Xem mẫu

  1. THỰC HANH ̀ Môn CNSH trong BVTV ̀ ́ ̣ Bai 1. PCR phat hiên begomovirus 1. Giới thiêu ̣ Begomovirus là các virus có bộ gien DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2.6 – 2.8 kb. Begomovirus có thể có bộ gien đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép (gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B) AV2 AC4 Hình 1. Tổ chức bộ gien phân tử DNA-A của begomovirus. CP = coat protein. REn = replication DNA-A enhancer. TrAP = transcriptional ~2.7kb AV1 (CP) activator protein. Rep = replication AC1 (Rep) associated protein. (Rep) AC3 (REn) AC2 (TrAP) ̀ 2. Môi PCR Sử dung môt căp môi chung (degenerate primers) được thiêt kế ơ vung bao thủ cua ̣ ̣ ̣ ̀ ́ ̀ ̉ ̉ phân tử DNA-A để phat hiên virus ́ ̣ Kích thước Mồi Trình tự (5’ – 3’) Vị trí (bp) Tham khảo BegoAFor1 TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* ~1200 Hình 2 BegoARev1 ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC* * Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T), K (G / T) và i = inosine AC2 AC4 AV2 AC3 AC1 AV1 (CEGPCKVQS) (IPT/A/SIF/VLCNP) DNA-A BegoAFor1 ~ 1.2 kb BegoARev1 Hình 2. Sơ đồ tổ chức bộ gien DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của begomovirus và vị trí tương đối của cặp mồi BegoAFor1 và BegoARev1. Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các ORF. Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với 2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1. 1
  2. 3. Chiêt DNA tông số từ mô cây. ́ ̉ Chuẩn bị: 1. Đêm chiêt (đệm CTAB) ̣ ́ 2. Chloroform: Isoamylalcolhol (24:1) 3. β Mercaptoethanol (BME) 4. Ethanol 70% 5. 2-Propanol 6. Chày, cối sứ (hoăc tube 1.5 mL và chay nhựa): rửa sạch ngâm trong dung dịch ̣ ̀ NaOH 3M (1 ngày), rửa lại bằng nước cất rồi hấp vô trùng. 7. Tube 1,5ml ́ ́ ́ 8. But viêt kinh 9. Pipet (1000, 200) và tip 10. May li tâm để ban (15000 g) ́ ̀ 11. Bể nhiêt ̣ Quy trình chiết 1. Ủ đệm chiết CTAB (cứ 1 mẫu chiết cần 1ml đệm) đã bổ sung BME (với tỉ lệ 1ml đệm CTAB :10 μL BME) trong bể nhiệt ơ nhiệt độ 60oC trong 30 phút. 2. Lấy 0,1 g mô lá bệnh nghiền với 1ml CTAB bằng chày cối sứ (nghiền đến khi dung dịch thu được là một thể đồng nhất). Hút 700 mL dịch chiết cho vào tube 1,5 ml. 3. Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch trên tủa (600 μL) cho vao tube ̀ mới 4. Cho Chloroform: Isoamylalcolhol (24 :1) vào tube với tỉ lệ thể tích tương đương. Đảo đều tube. 5. Li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trên tủa (400 μL). 6. Lặp lại các bước 3, 4, 5 thêm một lần nữa. 7. Cho thể tich tương đương (400 μL) 2-propanol vao tube. Đảo đều tube và để ́ ̀ ̣ ́ lanh (-20 oC) 30 phut. 8. Li tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ dịch phía trên, thu lấy cặn DNA ̉ tông sô. ́ 9. Rửa cặn bằng Ethanol 70% hai lần (môi lân 0.7 – 1 mL) ̃ ̀ 10. Làm khô căn DNA bằng cách mơ nắp tube, để ơ nhiệt độ phòng trong 30 phút ̣ (nơi sach). ̣ 11. Hoa căn trong 50 μL nước cất 2 lân vô trùng hoăc đêm TE và bao quan dich ̀ ̣ ̀ ̣ ̣ ̉ ̉ DNA ơ -20 oC 4. Thực hiên phan ứng PCR ̣ ̉ Chuân bị ̉ 1. Tube PCR 0,5 ml hấp khử trùng. 2. Đá lanh vun (nêu không có hôp lanh chuyên dung) ̣ ̣ ́ ̣ ̣ ̣ ́ 3. May PCR 2
  3. 4. Pipet (200, 20, 10, 2.5) và tip tương ứng ́ Thao tac ̀ ̃ ́ ̀ ̀ Cho vao môi tube PCR cac thanh phân sau: Thành phần Thể tích cần lấy (μL) Dd H2O 19.3 ̣ Đêm PCR (10X) 2.5 ̃ ̣ dNTPs (10 mM môi loai) 0.5 ̀ ̀ Môi xuôi dong: BegoAFor1 (20 μM) 1.0 Môi ngược dong: BegoARev1 (20 μM) ̀ ̀ 1.0 DNA polymerase (Taq) (5U/ μL) 0.2 DNA tông số ̉ 0.5 Tông thể tich ̉ ́ 25 Cho vao may PCR với điêu kiên phan ứng PCR ̀ ́ ̀ ̣ ̉ Nhiệt độ oC Thời gian Số chu kỳ Biên tinh khơi đâu ́ ́ ̀ 92 4 phút 1 92 35 giây Cac chu kỳ tông hợp ́ ̉ 50 35 giây 30 72 1 phút ́ ́ Kêt thuc 72 5 phút 1 5. Kiêm tra kêt quả ̉ ́ Chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm RT-PCR. Chuẩn bị 1. Pha đệm điện di TAE 1X 2. Chuẩn bị bản gel 1%: Cân 1g agarose cho vào trong lọ, bổ sung 100 mL TAE 1x vào lo. Cho lọ vào lò vi sóng để hoà tan agarose. Sau khi agarose đã tan hoàn toàn, bổ ̣ sung 1 μL Ethidium Bromide, lắc đều, để lọ ơ nhiệt độ phòng tới nhiêt độ khoang ̣ ̉ 60 oC. 3. Dán băng dính xung quanh khay gel và đặt lựơc. Đổ gel vào khuôn (day khoang 1 ̀ ̉ cm). Để khuôn ơ nhiệt độ phòng 30 phut để đông gel. ́ 4. Lấy các tube PCR 5. Cho vào mỗi tube 5 μL đêm cai gel (Loading Dye x6, trôn đêu và spin trong 5 giây. ̣ ̀ ̣ ̀ Chay điên di và kiêm tra kêt quả ̣ ̣ ̉ ́ 3
  4. 1. Sau 30 phút để khuôn ơ nhiệt độ phòng thì tiến hành rút lược (cầm chính giữa lược, rút đều tay để không vỡ giếng), bỏ băng dính ơ xung quanh khuôn gel. 2. Đặt cả khay khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE 1x phủ ngập gel (gel ngập sâu khoảng 1mm). 3. Nhỏ 15 μL mẫu PCR vào giếng Ngoài các mẫu PCR, luôn phai nhỏ thêm 1 giếng ̉ DNA marker làm chuẩn. 4. Cắm nguồn điện cho máy điện di, đăt điện thế 100V và thời gian 30 phut. ̣ ́ 5. Sau 30 phút, tắt máy điện di, đặt bản agarose lên máy phat tia cực tim và quan sát ́ ́ kêt qua. San phâm PCR với căp môi BegoA For1/BegoARev1 sẽ có kich thước ~1.2 ́ ̉ ̉ ̉ ̣ ̀ ́ kb ̣ ̉ 6. Chup anh 4
  5. ̀ ̉ Bai 2. ELISA kiêm tra PRSV 1. Giới thiêu ̣ Pappaya ringspot virus (PRSV) là virus RNA, thuôc chi Potyvirus. Virus gây bênh đôm ̣ ̣ ́ hinh nhân trên đu đủ và kham lá trên nhiêu cây hạ bâu bí ̀ ̃ ̉ ̀ ̀ Kỹ thuât kiêm tra PRSV là PTA-indirect ELISA dung khang huyêt thanh thô ̣ ̉ ̀ ́ ́ 2. Vât liêu và chuân bị ̣ ̣ ̉ 1. Chày và cối sứ (để nghiền mẫu) 2. Pipet tự động cỡ 20 µL (để hút kháng huyết thanh, kháng thể thứ cấp), cỡ 100 (hoặc 200) µL (để hút dịch chiết cây, dịch kháng thể, dịch chất nền) và 1000 µL (để hút các loại đệm) 3. Cốc mỏ hoặc lọ cỡ khoảng 50 - 100 mL (để ủ dịch kháng huyết thanh) 4. Nước cất 5. Máy đọc ELISA (tùy chọn), tủ ấm 6. Mẫu cây khỏe và mẫu cây biết rõ nhiễm bệnh (làm đối chứng). Đối với mỗi lần thử, luôn cần 3 mẫu cây khỏe và 3 mẫu cây bệnh. ́ 3. Thao tac 1. Cố định dịch cây vào bản ELISA: Nghiền khoảng 0,1 g mô lá với 1 mL đệm chiết mẫu bằng chày và cối sứ sạch. Dùng pipet cho 100 µL dịch chiết vào giếng của bản ELISA (có thể cắt đầu típ để dễ hút dịch chiết). Nếu có điều kiện, dịch chiết nên được cho vào tube eppendorf loại 1,5 hoặc 2 mL và li tâm để lắng cặn. Ủ bản ELISA trong hộp ẩm qua đêm ơ 4-6 OC trong hộp ẩm. Sáng hôm sau, rửa bản ELISA 3 lần bằng đệm rửa. Ở bước này, protein của cây và virus trong dịch cây (nếu có) sẽ liên kết không đặc hiệu vào thành giếng. 2. Cố định kháng thể thỏ đặc hiệu virus vào bản ELISA: Nghiền mô lá cây khỏe với đệm PBS-T-P-O (tỷ lê nghiền là 1/10, chẳng hạn 1 g mô lá và 10 mL đệm cho 1 bản ELISA). Dịch chiết được nên được li tâm để loại bỏ cặn. Hoà kháng huyết thanh virus trong dịch chiết cây khỏe và ủ ơ 37 OC khoảng 45 phút để hấp thụ chéo các kháng thể không đặc hiệu. Sau khi ủ, dùng pipet cho 100 µL dịch kháng huyết thanh đã hấp thụ chéo vào giếng ELISA và ủ bản ELISA ơ 37 OC 2-4 giờ trong hộp ẩm. Sau khi ủ, rửa bản ELISA như ơ bước 1. Ở bước này, kháng thể thỏ đặc hiệu virus sẽ liên kết với virus. 3. Cố định kháng thể thứ cấp liên kết enzyme (đặc hiệu kháng thể thỏ) vào bản ELISA: Hoà kháng thể thứ cấp liên kết enzyme trong đệm PBS-T-P-O. Dùng pipet cho 100 µL dịch kháng thể thứ cấp liên kết vào giếng ELISA và ủ bản ELISA ơ 37 OC 2-4 giờ trong hộp ẩm. Sau khi ủ, rửa bản ELISA như ơ bước 1 và 2 lần bằng nước cất. Ở bước này, kháng thể thứ cấp sẽ liên kết với kháng thể thỏ. 4. Cố định chất nền vào bản ELISA và đánh giá kết quả: Hòa 1 viên chất nền với 10 mL đệm chất nền. Dùng pipet cho 100 µL dịch chất nền vào giếng ELISA và 5
  6. ủ bản ELISA ơ nhiệt độ phòng trong hộp ẩm. Hộp cần phải để trong tối để giảm tốc độ tự phản ứng của chất nền. Quan sát phản ứng sau 30 phút, 60 phút, 90 phút. Các giếng xuất hiện màu vàng là các giếng chỉ thị mẫu nhiễm virus. Màu của phản ứng có thể được lượng hóa bằng máy đọc ELISA, đo ơ bước sóng 405 nm. ̣ ̀ Đêm dung trong PTA-ELISA ̣ ́ ̃ ̣ Đêm chiêt mâu = đêm carbonate (pH 9.6) • 1.59 g sodium carbonate (Na2CO3) • 2.93 g sodium bicarbonate (NaHCO3) • 0.20 g sodium azide (NaN3) • Hoa trong 900 ml H2O, điêu chinh pH = 9.6 với HCl và lên thể tich 1 L. ̀ ̀ ̉ ́ ̣ Đêm PBS (pH 7.4) phosphate buffer saline • 8.0 g sodium chloride (NaCl) • 0.2 g monobasic potassium phosphate (KH2PO4) • 1.15 g dibasic sodium phosphate (Na2HPO4) • 0.2 g potassium chloride (KCl) • 0.2 g sodium azide (NaN3) • Hoa tron 900 ml H2O, điêu chinh pH = 7.4 với HCl hoăc NaOH và lên thể tich 1 L ̀ ̀ ̉ ̣ ́ Đêm rửa (đêm PBS-Tween (PBST)) ̣ ̣ • PBS + 0.5 ml Tween 20 trên lit ́ Đệm PBS-T-P-O (= đêm Conjugate) ̣ • PBST + 2% PVP + 0.2% egg albumin (Sigma A-5253) Đêm cơ chât (Substrate buffer) ̣ ́ • 97 ml diethanolamine • 600 ml H2O • 0.2 g sodium azide (NaN3) • Điêu chinh pH = 9.8 với HCl và lên thể tich 1 L ̀ ̉ ́ Đêm được bao quan ở 4 ° C trong it nhât 2 thang. ̣ ̉ ̉ ́ ́ ́ 6
nguon tai.lieu . vn