Xem mẫu

  1. GEN KHÁNG KHÁNG SINH CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM TÓM TẮT Đặt vấn đề: Vi khuẩn kháng kháng sinh có thể được truyền vào người thông qua chuỗi thực phẩm. Việc tìm hiểu các nguồn gene kháng kháng sinh cũng như cơ chế kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh từ thực phẩm là yêu cầu phục vụ cho sử dụng kháng sinh hợp lý. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh và gene kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ thực phẩm. Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm được xác định bằng phương pháp Kirby-Bauer. Phát hiện nhiều gene kháng thuốc trên một số vi khuẩn bằng phương pháp PCR. Kết quả nghiên cứu: Mức độ kháng kháng sinh của 156 chủng E. coli và 40 chủng Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm: tỷ lệ kháng với ít nhất 1 kháng sinh (80,1% và 77,5%); tỷ lệ kháng từ 2 kháng sinh trở lên (61,5% và 60%).
  2. E. coli {blaTEM (88,9%), sul2 (72,2%), tetA (77,8%), clmA (61,1%), sul1 và tetB (38,9%), blaSHV (16,7%)}; Salmonella spp. {blaTEM (90,9%); sul2 (72,7%); tetA, tetB, và sul1 cùng là 63,6%; clmA (45,5%), blaSHV (18,2%)}. 7 chủng E. coli và 6 chủng Salmonella spp. đã không phát hiện được gen mã hóa cho sự kháng chloramphenicol. 5 chủng E. coli và 2 chủng Salmonella spp. có cùng kiểu hình đa kháng (tetracycline - chloramphenicol - SMX- TMP – ampicillin) và mang cùng kiểu gen kháng (blaTEM, sul2, tetA, clmA). Kết luận: Mức độ kháng kháng sinh của E. coli và Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm là khá cao. Trên 18 chủng E. coli và 11 Salmonella spp. kháng đa kháng sinh đã phát hiện thấy có tỷ lệ cao của các gen blaTEM, sul2 và tetA hơn sul1, clmA và blaSHV. Những vi khuẩn này có thể là mối nguy với sức khoẻ cộng đồng nếu chúng lây truyền qua chuỗi thực phẩm. ABSTRACT SURVEY ON ANTIBIOTICRESISTANCE GENES OF PATHOGENOUS BACTERIA ISOLATED FROM FOOD. Hoang Hoai Phuong, Nguyen Thi Ke, Pham Hung Van, Nguyen Do Phuc, Nguyen Thi Anh Dao,
  3. Tran Thi Ngoc Phuong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 12 - Supplement of No 4 - 2008: 283 - 290 Bacground: Antibiotic resistance bacteria can be transmitted to human through food. To find out about antibiotic resistance genes as well as mechanisms of the pathogenous bacteria from food is necessary for using antibiotic. Objectives: The pathogenous bacteria isolate from food was investigated for its susceptibility to antimicrobial agents and the presence of the antibiotic resistance genes. * Viện Vệ sinh Y tế Công cộng Tp. Hồ Chí Minh ** Đại học Y D ược Tp. Hồ Chí Minh Methods: A descriptive and cross-sectional study design was applied. The isolates were examined for susceptibility to to antimicrobial agents by Kirby Bauer method. PCR assays were performed to identify the resistance genes. Results: 80.1% of E. coli isolates were resistant to at least one antibiotic and 61.,5% were resistant to two or more antibiotic. 77.5% of the Salmonella spp. were resistant to at least one antibiotic and 60% were resistant to two or more antibiotic. The incidence of resistance genes of 18 multiple-antibiotic-resistant E. coli strains
  4. were detected to blaTEM (88.9%), sul2(72.2%), tetA (77.8%), clmA (61.1%), sul1 (38.9%), tetB (38.9%) and blaSHV (16.7%). The incidence of resistance genes of 11 multiple-antibiotic-resistant Salmonella spp. strains were detected to blaTEM (90.9%), sul2 (72.7%), tetA (63.6%), tetB (63.6%), sul1(63.6%), clmA (45.5%) and blaSHV (18.2%). The clmA gene was not found in seven E. coli strains and six Salmonella spp. strains. Five E. coli strains and two Salmonella spp. strains showed both multiple-antibiotic-resistance phenotype (tetracycline-chloramphenicol-SMX- TMP-ampicillin) and genotype (blaTEM, sul2, tetA, clmA). Conclusions: The incidence of resistance was observe in food isolates in this study is high. Among multiple-antibiotic-resistant E. coli and Salmonella spp. strains, the resistance gene to blaTEM, sul2 and tetA was most often observed. These organisms may become a public health risk should they enter the food chain. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong hơn hai thập kỷ qua, sự nổi lên và lan truyền các vi sinh vật kháng kháng sinh đã và đang trở nên là mối nguy lớn với sức khoẻ cộng đồng trên toàn thế giới. Do việc sử dụng kháng sinh tràn lan cho động vật (điều trị và phòng ngừa), dùng liều thấp để kích thích tăng trưởng đã tạo một sức ép chọn lọc làm vi khuẩn kháng kháng sinh. Mặt khác, do toàn cầu hóa về cung cấp thực phẩm đã làm lan truyền các vi sinh vật kháng kháng sinh và chúng được lây truyền vào người thông qua chuỗi thực phẩm.
  5. Những nhân tố di truyền di động (mobile genetic elements) như plasmid, transposon, và integron có thể lan truyền các gen kháng kháng sinh theo chiều dọc hoặc chiều ngang giữa các vi khuẩn. Ðồng thời, các nhân tố này còn đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển và lan truyền của đề kháng đa kháng kháng sinh ở vi khuẩn. Mặt khác, những phân tích phân tử của gen kháng kháng sinh đã cho biết vi khuẩn kháng kháng sinh nhiễm trong thực phẩm không tách biệt khỏi vi khuẩn của người và sự tiếp hợp giữa các vi khuẩn đã làm lan truyền gen kháng kháng sinh(2,11). Tỷ lệ nhiễm cao của các vi khuẩn gây bệnh trong thịt tươi, sữa và các thực phẩm khác cùng với sự lạm dụng sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp đã làm vấn đề kháng kháng sinh càng trở nên trầm trọng. Vấn đề kháng kháng sinh sẽ không được giải quyết nếu có sự lan truyền của các gen kháng kháng sinh vào hệ vi khuẩn ở người thông qua chuỗi thực phẩm. Trong suốt những năm gần đây, hầu hết các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tìm hiểu tính kháng kháng sinh và các gen kháng kháng sinh ở các vi sinh gây bệnh phân lập từ các mẫu bệnh phẩm hoặc động vật. Còn những nghiên cứu tìm hiểu tính kháng kháng sinh của các vi sinh gây bệnh phân lập từ thực phẩm thì hiếm. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn từ thực phẩm nhưng chưa có nghiên cứu nào tìm hiểu về gen kháng kháng sinh cũng như cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn từ thực phẩm.Vì thế, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu: “Khảo sát gen kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm”.
  6. Mục tiêu nghiên cứu Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ thực phẩm. Xác định gen kháng kháng sinh của vi khuẩn kháng kháng sinh đã phân lập. Phân tích và so sánh giữa kiểu hình với kiểu gen kháng của các vi khuẩn kháng kháng sinh. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Thời gian nghiên cứu từ 2/2007-12/2007. Ðối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm (pho mai, kem ăn, giò lụa, nem chua, chả giò, lạp xưởng, rau quả, trứng, thịt và thủy sản tươi...): 156 chủng E. coli và 40 chủng Salmonella spp.. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp Kirby-Bauer dùng kiểm tra tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm(1,6).
  7. Phương pháp xử lý và phân tích số liệu bằng phần mềm Epi-Info 6.04. Phương pháp PCR để phát hiện các gen kháng kháng sinh: Từ các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm có kiểu hình kháng kháng sinh đã được xác định, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR để xác định các gen kháng kháng sinh. Việc khuếch đại các gen kháng kháng sinh mục tiêu dựa trên việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu tương ứng cho từng gen kháng kháng sinh (bảng 1). Bảng 1: Trình tự mồi dùng trong khuếch đại các gen kháng thuốc Kích Kiểu hình Tên Gen thước sản kháng kháng sinh mồi mục tiêu phẩm (bp) TEM blaTEM 1,150 Ampicillin SHV blaSHV 885 TetA tetA 937 Tetracyclin TetB tetB 416
  8. Kích Kiểu hình Tên Gen thước sản kháng kháng sinh mồi mục tiêu phẩm (bp) Chloramphenicol Cml cmlA 455 Sul sul1 789 Sulfamethoxazol Sul2 sul2 722 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Mức độ kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm Mức độ kháng kháng sinh của E. coli Tỉ lệ (%) kháng kháng sinh của 156 chủng E. coli phân lập từ thực phẩm như sau: tetracycline (59,6%), chloramphenicol (50%), SMX/TMP (45,5%), ampicillin (40,4%), nalidixic acid (20,5%), ciprofloxacin (10,9%), gentamicin (9,6%), amoxicillin/clavunic acid (7,7%), cefuroxime axetil (1,9%), amikacin (0,6%), cefepime (0,6%), ceftriaxone (0,6%) và 100% các chủng E. coli cảm nhạy với imipenem, và ticarcillin. Như vậy, 156 chủng E. coli phân lập từ thực phẩm có tỉ lệ
  9. kháng cao với tetracycline, chloramphenicol, SMX/TMP và ampicillin. Kết quả này cũng giống với một số nghiên cứu khác trên thế giới(10,11,1). Bảng 2: Tỉ lệ nhạy cảm và kháng với 16 kháng sinh của E. coli Tỉ lệ (%) Nhạy Kháng cảm Kháng ít 80,1 19,9 nhất 01 kháng (125) (31) sinh Kháng 2- 61,5 38,5 7 kháng sinh (96) (60) Kháng 19,2 81,8 (Am-Te-Cl- (30) (126) SMX/TMP)
  10. Ở bảng 2 đã cho thấy: Tỉ lệ nhạy cảm với 16 loại kháng sinh của 156 chủng E. coli phân lập từ thực phẩm là 19,9%, kháng ít nhất 1 kháng sinh là 80,1% và kháng đa kháng sinh (kháng 2-7 kháng sinh) là 61,5%. Ở nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ kháng đa kháng sinh của E. coli cao hơn có với kết quả của nhóm Nguyễn Thị Kê (32,6%)(5). Trong số các chủng E. coli kháng đa kháng sinh thì kiểu hình đa kháng với cả 4 kháng sinh (tetracycline - chloramphenicol - SMX./TMP - ampicillin) là phổ biến nhất có 30 chủng (19,2%). Kiểu hình kháng này giống với kiểu hình kháng của E. coli phân lập từ thịt của nhóm nghiên cứu Tô Liên Thu và nhóm Saenz(5,8). Mức độ kháng kháng sinh của Salmonella spp. Tỉ lệ (%) kháng kháng sinh của 40 chủng Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm như sau: chloramphenicol (67,5%), tetracyclin (65,0%), sulfamethoxazole- trimethoprim (37,5%), ampicillin (37,5%), nalidixic acid (27,5%), ciprofloxacin (12,5%), gentamicin (5%) và 100% các chủng Salmonella spp. nhạy cảm với amikacin, cefeperazone, cefepime, cefuroxime axetil, ceftriaxone, ceftazidime, imipenem, ticarcillin. Như vậy, 40 chủng Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm có tỉ lệ kháng cao với tetracycline, chloramphenicol, SMX/TMP và ampicillin. Khi so sánh với kết quả nghiên cứu của nhóm Miko, nhóm Antunes và nhóm Duffy thì thấy gần tương đồng nhau về kiểu hình kháng kháng sinh nhưng khác nhau về tỉ lệ kháng (%). Tỉ lệ Salmonella spp. kháng kháng sinh trong nghiên cứu của chúng tôi có thấp hơn so với nghiên cứu của Miko {(Salmonella enterica phân lập từ thực phẩm kháng với ampicillin (73%), sulfamethoxazole (92%), chloramphenicol (48%), trimethoprim
  11. (23%)} và nhóm Duffy {(Salmonella phân lập từ thịt ở Ireland có 92% kháng tetracycline, 83% kháng sulfamethoxazole)} nhưng tỉ lệ có cao hơn so nhóm Antunes {(Salmonella enterica phân lập từ thực phẩm ở Bồ Ðào Nha kháng với ampicillin (17%), sulfamethoxazole (17%), tetracycline (19%)}(1,5,1). Bảng 3: Tỉ lệ nhạy cảm và kháng với 16 kháng sinh của Salmonella spp. Tỉ lệ kháng (%) Kháng N hạy cảm Kháng ít 77,5% 22,5 nhất 01 kháng sinh (31) (9) Kháng 2-6 60% 38,5 kháng sinh (24) (16) Kháng 27,5 72,5 (Am-Te-Cl- (11) (29) SMX/TMP)
  12. Qua bảng 3 cho thấy: 22,5% các chủng Salmonella spp. nhạy cảm với tất cả các kháng sinh thử nhưng có 77,5% (31 chủng) kháng ít nhất 1 kháng sinh và 60% (24 chủng) là kháng đa kháng sinh (kháng 2-6 kháng sinh). So sánh với kết quả của một số nhóm nghiên cứu thì thấy tỉ lệ kháng đa kháng sinh của 40 chủng Salmonella spp. ở trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn hẳn (tỉ lệ kháng đa kháng sinh ở nhóm Antunes, nhóm Miko và nhóm White lần lượt là 21%; 39,4% và 53%)(1,5,1). Trong số các chủng Salmonella spp. kháng đa kháng sinh thì kiểu hình kháng với cả 4 kháng sinh (tetracycline - chloramphenicol - SMX./TMP - ampicillin) là phổ biến nhất có 11 chủng. Kiểu hình đa kháng này cũng giống với nghiên cứu của nhóm Miko(5). Khảo sát gen kháng kháng sinh của Salmonella spp. và E. coli Chúng tôi chỉ chọn 18 chủng E. coli và 11 chủng Salmonella spp. có cùng kiểu hình kháng đa kháng sinh với tetracycline - chloramphenicol - SMX/TMP – ampicillin để tiến hành khảo sát các gen kháng kháng sinh nhằm tìm hiểu rõ hơn về cơ chế kháng kháng sinh của các chủng này. Sử dụng kỹ thuật PCR với 7 cặp mồi đặc hiệu để xác định sự hiện diện 7 gen kháng kháng sinh (blaTEM và blaSHV mã hóa -lactamase cho phép vi khuẩn kháng ampiciilin, tetA và tetB mã hóa cho kháng cho tetracyclin, sul1 và sul2 mã hóa cho kháng sulfamethoxazol, clmA mã hóa cho kháng chloramphenicol) trên chủng E. coli và Salmonella spp. kháng đa kháng sinh như đã lựa chọn ở trên. Kết quả PCR phát hiện gen kháng kháng sinh ở một số chủng E. coli
  13. Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh trên một số chủng E. coli có kiểu hình kháng (tetracycline - chloramphenicol – SMX/TMP - ampicillin của được thể hiện ở hình 1. Giếng MK: thang chuẩn 100bp; từ giếng 1 đến giếng 7 là kết quả của chủng E. coli (T149){Giếng 1: blaTEM (1150bp), giếng 2: blaSHV (-), giếng3: sul 2 (722bp); giếng 4: sul 1 (-); giếng 5: tetA (937bp); giếng 6: tetB (416bp); giếng 7: clmA (455bp)}; từ giếng 8 đến giếng 11 là kết quả của chủng E. coli (T23) với giếng 8: blaTEM (1150bp), giếng 9: sul2 (722bp), giếng 10: tetA (937bp); giếng11: clmA (455bp). Hình 1 đã cho thấy chủng E. coli mã số T149 phát hiện được các gen kháng kháng sinh là blaTEM, sul 2, tetA, tetB và clmA. Với chủng E. coli mã số T23 thì phát hiện các gen kháng như blaTEM, Sul 2, tet A và clmA. Như vậy, bằng kỹ thuật PCR chúng tôi đã phát hiện được các gen kháng kháng sinh trên các chủng E. coli kháng đa kháng sinh với ampicillin, SMX/TMP, tetracyclin, chloramphenicol. ~1150bp ~937bp
  14. ~722bp ~ 455bp 1000bp 500bp 100bp 100bp Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh.
  15. Tỉ lệ phát hiện gen kháng kháng sinh trên các chủng E. coli kháng đa kháng sinh Tỉ lệ phát hiện 7 gen kháng sinh (blaTEM, blaSHV, tetA, tetB, sul1, sul2 và clmA) trên 18 chủng E. coli kháng đa kháng sinh phân lập từ thực phẩm được thể hiện ở bảng 4. Bảng 4: Kết quả PCR phát hiện 7 gen kháng kháng sinh trên 18 chủng E. coli Số chủng có Số Kháng Kiểu mang chủng sinh gen kháng gen kháng kháng (tỷ lệ%) 16 blaTEM (88,9%) ampicillin 18 3 blaSHV (16,7%)
  16. 7 sul1 (38,9%) SMX/TMP 18 13 sul2 (72,2%) 14 tetA (77,8%) tetracyclin 18 7 tetB (38,9%) Chloram- 11 18 clmA phenicol (61,1%) Bảng 4 cho thấy, từ 18 chủng E. coli kháng đa kháng sinh đã phát hiện thấy có tỷ lệ cao của các gen blaTEM (88,9%), sul2 (72,2%), tetA (77,8%), clmA (61,1%) còn các gen được phát hiện tỷ lệ ít hơn là sul1 và tetB (38,9%), blaSHV(16,7%). Khi so sánh với kết quả nghiên cứu của nhóm Cao Thị Bảo Vân (nghiên cứu trên các chủng E. coli phân lập từ mẫu bệnh phẩm tại thành phố Hồ Chí Minh) thì thấy: có sự giống nhau về kiểu gen kháng (blaTEM và blaSHV) cho kiểu hình kháng
  17. ampicillin của các chủng E. coli và tỷ lệ phát hiện blaTEM (76,3%) cao hơn so với blaSHV (38,1%) (1). Như vậy, rõ ràng có sự tương đồng về kiểu gen kháng (blaTEM và blaSHV) cho kiểu hình kháng ampicillin giữa các chủng E. coli phân lập từ thực phẩm và bệnh phẩm tại thành phố Hồ Chí Minh. Vì thế, rất có thể E. coli kháng ampicillin phân lập từ bệnh phẩm là có nguồn gốc lây truyền từ E. coli có trong thực phẩm. Mặt khác, so sánh với kết quả nghiên cứu của nhóm Saenz thì thấy: có sự giống nhau kiểu gen kháng cho kiểu hình đa kháng (ampicillin-SMX/TMP- tetracyclin-chloramphenicol) của các chủng E. coli. Ðó là với kiểu hình kháng với ampicillin thì blaTEM được phát hiện (nhóm Saenz thì không phát hiện thấy blaSHV); các chủng kháng với tetracyclin thì đều phát hiện thấy tetA, tetB trong đó tet A phát hiện thấy nhiều hơn tetB; phát hiện thấy clmA ở các chủng kháng với chloramphenicol; các chủng kháng với sulphamethoxazol thì phát hiện thấy sul1 và sul 2 và có tới 8/17 chủng cùng mang gen Sul1 và Sul 2(9). Như vậy, tuy có cách xa nhau về địa lý nhưng kết quả nghiên cứu của chúng tôi và nhóm Saenz có nhiều điểm tương đồng về kiểu hình và kiểu gen kháng của các chủng E. coli kháng đa kháng sinh. Khi phân tích và so sánh giữa kiểu hình với kiểu gen kháng kháng sinh trên 18 chủng E. coli kháng đa kháng sinh (Am SMX-TMP Te Cl) chúng tôi thấy rằng: E. coli phân lập từ thực phẩm có thể mang nhiều gen kháng kháng sinh tương ứng cho kiểu hình kháng kháng sinh. 7 chủng E. coli có mang 2 gen mã hóa cho kháng 1 loại kháng sinh như: blaTEM và blaSHV có trong 1 chủng, sul1 và sul2 có trong 3 chủng,
  18. tetA và tetB có trong 3 chủng. Tuy vậy, có 7 chủng đã không phát hiện được gen mã hóa cho sự kháng chloramphenicol, có thể là do các chủng này có cơ chế kháng kháng sinh khác hoặc là do các gen kháng kháng sinh khác. Ngoài ra, nhiều chủng E. coli tuy có cùng kiểu hình kháng đa kháng sinh nhưng lại mang các gen kháng kháng sinh khác nhau và chỉ có 4 chủng có mang cùng kiểu gen kháng (blaTEM, sul1, tetA, clmA) và 5 chủng có cùng kiểu gen kháng (blaTEM, sul2, tetA, clmA). Kết quả PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh của Salmonella spp. Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh ở Salmonella spp. có kiểu hình kháng (ampicillin, SMX/TMP, tetracyclin, chloramphenicol) được thể hiện ở hình 2. 1000bp 400bp 100bp
  19. Hình 2: Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh của Salmonella spp. (SA1). Giếng MK: thang chuẩn 100bp; giếng 1: blaTEM (1150bp), giếng 2: blaSHV (885bp), giếng 3: sul 1 (-); giếng 4: sul2 (722bp); giếng 5: tetA (937bp); giếng 6: tetB (-); giếng7: clm A (455bp).
  20. Hình 2 cho thấy, chủng Salmonella spp.(SA1) phát hiện có các gen kháng kháng sinh là blaTEM, blaSHV, sul 2, tetA và clmA, còn tetB và sul 1 thì không phát hiện. Tỉ lệ phát hiện gen kháng trên các chủng Salmonella spp. kháng đa kháng Tỉ lệ phát hiện 7 gen kháng sinh (blaTEM, bla SHV, sul1, sul2, tetA, tetB, và clmA) trên 11 chủng Salmonella spp. kháng đa kháng sinh được thể hiện ở bảng 5. Bảng 5: Kết quả PCR phát hiện 7 gen kháng kháng sinh trên 11 chủng Salmonella spp. Số chủng có Số Kiểu mang Kháng sinh chủng gen kháng gen kháng kháng (tỷ lệ%) 10 ampicillin 11 blaTEM (90,9%)