Xem mẫu

  1. Phản ứng chuỗi polymerase (pcr) TÓM TẮT : Thử nghiệm PCR đã thật sự làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử với các áp dụng kỳ diệu trong mọi lãnh vực. Ngày nay PCR có thể được triển khai áp dụng tại bất cứ một phòng thí nghiệm nào thử nghiệm được thực hiện tương đối đơn giản, giá thành của thử nghiệm không còn quá cao đến nỗi không thể chấp nhận được như trước đây.
  2. PCR, THE GREAT REVOLUTION IN MOLECULAR BIOLOGY SUMMARY With the fantastic applications in all scientific fields, PCR has really done a great revolution in molecular biology. Today PCR can be set up at any laboratory because the PCR technique is very simple, and the price cost of one test in not unacceptable as before. Vào năm 1985, trong một đêm trăng sáng ở tiểu bang California , trên đường lái xe dọc theo bờ biển, một ý tưởng chợt xuất hiện trong đầu của một nhà sinh hóa học rất tầm thường, làm việc cũng tại một phòng thí nghiệm hết sức tầm thường. Ý tưởng này khi trở thành hiện thực, chính là thử nghiệm PCR, đã làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử và đã đưa tác giả của nó, K.B Mullis, đến giải Nobel y học.
  3. THỬ NGHIỆM PCR LÀ GÌ ? Nguyên tắc của thử nghiệm PCR PCR là một thử nghiệm nhằm khuếch đại chuỗi nucleic acid đích thành hàng tỷ bản sao để sau đó có thể phát hiện được. Ðể thực hiện được việc khuyếch đại acid nucleic đích, thử nghiệm PCR dựa vào những chu kỳ nhiệt mà mỗi chu kỳ có 3 bước (hình 1), mỗi bước kéo dài khoảng vài chục giây đến vài phút, tuần tự như sau : (1) Ðầu tiên là nhiệt độ được nâng lên khoảng 940C để làm biến tính nucleic acid đích từ dạng sợi đôi (dsDNA) thành sợi đơn (ssDNA), đây là giai đoạn làm biến tính (denaturation) DNA đích (11) . Kế đó là giai đoạn bắt cặp (anealing), lúc này nhiệt độ trong buồng ủ PCR hạ xuống khoảng 550C để các đoạn mồi (primer) bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào hai đầu của chuỗi nucleic acid đích, đây là giai đoạn quyết định nên tính đặc hiệu thì
  4. những sản phẩm PCR (PCR product) sẽ đặc hiệu (111) Cuối cùng là giai đoạn kéo dài (extension), lúc này nhiệt độ được nâng lên khoảng 720C là nhiệt độ tối hảo để men polymerase chịu nhiệt xúc tác phản ứng tổng hợp bản sao của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung trên khuôn là các sợi đơn (ssDNA) đích đã được đoạn mồi bắt bặp vào trước đó (ở giai đoạn bắt cặp). Sự tổng hợp này cần phải có sự hiện diện các deoxy nucleoside tri phosphate (dNTP), và chiều của sự tổng hợp là 5� � 3� (đoạn mồi) hay 3�� 5� (ssDNA đích)[1,3]. Sau 30 đến 40 chu kỳ nhiệt, để hoàn tất thử nghiệm PCR, thường nên có thêm một giai đoạn gọi là bù thêm (soaking). Giai đoạn này nhiệt độ được giữ 720C trong thời gian tương đối lâu, từ 10 phút đên 1 giờ. Ðây là giai đoạn để một số các bản sao của DNA đích vì
  5. một lý do nào đó trong các giai đoạn kéo dài của các chu kỳ PCR, không kéo dài được một các đồng bộ như các bản sao khác, có thể kéo dài hoàn tất nốt chiều dài của nó. Trong những chu kỳ nhiệt đầu, sản phẩm PCR thường có kích thước không đều nhau vì chuỗi bổ sung được tổng hợp trên khuôn mẫu của chuỗi đích có trong bệnh phẩm. Càng về sau thì khuôn mẫu để tổng hợp chuỗi bổ sung chính là các sản phẩm PCR, nên kích thước của các sản phẩm PCR rất đều nhau (hình 1).
  6. Hình 1 : Nguyên tắc của thử nghiệm PCR. Như vậy từ một số lượng N DNA đích ban đầu, sau n chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR đã tổng hợp được N.2n bản sao. Với một số lượng bản sao, hay còn gọi là sản phẩm PCR (PCR product) hay amplicon, lớn như vậy (trên 109 bản sao sau 30 chu kỳ), chúng dễ dàng được phát hiện bằng các phương pháp phát hiện nucleic acid (điện di phát hiện kích thước của sản phẩm bằng probe tóm bắt, Southern blot rồi phát hiện sản phẩm).
  7. Các thành phần tham gia thử nghiệm PCR Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần phải có đầy đủ các thành phần sau đây :  DNA hay nuceic acid đích, tức là chuỗi acid nucleic (ví dụ đoạn acid nucleic đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh, của gene bệnh lý, của dấu ấn di truyền,. ) mà phản ứng PCR sẽ khuếch đại lên để chúng có thể được phát hiện trong bệnh phẩm. Phản ứng PCR sẽ không xảy ra được nếu bệnh phẩm không có nucleic acid đích. Một trường hợp khác là trong bệnh phẩm có nucleic acid đích, nhưng do bệnh phẩm được sửa soạn không thích hợp hoặc không đúng cách nên nucleic acid đích không bộc lộ ra ; hoặc trong bệnh phẩm hãy còn các chất ức chế phản ứng PCR. Trong những trường hợp này
  8. kết quả PCR sẽ âm tính, nhưng là âm tính giả. Vì vậy vấn đề sửa soạn bệnh phẩm cho thử nghiệm PCR phải được coi trọng, đặc biệt trong các phòng thí nghiệm áp dụng PCR để chẩn đoán phát hiện bệnh.  Primer hay đoạn mồi, tức là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base (18-30), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi đan. Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính : (1) Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc
  9. hiệu. (11) Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3�, (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi. Thông thường trong phản ứng PCR, người ta dùng một cặp mồi, gọi là primer set, trong đó có một mồi lên gọi là up-stream primer và một mồi xuống gọi là down-stream prime. Cặp mồi này quyết định nên kích thước củasản phẩm PCR. Chúng càng bắt cặp trên chuỗi đích xa nhau bao nhiêu thì kích thước của sản phẩm PCR càng lớn bấy nhiêu và ngược lại, càng gần nhau bao nhiêu thì kích thước càng nhỏ bấy nhiêu.  dNTP, deoxy nucleoside triphosphate, tức là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích. DNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose
  10. có gắn một base, có thể là adenine (dATP) hay thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay guanine (dGTP) , ở carbone số 1 (C1). Ba phân tử phosphate (triphosphate) được gắn tại carbone số 5 (C5) của phân tử deoxyribose này và đây chính là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3� của chuỗi bổ sung trên chuỗi đích. Năng lương để cho phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu năng lương của triphosphate trên dNTP. Ðó cũng chính là lý do tại sao phải là dNTP chứng không phải là dNDP (diphosphate) hay dNMP(monophosphate).  Men polymerase, phải là men polymerase chịu được nhiệt độ. Ngày nay có nhiều loại polymerase chịu được nhiệt độ đã được ly trích hoặc tổng hợp, tùy mục đích sử dụng mà chúng ta có thể chọn polymerase thích
  11. hợp. Thường dùng nhất trong các phòng thí nghiệm là men Taq polymerase. Là men polymerase trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus, là các vi khuẩn sống được trong các suối nước nóng.  Dung dịch đệm cho phản ứng PCR, thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl�2 1.5mM. Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0.001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween hay formamide nữa. Trong các thành phần trên, có lẽ ảnh hưởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl2, vì vậy để có được một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phả ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách thăm dò một nồng độ MgCl2 thích hợp nhất.
  12. Ngoài ra, một thiết bị hết sức quan trọng cho thử nghiệm PCR là máy chu kỳ nhiệt (thermal cycler) là máy có thể đưa nhiệt độ trong buồng ủ PCR lên cao rồi hạ xuống trong những khoảng thời gian nhất định theo chương trình mà người sử dụng định sẵn. HAI BƯỚC TIẾN QUAN TRỌNG ÐÃ ÐƯA THỬ NGHIỆM PCR ÐẾN CUỘC ÐẠI CÁCH MẠNG SINH HỌC PHÂN TỬ Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ Chính việc phát hiện được các men polymerase chịu nhiệt là bước tei61n đầu tiên đã làm thử nghiệm PCR trở nên đơn giản hơn. Thử tưởng tượng nếu không men polymerase chịu nhiệt thì thử nghiệm PCR sẽ phức tạp và kém hiệu quả bao nhiêu một khi mà cứ sau mỗi chu kỳ nhiệt lại phải thêm men polymerase mới vào vì
  13. men cũ đã bị hủy bởi nhiệt độ trong chu kỳ nhiệt trước đó ? Cũng nhờ sự sử dụng các men polymerase chịu nhiệt mà giai đoạn bắt cặp của đoạn mồi vào nucleic acid đích được đặc hiệu hơn vì được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, do đó phản ứng PCR trở nên đặc hiệu hơn. Cho đến nay, đã có hàng chục loại polymerase chịu nhiệt đã được phát hiện và tổng hợp ra [1]. Có những men polymerase trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu),. Có những men polymerase chịu nhiệt được tổng hợp từ các ci khuẩn không chịu nhiệt nhưng mang gen tái tổ hợp từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Ampli Taq, Vent (exo),. Có những men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3-5exonuclease) như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu,. Nhờ vậy
  14. mà người dùng có rất nhiều chọn lựa để sử dụng cho đúng mục đích của mình. Máy chu kỳ nhiệt Trước đây, khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR được thực hiện bằng cách liên túc chuyển các ống nghiệm phản ứng PCR vào các máy các thủy có nhiệt độ khác nhau để tạo ra được các chu kỳ nhiệt cho phản ứng. Dau đó công việc bằng tay nhàm chán và nặng nhọc này được thay thế bằng các robot tương đối cồng kềnh và đắt tiền. Ngày nay, thử nghiệm PCR được thực hiện trong các buồng ủ PCR của máy chu kỳ nhiệt, còn gọi là máy luân nhiệt. Một cách tổng quát, máy luân nhiệt gồm các bộ phận chính như sau : � Một bàn phím đơn giản để lập các chương trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnh lệnh để máy thực hiện.
  15. � Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình đã nạp vào máy, thực hiện các mệnh lệnh đền buồng ủ PCR, cũng như ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR trong các chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang được thực hiện. � Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua dự điều khiển của bộ vi xử lý. Trong các chu kỳ nhiệt, nhiệt độ trong buồng ủ PCR có thể đưa lên cao hay hạ xuống thấp trong một thời gian rất ngắn. Ðể làm thay đổi được nhiệt độ trong buồng ủ PCR, có hai phương pháp : (1) Liên tục thổi lên buồng ủ những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát nhiệt, hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạch. Với phương pháp này, máy luân nhiệt hãy còn tương đối cồng kềnh, khá đắt tiền và khi máy hoạt động âm thanh cũng khá ồn ào. (11) Phương pháp
  16. thứ hai hoạt động dựa theo hiệu quả Peltier ngược. Hiệu quả Peltier là nguyên tắc của các máy đo nhiệt độ điện tử : Khi áp hai mãnh kim loại vào nhau và khi có sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại thì sẽ sinh ra một dòng điện và chính sự lưu thông của dòng điện này khi đo lường ra sẽ phản ánh sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại. Hiệu quả Peltier ngược lại vận hành theo kiểu ngược lại, nghĩa là khi tạo ra một dòng điện giữa hai mãnh kim loại thì sẽ tạo ra được một sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh : bên này nóng, bên kia lạnh. Khi thay đổi chiều dòng điện thì nhiệt độ của hai mãnh cũng thay đổi ngược lại : bên này lạnh, bên kia nóng. Các máy chu kỳ nhiệt hiện nay đều được chế tạo dựa theo phương pháp thứ hai này, nhờ vậy mà máy trở nên rất gọn nhẹ, giá thành rẽ hơn gấp nhiều lần so với trứơc đây. Ví dụ hiện nay chúng ta có thể trang bị cho phòng thí nghiệm máy chu kỳ
  17. nhiệt nhỏ có 16 giếng phản ứng, với giá chỉ khoảng 1800 USD (minicycler của hãng MJ research) so với hàng chục ngàn USD như trước đây. PCR ÐÃ LÀM NÊN MỘT CUỘC ÐẠI CÁCH MẠNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ PCR và các áp dụng của nó hiện nay trong nhiều lãnh vực đã và đang làm được những kết quả thật sự kỳ diệu, đã làm cho các công trìng nghiên cứu sinh học phân tử trở nên nhẹ nhàng và dễ dàng hơn gấp nhiều lần so với trước kia. Nếu trước đây một thử nghiệm sinh học phân tữ phải kéo dài hàng tuần, thậm chí hàng tháng, thì nay cũng thí nghiệm có cùng mục đích như vậy, với PCR chỉ thực hiện trong vài ngày. Nếu trước đây có những mục đích thí nghiệm không thể thực hiện được, thì ngày nay với PCR mục đích này lại có thể thực hiện được một các dễ dàng.
  18. Chính nhờ PCR mà ngày nay, sinh học phân tử đã làm được những bước tiến nhảy vọt trong mọi lãnh vực. Vậy có thể nói không ngoa là PCR đã thực sự làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử. Có thể xin đơn cử ra đây một số ví dụ : PCR với kỹ thuật clone tái tổ hợp (cloning of recombinant) Nếu trước đây, muốn đưa một đoạn gene vào plasmid để chuyển thể plasmid này vào một vi khuẩn thì công việc này đòi hỏi phải tốn nhiều thời gian và công sức. Trước hết là phải có một số lượng tế bào đích để từ đó người ta ly trích toàn bộ bộ gene (genomic DNA). Sau đó dùng nhiều loại restriction enzyme để cắt bộ gene thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau, điện di trên thạch, làm kỹ thuật Southern blotting và phát thiện đoạn gen muốn tìm bằng kỹ thuật lai (hybridization) với đoạn dò (probe) đặc
  19. hiệu. Trên kết quả đó, có thể định vị và trích được đoạn gen muốn tìm từ bản thạch đã điện di để gắn vào plasmid rồi đưa vào vi khuẩn mang. Tuy nhiên công việc như vậy cũng chưa đã hoàn tất, vì chưa chắc chúng ta đã gắn đúng đoạn gen mong muốn vào plasmid vì trên bản thạch chúng ta không thể chỉ lấy đúng đoạn gen đã định vị mà không lẫn các đoạn gene khác. Do vậy, phải chọn đúng vi khuẩn mang plasmid có gene mong muốn. Chúng ta gọi toàn bộ kỹ thuật này là clone tái tổ hợp, có khi phải thực hiện trong nhiều tháng, thậm chí nhiều năm, mà nhiều khi chưa chắc đã thành công. Ngày nay, nhà nghiên cứu có thể dùng kỹ thuật PCR trong thí nghiệm này. Trước hết là từ một vài tế bào đích ban đầu (không cần phải có nhiều tế bào đích như kỹ thuật cũ), có thể sử dụng cặp mồi đặc hiệu để tổng hợp và khuếch đại đoạn gen muốn tìm thành hàng tỷ bản sao giống hệt nhau rồi đưa vào plasmid (không
  20. cần phải dùng một lượng lớn tế bào đích để ly trích được bộ gene và phân tích bằng restriction enzyme, rồi Southern blotting,.) Lúc này plasmid mang đúng đoạn gen đích, không thể có lẫn lộn các đoạn gene khác, vì vậy sau khi chuyển thể plasmid vào vi khuẩn mang, không cần phải làm kỹ thuật chọn dòng nữa. Như vậy chúng ta thấy cũng cùng một mục đích, nhưng với PCR, công việc đã gòn lại rất nhiều, có thể chỉ trong vòng vài tuần là xong. PCR với kỹ thuật ly trích các đoạn DNA mong muốn Với các kỹ thuật sinh học phân tử king điển, để ly trích được một đoạn DNA mong muốn nào đó, nhà nghiên cứu phải có trong tay một số lượng khá các tế bào đích, để ly trích được bộ gene của tế bào. Sau đó từ bộ gene phức tạp này, ly trích đoạn DNA muốn tìm bằng hàng loạt các kỹ thuật sinh học phân tử phức tạp, tốn
nguon tai.lieu . vn