Xem mẫu

  1. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC FLAVONOID VÀ ACID CLOROGENIC TRONG NỮ LANG (VALERIANA HARDWICKII) BẰNG UHPLC-MS Huỳnh Lời*, Nguyễn Thùy Vi*, Trần Hùng** TÓM TẮT Mở đầu: Nữ lang (Valeriana hardwickii Wall. Caprifoliaceae) đã được dùng từ lâu trong y học cổ truyền để điều trị mất ngủ, chống co giật, chống mệt mỏi và rối loạn chu kỳ kinh nguyệt. Ngoài ra, dược liệu này còn dùng ngoài để điều trị côn trùng đốt và các bệnh ngoài da. Cho tới nay, các công trình nghiên cứu về Nữ lang chủ yếu là phân tích các thành phần bay hơi. Ngoài ra, các thành phần khác được phân lập như các iridoid, flavonoid, triterpen. Về định tính, định lượng, chưa có nhiều tài liệu công bố. Mục tiêu: Nghiên cứu này được tiến hành nhằm xây dựng quy trình định lượng các flavonoid có trong Nữ lang bao gồm linarin, neobudofficid, rhoifolin và acid clorogenic bằng phương pháp UHPLC-MS. Phương pháp xây dựng giúp cho việc kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho Dược Điển Việt Nam. Nguyên liệu và phương pháp: Nguyên liệu là cây Nữ lang (V. hardwickii) thu hái mọc hoang tại Cổng Trời (vùng Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt vào tháng 4/2015. Nguyên liệu được định danh bằng cách so sánh về mô tả hình thái thực vật với các thông tin trên các tài liệu tham khảo thực vật học chuyên ngành. Mẫu Valeriana officinalis được thu thập tại vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna, Cộng hòa Áo đuợc thu vào tháng 4 năm 2015. Hệ dung môi và điều kiện MS được tối ưu hóa. Phương pháp được đánh giá với tính tương thích hệ thống, tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, LOD và LOQ theo hướng dẫn của ICH. Kết quả: Hệ dung môi bao gồm: nước acid formic 0,1% (A) – a. formic 0,1% trong acetonitril (B), gradient từ 90% A đến 5% A, thời gian phân tích 14 phút, tốc độ dòng là 0,7 ml/phút và nhiệt độ cột là 30oC và thể tích tiêm mẫu là 3 ml. Điều kiện phân tích khối phổ được thiết lập với thông số capillary voltage ở 0,8 kV; cone voltage là 15 eV, nhiệt độ của mao quản được duy trì ở 350 ºC. Tốc độ khí khử dung môi (desolvation gas) là 300 L/h. Phổ khối của các chất phân tích được ghi nhận ở chế độ ion dương (positive). Sắc kí đồ của các chất phân tích được theo dõi ở cả hai chế độ TIC (total ion current) (MS scan) (m/z 100- 1000) và SIR (single ion recording). Chế độ SIR của acid clorogenic ở m/z 355,31; rhoifolin ở m/z 579,52; neobudofficid ở m/z 739,69; và linarin ở m/z 593,54. Tính tương thích hệ thống đạt với thông số thời gian lưu và diện tích đỉnh các pic nhỏ hơn 2%. Tính tuyến tính với R2 ~ 0,999 và khoảng tuyến tính các hợp chất có nồng độ 0,7-120 mg/ml. Kết quả cho thấy có sự lặp lại trong phương pháp phân tích bằng UHPLC-MS với RSD% < 5%. Tỷ lệ phục hồi 99-106%. Giới hạn phát hiện là của a. clorogenic, rhoifolin, neobudofficid, linarin lần lượt là 0,029; 0,0010; 0,00020; 0,015 mg/ml. Acid clorogenic có trong các bộ phận của V. hardwickii bao gồm lá là 1,76%, trong thân là 8,23% và trong rễ là 1,68%, hàm lượng các flavonoid trong lá V. hardwickii bao gồm rhoifolin là 0,86%, neobudofficid là 0,19% và linarin là 1,95%. Acid clorogenic trong rễ và lá của V. officinalis cũng được định lượng với hàm lượng lần lượt là 5,3% và 1,45%. Kết luận: Phương pháp UHPLC-MS đã được xây dựng và được đánh giá theo hướng dẫn của ICH. Các điều kiện phân tích đã được thiết lập bao gồm các điều kiện về phổ khối, tính tương thích hệ thống tính * Trung Tâm Khoa Học Công Nghệ Dược Sài Gòn (SAPHARCEN), Đại học Y Dược Thành phố. Hồ Chí Minh ** Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Hùng ĐT: 02838295641 Email: tranhung@uphcm.edu.vn 12 Chuyên Đề Dược
  2. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng. Hàm lượng các hợp chất đã được định lượng bao gồm acid clorogenic, rhoifolin, neobudofficid, và linarin trong V. hardwickii và acid clorogenic trong V. officinalis. Từ khóa: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS ABSTRACT QUANTITATIVE ANALYSIS OF FLAVONOIDS AND CHLOROGENIC ACID IN VALERIANA HARDWICKII BY UHPLC-MS Huynh Loi, Nguyen Thuy Vi, Tran Hung * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 12 – 23 Background and objectives: V. hardwickii, “Nữ lang in Vietnamese”, are used in Vietnam as a traditional medicine with anti-convulsant, sedative, anti-fatigue, and anti-dysmenorrheal properties. The topical uses of aerial parts are the treatment of insect bites and various skin diseases. Volatile compounds were reported. Flavonoids, iridoids, terpenoids are also isolated from Valeriana hardwickii. The aim of this study was to develop the UHPLC-MS method for quantitative analysis of flavonoids including linarin, neobudofficide, rhoifolin and chlorogenic acid from Valeriana hardwickii. Material and method: Nữ lang (Valeriana hardwickii) was collected in Cổng Trời (Bidoup - núi Bà), Đà Lạt in April 2015. V. officinalis was colleced in Botanic Garden of Vetmeduni – Vienna in April 2015. The mobile phase and MS conditon were optimized. The analytical method was validated for system suitability, linearity, precision, accuracy, limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) according to International Council on Harmonization (ICH) Guidelines. Results: The method was developed using mobile phase including formic acid 0.1% (A) – formic acid 0.1% in acetonitril (B), gradient from 90% A to 5% A, 14 min run time, 0.7 ml/min flow rate, 30oC column temperature, 3 ml injection volume. MS condition were set as 0.8 kV capillary voltage; 15 eV cone voltage, 350 ºC capillary temperature, 300 L/h desolvation gas, ESI+-MS mode, full scan at m/z 100-1000, SIR (single ion recording) mode. Chromatogram was recorded at m/z 355.31 for chlorogenic acid; at m/z 579.52 for rhoifolin; at m/z 739.69 for neobudofficid; and at 593.54 for linarin. System is suitable for analysis with RSD of retension time and peak area below 2%. The method was found to be linear within the ranges of 0.7-120 mg/ml and R2 ~ 0,999. The precision was determined with RSD < 5%. The LOD was 0.029; 0.0010; 0.00020; and 0.015 mg/ml for chlorogenic acid, rhoifolin, neobudofficid, and linarin respectively. The recovery ranged 99-106%. The content of chlorogenic acid is 1.76%, 8.23% and 1.68% in leaves, stems and roots, respectively. The content of flavonoids in leaves including rhoifolin, neobudofficid, and linarin is 0.86%, 0.19% and 1.95%, respectively. Acid clorogenic from the roots and leaves of V. officinalis was also determined with the content of 5.3% and 1.45%, respectively. Conclusions: The UHPLC-MS method was successfully developed and validated. The MS condition was optimized. System suitability, linearity, range, precision, recovery was determined. The content of chlorogenic acid, rhoifolin, neobudofficid, and linarin in Valeriana hardwickii was also determined. Chlorogenic acid in V. officinalis was successful quantitative. Key words: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS ĐẶT VẤNĐỀ xếp vào họ Caprifoliaceae (họ Cơm cháy)(21,22). Ở châu Á, chi Valeriana có các loài V. Chi Valeriana trước đây thuộc họ pseudofficinalis, V. fauriei, V. jatamansi, V. Valerianaceae (họ Nữ lang) và hiện nay được hardwickii, Nardostachys jatamansi(2,3,18,19). Ở Chuyên Đề Dược 13
  3. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 nước ta có 2 loài: V. hardwickii (Nữ lang) và V. nước, cao ethanol 45% và cao DCM có tác jatamansi (Sì to)(22). Thành phần hóa học chi dụng an thần, giải lo âu (1) . Thử nghiệm trên Valeriana yếu chứa tinh dầu, iridoid dòng tế bào NB18TG2, linarin và (valepotriat), triterpenoid, flavonoid, acid isovaleroxy valtrat hydrin được phân lập phenol, lignan, alkaloid. Ngoài ra còn có từ V. hardwickii không có độc tính trên amino acid (arginin, GABA, glutamin, dòng tế bào này (14) . Theo y học cổ truyền, tyrosin), acid béo, cholin và các chất vô cơ Nữ lang có vị ngọt, đắng, tính bình, tác khác(10). Trên thế giới V. hardwickii mọc ở Ấn động vào 2 kinh: tâm, can. Cây có tác dụng Độ, Trung Quốc, Mianma, Malaysia, ninh tâm, an thần, hoạt huyết, thông Indonesia. Ở nuớc ta, Nữ lang (V. hardwickii) kinh (8) . Hoạt chất từ thân rễ dùng làm mọc ở Ô Quý Hồ, Tả Giàng Phình, núi Hàm thuốc thần kinh tim, chống co thắt; cả cây Rồng, Xà Xén, Sapa, Hà Giang (Đồng Văn, dùng làm thuốc chữa phong thấp, đau dạ Mèo Vạc), Quảng Nam (Trà My: Ngọc Linh), dày, điều kinh, sốt ở trẻ em (23) . Ở Ấn Độ, Kon Tum (Đắk Tô: Ngọc Linh), Lâm Đồng (Đà thân rễ của V. hardwickii được dùng như Lạt)(8). Cho đến nay, nghiên cứu hoá học trên thân rễ V. officinalis để chữa hysteria, động loài V. hardwickii không nhiều. Năm 1989, Đỗ kinh, chứng múa giật, chứng loạn thần Ngọc Thanh và cộng sự đã phân lập được 2 kinh, chấn thương thời chiến, chứng loạn thành phần từ V. hardwickii ký hiệu là N1, N2 thần kinh chức năng. Thân rễ cũng dùng để và chưa xác định được cấu trúc(9). Thành phần làm hương liệu. Ở Trung Quốc, toàn cây và chính trong tinh dầu V. hardwickii var. thân rễ được dùng trị thần kinh suy nhược arnottiana là valeracetat và hàm lượng tinh dầu và mất ngủ; có nơi dùng trị kinh nguyệt là 0,3%(20). Tinh dầu V. hardwickii mọc ở không đều, đòn ngã tổn thương và phong Hymalaya thành phần chính là methyl thấp đau xương(22). Ở Pakistan, Miến Điện linoleate(16). Tinh dầu trong Valeriana hardwickii và Srilanka, V. hardwickii được sử dụng để ở Việt nam có thành phần chủ yếu là bornyl làm gia vị cũng như làm thuốc. Nữ lang acetat(13). Về phân lập, có 2 công trình nghiên được dùng làm thuốc toát mồ hôi, phòng cứu trên cây này. Epoxysesquithujen được bệnh phát lại có định kỳ, chất kích thích, phân lập trong tinh dầu V. hardwickii var. thuốc bổ não, thuốc chống động kinh, thuốc hardwickii(6). Các chất sitosterol, daucosterol, tẩy giun, thuốc an thần, lợi tiểu, thuốc kích syzalterin, 6-methylapigenin, 5-hydroxy-7,4'- thích tình dục, thuốc điều kinh, chống co dimethoxyflavon, genkwanin, acacetin, thắt, trị tiêu chảy(1). Nữ lang V. hardwickii apigenin, quercetin, tricin, farrerol, được dùng với liều 10 g hãm với 100 ml sosakuranetin; 5,3',4'-trihydroxy-7- nước sôi, để nguội uống trong ngày hoặc methoxyflavanon, linarin, neobudofficid, nghiền dược liệu thành bột uống với liều 1-4 neodiosmin, rhoifolin, valeclorin, isovaleroxy g/ ngày, có thể thái nhỏ dược liệu, ngâm cồn valtrat hydrin, acid oleanolic, acid ursolic, 60% với tỷ lệ 1/5, ngày dùng 2-10 g pha bornyl ferulat, bornyl caffeat cũng được phân loãng, ngoài ra còn dùng dạng cao mềm, lập từ V. hardwickii(5,12). Cho đến nay, ít có công ngày dùng 1-4 g(8). Cho đến nay, công trình trình nghiên cứu về tác dụng sinh học của V. nghiên cứu về phân tích định lượng các hardwickii. Cao chiết thân rễ V. hardwickii gây thành phần trong Valeriana hardwickii chưa ra sự ức chế phụ thuộc nồng độ sự co thắt tự đuợc công bố. Công trình nghiên cứu này là phát hay sự co thắt gây bởi kali trên ruột chay lần đầu tiên công bố về định lượng các thỏ, do đó thể hiện tác dụng chống co thắt(1). flavonoid, acid clorogenic trong V. hardwickii Các cao chiết từ V. hardwickii bao gồm cao bằng UHPLC-MS. 14 Chuyên Đề Dược
  4. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học NGUYÊNLIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU acetonitril ở các tỷ lệ sao cho sự tách và độ cân Nguyênliệu đối của đỉnh đạt yêu cầu định lượng. Các điều kiện sắc ký được khảo sát trên hai Nguyên liệu là cây Nữ lang (V. hardwickii) kỹ thuật rửa giải đẳng dòng (isocratic) và thu hái mọc hoang tại Cổng Trời (vùng chương trình dung môi (gradient) để chọn Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt. Nguyên điều kiện sắc ký có sự phân tách các pic. liệu được định danh bằng cách so sánh về mô tả hình thái thực vật với các thông tin Khảo sát điều kiện MS trên các tài liệu tham khảo thực vật học Điều kiện MS được điều chỉnh bằng thủ chuyên ngành(8). Mẫu Nữ lang V. hardwickii công sao cho ion hóa tốt nhất. Các thông số được thu hái 4/2015 và được lưu tại Bộ môn được thăm dò bao gồm điện thế cone (cone Dược liệu, Khoa dược, Đại học Y Dược TP. voltage), điện thế mao quả (capillary voltage), Hồ Chí Minh số lưu mẫu 01-BMDL. nhiệt độ của mao quản, phương thức chọn ion Mẫu Valeriana officinalis được thu thập tại (positive hay negative). vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna, Khảo sát tính tương thích hệ thống Cộng hòa Áo đuợc thu vào tháng 4 năm 2015. Tiến hành: tiêm 6 lần liên tiếp mẫu đối Mẫu được lưu tại Viện thực vật ứng dụng và chiếu có cùng nồng độ, cùng điều kiện. dược liệu (Applied Botany and Yêu cầu: RSD của thời gian lưu; diện tích Pharmacognosy) thuộc trường Vetmeduni với pic cần định lượng phải ≤ 2%; hệ số bất đối số lưu IAB2012-VAL01. (AF) từ 0,5-1,5 và độ phân giải giữa các pic cần Dung môi, hóa chất định lượng Rs ≥ 1,5(4,7). Acid formic, acetonitril được cung cấp bời Tính đặc hiệu Merck (Đức). Acid clorogenic được cung cấp Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu, bởi Merck (Đức), rhoifolin, neobudofficid và mẫu thử và mẫu thử thêm chất đối chiếu. linarin là các hợp chất đối chiếu phân lập trong nghiên cứu trước đây(12), độ tinh khiết Sắc ký đồ mẫu trắng không có các tín hiệu HPLC lần lượt là 97,2%, 99,2% và 98,4%. tại thời gian lưu của các pic cần định lượng Trang thiết bị nghiên cứu trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ Hệ UHPLC Waters® model Acquity® H- của mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương class với đầu dò MS QDa (REF186006511), cột ứng với sắc ký đồ của mẫu đối chiếu. Khi thêm Cortes® C18 (50 × 4,6 mm, 2,7 µm). Phần mềm một lượng chất đối chiếu vào mẫu thử thì có sự Empower 3. tăng về diện tích pic hoặc tỷ số diện tích pic Phương pháp nghiên cứu được chuẩn hóa so với mẫu thử ban đầu. Khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu Tính tuyến tính Khảo sát lần lượt các dung môi là MeOH Pha các hợp chất cần định lượng trong với nồng độ khác nhau, điều kiện nhiệt độ, MeOH để có dung dịch với nồng độ tăng dần. thời gian chiết và số lần chiết sao cho các điều Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. kiện chiết cho hiệu suất chiết cao nhất. Kết quả được đánh giá bằng cách tính Khảo sát pha động và kỹ thuật rửa giải đường hồi qui dựa vào phương pháp bình Khảo sát trên hai dung môi là acid formic phương tối thiểu, phương trình ŷ= ax. 0,1% trong MeOH và acid formic 0,1% trong Chuyên Đề Dược 15
  5. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Yêu cầu: có sự tương quan tuyến tính giữa Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định diện tích pic (hoặc tỷ số diện tích pic chuẩn lượng (LOQ) Hai giới hạn này được tính trên tỷ lệ tín hóa) với nồng độ chất đối chiếu ở khoảng hiệu (S) với tín hiệu nhiễu đường nền (N). nồng độ khảo sát, hệ số R2 ≥ 0,995. LOD và LOQ được tính toán theo tỷ lệ Độ lặp lại S/N=3/1 và 10/1 theo thứ tự dựa theo kết Thực hiện định lượng trên 6 dịch chiết quả thực nghiệm. mẫu thử khác nhau. Độ lặp lại được đánh giá Áp dụng quy trình định lượng dựa vào RSD của hàm lượng các chất phân Sau khi xây dựng quy trình định lượng, tích có trong bột lá Nữ lang. Mỗi mẫu định quy trình được áp dụng để định lượng các lượng 2 lần, lấy kết quả trung bình . (7) thành phần có trong thân và rễ của Nữ lang Độ đúng (V. hardwickii) và trong rễ và lá của V. Độ đúng là tỷ lệ phục hồi giữa nồng độ officinalis. chất đối chiếu tìm thấy so với lượng chất đối KẾT QUẢ chiếu thêm vào. Thêm vào mẫu thử dược liệu Khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu một lượng chất đối chiếu 10%, 20%, 30% so với Khảo sát dung môi chiết hàm lượng chất phân tích có trong mẫu thử, tiến hành định lượng 3 nồng độ, mỗi nồng độ Dung môi chiết đuợc khảo sát với phần thực hiện trên 3 mẫu. trăm MeOH khác nhau. Kết quả cho thấy MeOH 40% cho hiệu suất chiết cao nhất, vì Yêu cầu: tỷ lệ phục hồi trong khoảng 90 – 107%(11). vậy dung môi MeOH 40% dùng để chiết các thành phần định lượng từ lá Nữ lang. Bảng 1: Diện tích đỉnh các polyphenol và dung môi chiết trong khảo sát quy trình định lượng Hợp chất MeOH 10% MeOH 20% MeOH 40% MeOH 60% MeOH 80% MeOH 100% Acid clorogenic 3061530 2721360 3401700 3571785 3061530 3231615 Rhoifoolin 210245 194555 209199 173635 215475 171899 Neobudofficid 16917 18646 18590 15244 16359 18962 Linarin 454553 341823 363642 338187 316369 356369 Khảo sát số lần chiết Khảo sát thời gian chiết Kết quả khảo sát số lần chiết cho thấy chiết Thời gian chiết 30 phút được chọn để 2 lần được chọn để chiết các hợp chất cần định chiết vì cho diện tích đỉnh cao hơn so với lượng trong lá Nữ lang. chiết 15 phút và cũng gần tương đương với Bảng 2: Diện tích đỉnh các polyphenol và số lần chiết 45 phút. chiết trong khảo sát qui trình định lượng Bảng 3: Diện tích đỉnh các polyphenol và thời gian Tỷ lệ % Tỷ lệ % Hợp chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 chiết chiết chiết trong khảo sát quy trình định lượng lần 2 lần 3 Hợp chất 15 phút 30 phút 45 phút Acid Acid 3401120 3571176 3407922 3402031 187110 34020 5,16 0,94 clorogenic clorogenic Rhoifoolin 2092002 125520 29288 5,59 1,30 Rhoifoolin 2092110 2133952 2194202 Neobudofficid 18605 1302 205 6,48 1,02 Neobudofficid 18701 18906 18988 Linarin 364110 14564 10923 3,74 2,80 Linarin 365210 373244 376166 16 Chuyên Đề Dược
  6. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Khảo sát nhiệt độ chiết Hệ dung môi bao gồm: nước acid formic Nhiệt độ chiết đuợc khảo sát ở 30oC, 40oC 0,1% (A) – a. formic 0,1% trong acetonitril và 50oC. Kết quả cho thấy nhiệt độ 40oC cho (B). Chương trình rửa giải gradient thể hiện hiệu quả chiết cao hơn 30oC và cũng tương ở Bảng 5. đương với 50oC. Vậy, nhiệt độ 40oC thích hợp Tốc độ dòng là 0,7 ml/phút và nhiệt độ cho quy trình chiết. cột là 30oC và thể tích tiêm mẫu là 3 ml. Bảng 4: Diện tích đỉnh các polyphenol và nhiệt độ Bảng 5: Chương trình rửa giải của quy trình chiết trong khảo sát quy trình định lượng định lượng Hợp chất 30oC 40oC 50oC Thời gian Pha động Acid clorogenic 3401800 3571890 3575292 0-2 phút 90% A Rhoifoolin 2092528 2094621 2098806 2-3 phút 90% 78% A Neobudofficid 18705 19078.84 19452.93 3-5 phút 78%  75% A Linarin 365283 381355.5 383181.9 5-7 phút 75% A Sau khi khảo sát dung môi chiết, số lần 7-9 phút 75%  5% A 9-14phút 5% A chiết, thời gian chiết và nhiệt độ chiết. Quy Khảo sát điều kiện MS trình chiết được thiết lập như sau: Điều kiện phân tích khối phổ được thiết Cân chính xác khoảng 100 mg bột lá Nữ lập với thông số capillary voltage ở 0,8 kV; lang cho vào ống nghiệm thủy tinh có nắp, cone voltage là 15 eV, nhiệt độ của mao thêm 10 ml MeOH 40%, siêu âm (mức năng quản được duy trì ở 350oC. Tốc độ khí khử lượng 100%) ở nhiệt độ 40 oC trong vòng 30 dung môi (desolvation gas) là 300 L/h. Phổ phút, lọc, bã được chiết lần 2 với 10 ml MeOH khối của các chất phân tích được ghi nhận ở 40%, gộp dịch lọc, cho dịch lọc thu được vào chế độ ion dương (positive). Sắc kí đồ của bình định mức 25 ml, bổ sung dung môi cho các chất phân tích được theo dõi ở cả hai chế đủ thể tích, lọc qua màng lọc PTTE 0,22 µm độ TIC (total ion current) (MS scan) (m/z trước khi phân tích bằng UHPLC. 100-1000) và SIR (single ion recording). Chế Khảo sát pha động và kỹ thuật rửa giải độ SIR của acid clorogenic ở m/z 355,31; Sau khi khảo sát các điều kiện sắc ký, rhoifolin ở m/z 579,52; neobudofficid ở m/z chương trình rửa giải được xây dựng như sau: 739,69; và linarin ở m/z 593,54. Khảo sát tính tương thích hệ thống Bảng 6: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của quy trình định lượng STB N Thành phần tR (phút) k’ α Rs As (µV × s) (biểu kiến) Acid clorogenic TB 1,989 3787040 7817 3,3 1,13 (30 mg/ml) RSD% 0,04 0,73 Rhoifolin TB 5,829 3182400 106680 11,7 1,04 2,86 1,12 (18,75 mg/ml) RSD% 0,02 0,73 Neobudofficid TB 7,11 728291 160595 14,5 1,10 3,75 mg/ml) RSD% 0,07 0,89 Linarin TB 7,846 7998000 84759 16,1 1,04 2,63 1,13 30 mg/ml) RSD% 0,05 1,57 Chuyên Đề Dược 17
  7. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Hình 1: Sắc ký đồ ở chế độ SIR và các phổ khối của các hợp chất tương ứng 18 Chuyên Đề Dược
  8. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Tính đặc hiệu Hình 2: Sắc ký đồ (SIR) trong khảo sát tính đặc hiệu của quy trình định lượng Chuyên Đề Dược 19
  9. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Tính tuyến tính Bảng 7: Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của các chất đối chiếu Acid clorogenic Rhoifolin Neobudofficid Linarin STB STB STB STB C (µg/ml) C (µg/ml) C (µg/ml) C (µg/ml) (µV×s) (µV×s) (µV×s) (µV×s) 120 14978010 75 11991988 15 2780080 120 31876180 60 7544520 37,5 6295994 7,5 1425682 60 15998040 30 3787048 18.75 3182499 3,75 728291 30 7999020 15 1893524 9,38 1610227 1,88 367899 15 4031245 7,5 1074029 4,69 829839 0,938 182169 7,5 1908647 Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến Sau khi xét các hệ số hồi quy, phương tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh với trình tuyến tính thể hiện ở Bảng 8. R2~0,999 và khoảng tuyến tính các chất phân tích thể hiện ở Bảng 8. Bảng 8: Phương trình tuyến tính Hợp chất Phương trình tuyến tính Khoảng tuyến tính (mg/ml) R2 Acid clorogenic ŷ = 124100x 7,5 - 120 0,9999 Rhoifolin ŷ = 158817x 4,69 – 75 0,9994 Neobudofficid ŷ = 184350x 0,938 – 15 0,9998 Linarin ŷ = 265886x 7,5 - 120 0,9995 Độ lặp lại Bảng 9: Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình định luợng (n=6) Hợp chất A. clorogenic rhoifolin neobudofficid linarin Hàm lượng (%) 1,76±0,03 0,86±0,02 0,19±0,005 1,95±0,096 (khối lượng/khối lượng) (RSD = 1,61) (RSD = 2,07) (RSD = 2,42) (RSD = 4,95) Kết quả cho thấy có sự lặp lại trong phương Bảng 10: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy pháp phân tích bằng UHPLC-MS với RSD% < 5%. trình định lượng (n=9) Như vậy, phương pháp đạt độ lặp lại. Tỷ lệ phục hồi Tên hợp chất 10% 20% 30% RSD Khảo sát độ đúng Acid clorogenic 101,1 99,9 104,5 2,3 Tất cả các đỉnh cần định lượng đều có tỷ Rhoifolin 101,5 99,3 103,2 1,9 Neobudofficid 101,3 102,5 98,2 2,0 lệ phục hồi trong giới hạn từ 97 – 105%. Linarin 103,4 102,6 97,5 3,2 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Hình 3: Sắc ký đồ (SIR) trong khảo sát LOD của quy trình định lượng 20 Chuyên Đề Dược
  10. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Kết quả khảo sát LOD và LOQ được trình Bảng 12: Hàm lượng (%) các hợp chất trong lá V. hardwickii bày ở Bảng 11. Trong các polyphenol định A. clorogenic rhoifolin neobudofficid linarin lượng, neobudofficid có LOD thấp nhất với 1,76±0,03 0,86±0,02 0,19±0,005 1,95±0,096 nồng độ 0,0002 mg/ml. Ghi chú: Hàm lượng được tính bằng% (khối lượng/khối lượng), n=6 Bảng 11: Kết quả khảo sát LOD và LOQ của quy Bảng 13: Hàm lượng (%) acid clorogenic trong V. trình định lượng hardwickii và V. officinalis A. Rhoifolin Neobudofficid Linarin Lá Thân Rễ Lá Rễ clorogenic (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) V. V. V. V. V. (mg/ml) hardwickii hardwickii hardwickii officinalis officinalis LOD 0,029 0,0010 0,00020 0,015 1,76±0,03 8,23±0,13 1,68±0,03 5,30±0,09 1,45±0,02 LOQ 0,097 0,0033 0,00067 0,050 Ghi chú: Hàm lượng được tính bằng % (khối lượng/khối Hàm lượng các hợp chất phân tích lượng), n=6 Hình 4: Sắc ký đồ (SIR) của acid clorogenic trong V. hardwickii và V. officinalis Chuyên Đề Dược 21
  11. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 2. Bell CD (2007), "Phylogenetic placement and BÀNLUẬN biogeography of the North American species of Valerianella (Valerianaceae: Dipsacales) based on Phương pháp UHPLC với đầu dò MS chloroplast and nuclear DNA". Molecular Phylogenetics single quadrupole ACQUITY® QDa chưa được and Evolution. 44(3): pp. 929-941. 3. Bell CD, et al. (2005), "Phylogeny and biogeography of áp dụng phổ biến. Một vài công trình công bố Valerianaceae (Dipsacales) with special reference to the South American Valerians". Organisms Diversity & với đầu dò này bao gồm các phân tích acid Evolution. 5(2): pp. 147-159. amin (phenylalanin, tyrosin, tryptophan, 4. Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV. NXB Y Học. 5. Chai SW, et al. (2015), "Chemical constituents from kynurenin) trong chuột , phân tích các (15) whole plants of Valeriana hardwickii". Zhongguo Zhong peptid (bleomycin sulfat, tyrothricin, Yao Za Zhi. 40(20): pp. 4007-11. 6. Chandra SM, et al. (2007), "Epoxysesquithujene, a novel vancomycin HCl, bacitracin)(17). Đầu dò này sesquiterpenoid from Valeriana hardwickii var. cũng được dùng để theo dõi phản ứng, xác hardwickii". Fitoterapia. 78(4): pp. 279-282. 7. Đặng Văn Hòa, et al. (2011), Kiểm nghiệm thuốc. Hà định các tạp trong thuốc, xác định thuốc trừ Nội: NXB Giáo dục Việt Nam. 8. Đỗ Huy Bích, et al. (2004), Cây thuốc và động vật làm sâu, flavonoid trong nuớc ép trái cây, các cao thuốc ở Việt Nam. Hà Nội: NXB Khoa Học và Kỹ chiết thấm qua da(24). Lần đầu tiên, phương Thuật. 9. Đỗ Ngọc Thanh, et al. (1989), "Sơ bộ nghiên cứu quá pháp này được áp dụng trong định lượng các trình tách, chiết valepotriat từ rễ cây Nữ lang". Tạp chí thành phần trong Valeriana hardwickii và định Dược học. 2: pp. 19-20,26. 10. Houghton PJ (1997), Valerian: The Genus Valeriana. lượng acid clorogenic trong V. officinalis. Medicinal and Aromatic Plants - Industrial Profiles, ed. Roland Hardman. Vol. 1. Amsterdam - The Phương pháp được xây dựng với thời gian Netherlands: Harwood Academic, pp.142. phân tích ngằn (dưới 10 phút). Trong nghiên cứu 11. Huber L, (2007) Regulations, Standards and Guidelines, in Validation and Qualification in Analytical này, hệ dung môi được thăm dò sao cho tách Laboratories, Second Edition., CRC Press. p. 9-24. được acid clorogenic ra khỏi đồng phân của nó, 12. Huynh L, et al. (2016), "Iridoids and flavonoids from Valeriana hardwickii Wall". Journal of Pharmacognosy and điều này thể hiện các pic đồng phân này trên sắc Phytochemistry. 5(3): pp. 245. 13. Huynh L, et al. (2013), "Comparative analysis of the ký đố (Hình 4), việc thăm dò này tốn nhiều thời essential oils of Valeriana hardwickii Wall. from Vietnam gian và thừ với nhiều hệ dung môi. and Valeriana officinalis L. from Austria". Journal of Essential Oil Research. 25(5): pp. 409-414. KẾT LUẬN 14. Huỳnh Lời, et al. (2015), "Nghiên cứu về cây Nữ lang Hardwicke III – Độc tính trên dòng tế bào thần kinh Phương pháp UHPLC-MS đã được xây của isovaleroxyvaltrat hydrin và linarin phân lập từ dựng và đánh giá theo hướng dẫn ICH. Hàm Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall. Valerianaceae) và tác dụng chống oxy hoá của Valeriana lượng các hợp chất trong V. hardwickii đã được hardwickii và Valeriana officinalis". Chuyên đề Dược, Y định lượng với acid clorogenic có trong lá là Học TP. Hồ Chí Minh. Phụ bản 19(3): tr. 574-580. 1,76%, trong thân là 8,23% và trong rễ là 15. Jaroslav G, et al. (2016), "Quantitative analysis of phenylalanine, tyrosine, tryptophan and kynurenine in 1,68%, hàm lượng các flavonoid trong lá bao rat model for tauopathies by ultra-high performance gồm rhoifolin là 0,86%, neobudofficid là 0,19% liquid chromatography with fluorescence and mass và linarin là 1,95%. Acid clorogenic trong lá và spectrometry detection". Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 117: pp. 85-90. rễ của V. officinalis cũng đuợc định lượng với 16. Jayashankar D, et al. (2011), "Volatile Constituents of hàm lượng lần lượt là 5,30% và 1,45%. Valeriana hardwickii Wall. Root Oil from Arunachal Pradesh, Eastern Himalaya". Records of Natural Products. TÀI LIỆU THAM KHẢO 5(1): pp. 70-73. 1. Bashir S, et al. (2011), "Antispasmodic and 17. Matthias DH, et al. (2016), "Implementation of a Antidiarrheal Activities of Valeriana hardwickii Wall. single quad MS detector in routine QC analysis of Rhizome Are Putatively Mediated through Calcium peptide drugs". Journal of Pharmaceutical Analysis. Channel Blockade". Evid Based Complement Alternat 6(1): pp. 24-31. Med. 2011: pp. 304960. 22 Chuyên Đề Dược
  12. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học 18. Meyer FG (1965), "New species of Valeriana from 23. Võ Văn Chi (2010), Tự điển cây thuốc Việt Nam. Hà Colombia, Ecuador, and Peru". Brittonia. 17: pp. 112- Nội: NXB Y Học. 120. 24. Xiaodong B, et al. (2016), "The emergence of low-cost 19. Meyer FG (1979), "A new species of Valeriana compact mass spectrometry detectors for (Valerianaceae) from Venezuela". Brittonia. 31(1): pp. chromatographic analysis". TrAC Trends in Analytical 101-103. Chemistry. 82: pp. 22-34. 20. Sati S, et al. (2005), "Essential oil composition of Valeriana hardwickii var. arnottiana from the Himalayas". Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Flavour and fragrance journal. 20: pp. 299-301. 21. Takhtajan A (2009), Flowering plants. Springer Science & Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Business Media. Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019 22. Võ Văn Chi (2002), Từ điển thực vật thông dụng. Hà Nội: NXB Khoa Học - Kỹ Thuật. Chuyên Đề Dược 23
nguon tai.lieu . vn