Xem mẫu

  1. BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN    10TCN               TIÊU CHUẨN NGÀNH 10TCN 835:2006 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of monensin content by high - performance liquid chromatographic method HÀ NỘI - 2006
  2. TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 835 : 2006 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of monensin content by high - performance liquid chromatographic method (Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNN-KHCN ngày tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) 1. Ph¹m vi ¸p dông Tiªu   chuÈn   nµy   ¸p   dông   ®Ó   ph©n   tÝch   hµm   lîng   kh¸ng  sinh monensin trong thøc ¨n ch¨n nu«i b»ng ph¬ng ph¸p  s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC). Giíi h¹n ph¸t hiÖn  cña ph¬ng ph¸p lµ 40mg/kg.  2. Tµi liÖu viÖn dÉn C¸c tµi liÖu viÖn dÉn sau ®©y rÊt cÇn thiÕt cho viÖc  ¸p dông tiªu chuÈn. §èi víi c¸c tµi liÖu viÖn dÉn ghi  n¨m ban hµnh th× ¸p dông phiªn b¶n ®îc nªu. §èi víi  c¸c tµi liÖu viÖn dÉn kh«ng ghi n¨m ban hµnh th× ¸p  dông phiªn b¶n míi nhÊt, bao gåm c¶ c¸c söa ®æi: TCVN   4851   (ISO   3696).   Níc   dïng   ®Ó   ph©n   tÝch   trong  phßng thÝ nghiÖm. Yªu cÇu kü thuËt vµ ph¬ng ph¸p thö. ISO 6497:2002 (E). Animal feeding stuffs ­ Sampling.  3. Nguyªn t¾c Monensin  trong mÉu thøc ¨n ch¨n nu«i ®îc t¸ch chiÕt  b»ng   metanol,   sau   ®ã   t¹o   dÉn   xuÊt   b»ng   2,4  dinitrophenylhydrazine   (DNP)   trong   m«i   trêng   axit   ë  55oC, t¸ch vµ ®Þnh lîng trªn hÖ thèng s¾c ký láng hiÖu  n¨ng cao víi detector UV ë bíc sãng 392nm.  4. ThiÕt bÞ, dông cô 4.1. M¸y nghiÒn mÉu phßng thÝ nghiÖm. 4.2. Sµng phßng thÝ nghiÖm, cã kÝch thíc lç sµng 1,00  mm vµ 3,00 mm. 4.3. C©n ph©n tÝch cã ®é chÝnh x¸c 0,0001 g. 4.4. C©n kü thuËt cã ®é chÝnh x¸c 0,01 g. 2
  3. 4.5.   M¸y   ly   t©m   l¹nh   cã   tèc   ®é   3000   vßng/phót,   sö  dông èng ly t©m dung tÝch 30 ml. 4.6.  èng   ly   t©m,   dung   tÝch   30   ml   b»ng   polypropylen  hoÆc b»ng thuû tinh, cã n¾p ®Ëy. 4.7. Tñ Êm, cã kh¶ n¨ng duy tr× nhiÖt ®é æn ®Þnh ë  55oC ± 1oC. 4.8. M¸y l¾c trßn hoÆc m¸y l¾c ngang cã thÓ ®¹t tèc  ®é 250 vßng/phót. 4.9. èng nghiÖm dung tÝch 10ml cã nót xo¸y. 4.10. B×nh ®Þnh møc dung tÝch 10, 100, 1000 ml. 4.11. Pipet tù ®éng ®iÒu chØnh ®îc tõ  1ml ®Õn 30 ml. 4.12. Micropipet dung tÝch tõ 10µl ®Õn 100  µl vµ tõ  200µl ®Õn 1000 µl. 4.13. Hót dung m«i tù ®éng 2 ml, 10 ml, 20 ml. 4.14. M¸y l¾c èng nghiÖm (Vortex mixer). 4.15. èng ®ong 1000ml. 4.16. BÓ siªu ©m. 4.17. B¬m  hót ch©n kh«ng. 4.18. Mµng läc syranh cã kÝch thíc 0,45 µm. 4.19. B×nh nãn dung tÝch 125ml. 4.20. Lä nhá ®ùng dÞch mÉu chuyªn dông cho HPLC, cã  n¾p vÆn PTFE . 4.21. ThiÕt bÞ trén mÉu phßng thÝ nghiÖm lo¹i Hobart  Model C 100 T hoÆc t¬ng ®¬ng. 4.22. ThiÕt bÞ chia mÉu: ThiÕt bÞ chia ®«i hoÆc chia t mÉu: vÝ dô nh thiÕt bÞ  chia t h×nh nãn, thiÕt bÞ chia nhiÒu ng¨n cã hÖ thèng  ph©n   h¹t   hoÆc   c¸c   thiÕt   bÞ   chia   kh¸c   ®¶m   b¶o   ph©n  chia mÉu thÝ nghiÖm thµnh mÉu thö ®ång nhÊt. 4.23. Hép ®ùng mÉu cã n¾p kÝn. 4.24. HÖ thèng HPLC gåm cã: 4.24.1. M¸y s¾c kÝ láng hiÖu n¨ng cao, b×nh chøa dung  m«i, hÖ thèng b¬m mÉu, detector UV ®Æt ®îc ë bíc sãng  392nm, m¸y ghi hoÆc bé tÝch ph©n. 3
  4. 4.24.2. Cét ph©n tÝch HPLC pha ®¶o cã kÌm cét b¶o vÖ   ChiÒu dµi                         150mm   §êng kÝnh trong            4,6mm H¹t nhåi                           C 18; 5 µm  hoÆc t¬ng ®¬ng 5. Hãa chÊt vµ thuèc thö 5.1. Ho¸ chÊt ChØ sö dông ho¸ chÊt ®îc c«ng nhËn ®¹t chÊt lîng tinh  khiÕt ph©n tÝch vµ níc cÊt cÊp h¹ng 1 theo TCVN 4851  (ISO 3696). C¸c dung m«i ph¶i ®¹t chÊt lîng ®Ó dïng  cho ph©n tÝch HPLC. 5.1.1. Metanol. 5.1.2. Axit acetic (100%). 5.1.3. Acetonitrile  5.1.4. ChÊt chuÈn monensin, d¹ng muèi natri monensin,  lo¹i tinh khiÕt, cã kÌm theo giÊy chøng nhËn hµm  l­ îng.  5.2. Thuèc thö 5.2.1. Tricloacetic axit (TCA), dung dÞch 500mg/ml. C©n 50g TCA chÝnh x¸c ®Õn 0,01g cho vµo b×nh ®Þnh møc  100ml, hßa tan vµ ®Þnh møc b»ng níc cÊt. L¾c kü dung  dÞch. 5.2.2. Thuèc thö DNP, dung dÞch 1mg/ml trong metanol. C©n   100mg   DNP   chÝnh   x¸c   ®Õn   1mg   vµo   b×nh   ®Þnh   møc  100ml, hßa tan vµ ®Þnh møc ®Õn v¹ch b»ng metanol. L¾c  kü dung dÞch. 5.2.3. Pha ®éng cho HPLC. Hçn   hîp   metanol:   dung   dÞch   axit   acetic   1,5%   tØ   lÖ  90:10 theo thÓ tÝch (v/v). 5.2.3.1.   Dung   dÞch   axit   acetic   1,5%   trong   níc,   theo  tØ lÖ thÓ tÝch (v/v). Cho   15ml   axit   acetic   (5.1.2)   vµo   b×nh   ®Þnh   møc  1000ml. Thªm níc cÊt ®Õn v¹ch ®Þnh møc. L¾c ®Òu dung  dÞch. 5.2.3.2. Hçn hîp pha ®éng. 4
  5. Cho 900ml metanol vµo èng ®ong dung tÝch 1000ml. Thªm  tiÕp 100ml  dung dÞch axit  acetic  1,5%  (5.2.3.1).  Sau  ®ã   läc   hçn   hîp   dung   m«i   thu   ®îc   qua   phÔu   hót   ch©n  kh«ng víi mµng läc cã kÝch thíc lç 0,45  µm, siªu ©m  ®uæi khÝ ë nhiÖt ®é thêng trong 30 phót. 5.2.4. Dung dÞch chuÈn 5.2.4.1. Dung dÞch chuÈn gèc 1000µg/ml Tïy theo hµm lîng monensin ghi trong giÊy chøng nhËn  (5.1.4),   c©n   mét   lîng   nhÊt   ®Þnh   chÊt   chuÈn   natri  monensin   chÝnh   x¸c   ®Õn   0,1mg   cho   vµo   b×nh   ®Þnh   møc  dung tÝch 100ml,  pha lo∙ng vµ ®Þnh møc b»ng metanol  ®Ó   sao   cho   thu   ®îc   dung   dÞch   gèc   cã   nång   ®é  1000µg/ml. Dung dÞch chuÈn gèc ®îc b¶o qu¶n trong lä  n©u ë 40C, cã thÓ sö dông ®îc trong vßng 2 tuÇn. 5.2.4.2. Dung dÞch chuÈn lµm viÖc 100µg/ml. Hót   chÝnh   x¸c   10ml   dung   dÞch   chuÈn   gèc(5.2.4.1)   vµo  b×nh ®Þnh møc 100ml, pha lo∙ng vµ ®Þnh møc ®Õn v¹ch  b»ng metanol. L¾c ®Òu. 6. LÊy mÉu vµ chuÈn bÞ mÉu 6.1. LÊy mÉu Ph¬ng   ph¸p   lÊy   mÉu   kh«ng   quy   ®Þnh   trong   tiªu   chuÈn  nµy, nªn lÊy mÉu theo ISO 6497:2002. §iÒu quan träng  lµ   mÉu   göi   ®Õn   phßng   thÝ   nghiÖm   ph¶i   lµ   mÉu   trung  thùc vµ cã tÝnh ®¹i diÖn, kh«ng bÞ h h¹i hoÆc bÞ biÕn  ®æi   thµnh   phÇn   trong   qu¸   tr×nh   vËn   chuyÓn   vµ   b¶o  qu¶n. Khèi lîng mÉu ph©n tÝch ph¶i kh«ng ®îc Ýt h¬n  500 gam. 6.2. ChuÈn bÞ mÉu 6.2.1. MÉu ë d¹ng bét mÞn NÕu mÉu thÝ nghiÖm ë d¹ng bét lät hoµn toµn qua sµng  cã   kÝch   thíc   lç  sµng   1,00   mm   th×   trén   thËt   ®Òu   mÉu  (500 gam) b»ng m¸y trén phßng thÝ nghiÖm lo¹i Hobart  (hoÆc t¬ng ®¬ng) trong vßng 10 phót. Sau ®ã chia hçn  hîp b»ng thiÕt bÞ chia ®«i hoÆc thiÕt bÞ chia t  cho  ®Õn khi thu ®îc lîng mÉu thö kh«ng díi 100 gam.  6.2.2. MÉu cã kÝch thíc h¹t võa 5
  6. 6.2.2.1. NÕu mÉu thÝ nghiÖm kh«ng lät hÕt qua sµng cã  kÝch thíc lç sµng 1,00 mm nhng lät hoµn toµn qua sµng  cã kÝch thíc lç 3,00 mm th× trén thËt ®Òu mÉu (kh«ng  Ýt h¬n 500 gam)  b»ng m¸y trén phßng thÝ nghiÖm lo¹i  Hobart (hoÆc t¬ng ®¬ng) trong vßng 10 phót. 6.2.2.2. Dïng thiÕt bÞ chia ®«i hoÆc thiÕt bÞ chia t mÉu   ®∙   trén   ®Òu   (6.2.2.1)   cho   ®Õn   khi   thu   ®îc   lîng  mÉu   thö   kh«ng   díi   100   gam.   NghiÒn   lîng   mÉu   nµy   cÈn  thËn trong  m¸y nghiÒn (4.1) cho dÕn khi mÉu lät hoµn  toµn qua sµng cã kÝch thíc lç sµng 1,00 mm. 6.2.3. MÉu cã kÝch thíc h¹t to. 6.2.3.1. NÕu mÉu kh«ng lät qua sµng cã kÝch thíc lç  sµng   3,00   mm   th×   cÇn   nghiÒn   mÉu   (kh«ng   Ýt   h¬n   500  gam) trªn m¸y nghiÒn (4.1) cho ®Õn khi mÉu lät hoµn  toµn   qua   sµng  cã   kÝch  thíc   lç   sµng   3,00  mm,  sau  ®ã  trén thËt ®Òu mÉu b»ng m¸y trén phßng thÝ nghiÖm lo¹i  Hobart (hoÆc t¬ng ®¬ng) trong vßng 10 phót. 6.2.3.2. Dïng thiÕt bÞ chia ®«i hoÆc thiÕt bÞ chia t mÉu   ®∙   trén   ®Òu   (6.2.3.1)   cho   ®Õn   khi   thu   ®îc   lîng  mÉu   thö   kh«ng   díi   100   gam.   NghiÒn   lîng   mÉu   nµy   cÈn  thËn trong  m¸y nghiÒn (4.1) cho ®Õn khi mÉu lät hoµn  toµn qua sµng cã kÝch thíc lç sµng 1,00 mm. C¸c mÉu thö ®îc b¶o qu¶n trong c¸c lä ®ùng mÉu (4.20)  ë ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 2 – 250C, n¬i kh« r¸o. Chó ý: Nªn nghiÒn, trén mÉu trong c¸c phßng cã th«ng  giã, nªn ®eo kÝnh, khÈu trang vµ g¨ng tay b¶o vÖ. 7. C¸ch tiÕn hµnh 7.1. §êng chuÈn Hót chÝnh x¸c lÇn lît 10, 20, 50, 100, 200 vµ 400µl  tõ   dung   dÞch   chuÈn   lµm   viÖc   (100µg/ml)   cho   vµo   èng  nghiÖm (4.9), pha lo∙ng ®Õn 700µl b»ng metanol vµ t¹o  dÉn   xuÊt   nh  c¸c   bíc   tiÕn   hµnh   ë   môc   7.2.   C¸c   dung  dÞch   trªn   sÏ   cã   nång   ®é   tõ   1µg/ml   ®Õn   40µg/ml   t¬ng  øng trªn ®å thÞ chuÈn.  7.2. ChiÕt mÉu vµ t¹o dÉn xuÊt C©n chÝnh x¸c ®Õn 0,1mg tõ 5,0g­10,0g mÉu thö ®∙ ®îc  nghiÒn mÞn theo môc 6 (tuú theo hµm lîng kh¸ng sinh  6
  7. cã trong mÉu) cho vµo b×nh nãn 125ml, thªm tiÕp 50ml  metanol. TiÕn hµnh chiÕt monensin b»ng c¸ch l¾c trªn  m¸y l¾c ngang (4.8) trong thêi gian 1 giê víi tèc ®é  250vßng  /phót.  LÊy 10ml phÇn dÞch trong  ë phÝa trªn  cho vµo èng ly t©m (4.6) vµ ly t©m trong 10 phót ë  tèc ®é 3000 vßng/phót. Hót 700µl dÞch ë phÝa trªn èng  ly t©m cho vµo èng nghiÖm (4.9). Thªm tiÕp 100µl dung  dÞch   TCA   (500mg/ml).   L¾c   èng   nghiÖm   trong   20   gi©y  trªn m¸y l¾c (4.8), sau ®ã ®Ó èng nghiÖm ë nhiÖt ®é  phßng   trong   10   phót.   Thªm   tiÕp   200µl   thuèc   thö   DNP  (1mg/ml) vµo èng nghiÖm, vµ l¾c 20 gi©y trªn m¸y l¾c  (4.8). §Æt èng nghiÖm vµo tñ Êm cã nhiÖt ®é æn ®Þnh  55oC (4.7) trong 20 phót. Lµm nguéi èng nghiÖm vµ dïng  10µl dung dÞch nµy ®Ó b¬m vµo hÖ thèng HPLC. 7.3. ChuÈn bÞ mÉu tr¾ng MÉu   tr¾ng  lµ   mÉu   thøc  ¨n   ch¨n  nu«i   ®îc   x¸c   ®Þnh  lµ  kh«ng cã monensin. MÉu tr¾ng ®îc chuÈn bÞ t¬ng tù nh  mÉu thö theo môc 7.2. 7.4. ChuÈn bÞ mÉu ®Ó x¸c ®Þnh ®é thu håi  ViÖc x¸c ®Þnh ®é thu håi ®îc chuÈn bÞ b»ng c¸ch cho  mét lîng dung dÞch chuÈn cã nång ®é thÝch hîp ®îc pha  tõ   dung   dÞch   gèc   vµo   5g   mÉu   tr¾ng  (7.3)   ®Ó   ®¶m   b¶o  mÉu cã hµm lîng monensin n»m trong d∙y ®å thÞ chuÈn,  mÉu ®îc ®Ó yªn trong 30 phót tríc khi tiÕn hµnh chiÕt  xuÊt. Sau ®ã tiÕp tôc qu¸ tr×nh chiÕt mÉu vµ t¹o dÉn  xuÊt t¬ng tù nh ®èi víi mÉu thö theo môc 7.2. 7.5. Ph©n tÝch trªn HPLC 7.5.1. §iÒu kiÖn s¾c ký:  NhiÖt ®é cét 30oC Detector detector UV bíc sãng 392 nm Tèc ®é dßng   1 ml/phót ThÓ tÝch b¬m mÉu  10 µl 7.5.2. TiÕn hµnh 7.5.2.1. Nªn sö dông b¶o vÖ cét, viÖc sö dông b¶o vÖ  cét   kh«ng   cã   bÊt   cø   ¶nh   hëng   nµo   ®Õn   kÕt   qu¶   ph©n  tÝch.  7.5.2.2.   C©n   b»ng   hÖ   thèng   s¾c   ký   b»ng   pha   ®éng  (5.2.3) 30 phót tríc khi b¬m mÉu. 7
  8. 7.5.2.3. Quy tr×nh b¬m mÉu theo thø tù nh  sau: dÞch  mÉu   tr¾ng,   c¸c   dung   dÞch   chuÈn,   dÞch   mÉu   thu   håi,  dÞch mÉu thö, c¸c dung dÞch chuÈn. Chó   ý:   CÇn   b¬m   c¸c   dÞch   chuÈn   tríc   vµ   sau   mçi   ®ît  ph©n   tÝch,   kh«ng   nªn   ®Ó   qu¸   20   lÇn   b¬m   mÉu   cho   mçi  ®ît ph©n tÝch. NÕu qu¸ 20 lÇn th× ph¶i b¬m c¸c dung  dÞch chuÈn thªm lÇn n÷a vµo kho¶ng gi÷a ®ît b¬m mÉu. 7.5.2.4. X¸c ®Þnh diÖn tÝch pic ®èi víi c¸c dung dÞch  chuÈn vµ dung dÞch mÉu thö t¬ng øng 7.5.2.5. Sau khi ch¹y m¸y ph¶i lµm s¹ch hÖ thèng HPLC  b»ng   hçn   hîp   gåm   níc   cÊt   :  acetonitrile  theo   tû   lÖ  thÓ   tÝch   40:60   trong   30   phót   ®Õn   1   giê   ®Ó  lo¹i   hÕt  ®Öm trong hÖ thèng tríc khi t¾t m¸y. 8. TÝnh to¸n kÕt qu¶ 8.1. §êng chuÈn 8.1.1.   Ph¶i   ®¶m   b¶o   r»ng   c¸c   diÖn   tÝch   pic   cña   mÉu  thö ®Òu n»m trong ph¹m vi cña ®êng chuÈn. NÕu mÉu thö  nµo cã diÖn tÝch pic vît qu¸ chiÒu cao cña ®êng chuÈn  ë nång ®é cao nhÊt th× sÏ bÞ lo¹i vµ ph¶i tiÕn hµnh  thö l¹i víi sù pha lo∙ng. 8.1.2. X©y dùng ®êng chuÈn biÓu thÞ mèi quan hÖ gi÷a  diÖn tÝch pic thu ®îc cña dung dÞch chuÈn víi nång ®é  cña monensin  theo quan hÖ tuyÕn tÝnh bËc1:  y= ax + b Trong ®ã:  y lµ diÖn tÝch pic x lµ nång ®é cña kh¸ng sinh a lµ hÖ sè gãc b lµ h»ng sè 8.2. TÝnh to¸n 8.2.1.   Hµm   lîng   monensin   cã   trong   mÉu   thö   ®îc   tÝnh  to¸n   dùa   vµo   ®êng   chuÈn   håi   qui   tuyÕn   tÝnh   (8.1.2)  theo c«ng thøc sau: (Y − b) V                      X = ×                  a m Trong ®ã:  X lµ hµm lîng monensin cã trong mÉu thö,  tÝnh b»ng mg/kg Y   lµ   hiÖu   sè   gi÷a   diÖn   tÝch   pic   cña   dÞch  8
  9. chiÕt mÉu thö vµ diÖn tÝch pic cña mÉu tr¾ng a, b lµ c¸c th«ng sè cña ®êng chuÈn y = ax +  b V lµ thÓ tÝch dÞch chiÕt mÉu (7.2), tÝnh b»ng  ml m lµ khèi lîng mÉu thö, tÝnh b»ng gam 8.2.2.   KÕt   qu¶   cuèi   cïng   lµ   gi¸   trung   b×nh   cña   hai  lÇn   ph©n   tÝch   nh¾c   l¹i.   Trong   qu¸   tr×nh   tÝnh   to¸n  lu«n ph¶i lÊy hai sè sau dÊu phÈy. Gi¸ trÞ trung b×nh  ®îc lµm trßn ®Õn mét ch÷ sè thËp ph©n. 8.2.3.   X¸c   ®Þnh   ®é   thu   håi   (R)   tÝnh   theo   phÇn   tr¨m  theo c«ng thøc sau: C1   R (%) = ×100      C Trong ®ã:  C1 lµ hµm lîng monensin x¸c ®Þnh ®îc theo quy tr×nh  ph©n tÝch (tÝnh b»ng   mg/kg) C lµ hµm lîng monensin ®îc n¹p thªm vµo mÉu (tÝnh  b»ng mg/kg). §é thu håi ®îc x¸c ®Þnh cho mçi lÇn ch¹y mÉu Ýt nhÊt  ph¶i ®¹t 80%. 9. B¸o c¸o thö nghiÖm B¸o c¸o kÕt qu¶ ph¶i bao gåm Ýt nhÊt c¸c th«ng tin d­ íi ®©y: ­ Mäi th«ng tin cÇn thiÕt ®Ó nhËn biÕt mÉu thö. ­ ViÖn dÉn cña tiªu chuÈn nµy hoÆc ph¬ng ph¸p thö. ­ KÕt qu¶ vµ ®¬n vÞ biÓu thÞ kÕt qu¶. ­ Ngµy th¸ng lÊy mÉu vµ kiÓu lo¹i lÊy mÉu (nÕu cã). ­ Ngµy th¸ng thö nghiÖm. ­ C¸c ®iÓm ®Æc biÖt quan s¸t ®îc trong qu¸ tr×nh thö  nghiÖm. ­ Mäi thao t¸c kh«ng qui ®Þnh trong tiªu chuÈn nµy,  hoÆc ®îc coi lµ tuú chän, cïng víi c¸c chi tiÕt cña  sù cè bÊt kú mµ cã thÓ ¶nh hëng ®Õn kÕt qu¶. 9
  10. Bùi Bá Bổng 10