35) đối với gen
rt; 5’prot2, 3’prot2 đối với gen pr, sau khi tất cả
sản phẩm PCR được đánh dấu huỳnh quang, sẽ
được “cô đặc” lại và huyền phù trong 20µl
formamid để được phân tích trình tự nucleotide
bằng máy giải trình tự tự động ABI Prism 3130xl
(Applied Biosystems, Foster CA, USA).
Tinh sạch trình tự và tìm đột biến kháng
thuốc
Trình tự nucleotid “thô” sau khi giải sẽ được
“tinh sạch” bằng phần mềm Mega 5.05, sau đó
so sánh với dữ liệu HIV kháng thuốc Stanford
(http://hivdb.Stanford.edu/)
và
ANRS
(http://www.hivfrenchresistance.org) để xác
định đột biến kháng thuốc chính, phụ đối với
thuốc ARV (antiretrovirus) gồm các nhóm NRTI,
NNRTI, PI.
trong việc khuếch đại, giải và phân tích trình
tự của 216 mẫu (chiếm 86,4%).
Trong tổng số 216 mẫu được phân tích, có
44 cá thể người bệnh (chiếm 20,37%) mang ít
nhất một kiểu đột biến kháng thuốc của cả ba
nhóm NRTI, NNRTI, và PI; trong đó 6 cá thể
người bệnh (2,78%) mang chủng HIV‐1 có hai
đột biến kháng thuốc đã được ghi nhận. Tần
suất xuất hiện của các đột biến kháng thuốc
NRTI là 20 trường hợp (9,2%), NNRTI là 10
trường hợp (7,8%), và PI là 7 trường hợp
(3,3%). Các kết quả cụ thể được trình bày trong
những bảng dưới đây.
Dữ liệu tham khảo về vị trí đột biến, kiểu
đột biến chính‐phụ được tham khảo từ các kết
quả đã công bố của nhóm ANRS (Pháp) và từ
ngân hàng dữ liệu Stanford (Hoa Kỳ).
Khi so sánh với các kết quả nghiên cứu
kháng thuốc đã công bố tại Việt Nam(2,4,6,8 ,15,16,19),
chúng tôi thấy: trong các nghiên cứu đã công bố
ở trên, các đột biến kháng thuốc nhóm NRTI đã
được ghi nhận là: M41L, K65R, D67N, T69D,
K70R, L74V/I, V75A/M, M184V/I,L210W, T215F,
K219E/Q/R; so với nghiên cứu của chúng tôi, các
vị trí và kiểu đột biến được phát hiện là L74I,
M184V/I, K219Q, T69N/S, T215D, cho thấy có sự
tương đồng với các nghiên cứu đã công bố.
KẾT QUẢ & BÀN LUẬN
Trong 250 mẫu bệnh phẩm thu thập được,
nhóm nghiên cứu chúng tôi đã thành công
Kết quả phân tích đột biến kháng thuốc nhóm NRTI
Bảng 3: Kết quả đột biến kháng thuốc nhóm NRTI
TT
Loại đột biến
1
L74I
2
3
4
Tổng đột biến chính
T69N
T69S
T215D
3
Tỷ lệ %
Loại thuốc bị kháng
ABC¥, ddI¥
0,93
3
4
2
11
M184I
M184V
K219Q
4
1
2
3
Tổng đột biến phụ
Tần suất
Chính
2
¥
1,39
1,85
0,93
5,10
3TC , FTC¥, ABC, ddI
3TC¥, FTC¥, ABC, ddI
d4T
6
2
1
9
2,78
0,93
0,46
4,17
TDF
TDF
ZDV, d4T
Phụ
¥
Thuốc ARV bị kháng ở mức độ cao
388
Chuyên Đề Nội Khoa