Xem mẫu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009
Nghiên cứu Y học
XÉT NGHIỆM ELISA PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN NS1
TRONG CHẨN ĐOÁN SỐT DENGUE/SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE
Phan Văn Bé Bảy*, Hoàng Tiến Mỹ**
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue là một trong những bệnh truyền nhiễm quan trọng
nhất tại Việt Nam. Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 của virút Dengue trong huyết thanh
bệnh nhân giúp phát hiện nhiễm virút Dengue trong giai đoạn sớm.
Mục tiêu: Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên đoán âm của xét
nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag.
Phương pháp: Tiền cứu, mô tả cắt ngang.
Kết quả: Độ nhạy của xét nghiệm ELISA bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag là 94,90%, độ đặc hiệu là
100%, giá trị tiên đoán dương là 100% và giá trị tiên đoán âm là 94,44%.
Kết luận: Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 của virút Dengue có thể ứng dụng rộng rãi
để chẩn đoán sớm sốt Dengue/SXH Dengue.
ABSTRACT
ELISA TO DETECT NS1 ANTIGEN FOR THE DIAGNOSIS OF DENGUE FEVER
AND DENGUE HAEMORRHAGIC FEVER
Phan Văn Bé Bảy, Hoàng Tiến Mỹ
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 13 - Supplement of No 1 - 2009: 249 - 255
Background: Dengue fever/Dengue haemorrhagic fever is one of the most important emerging
infectious diseases in Vietnam. Recently, detecting NS1 Dengue antigen in patients’ sera has been described
as an alternative method for early diagnosis.
Objectives: Evaluating the sensitivity, the specificity, the positive predictive value and the negative
predictive value of the Platelia™ Dengue NS1 Ag.
Method: Prospective, description, cross-sectional study
Results: The sensitivity, the specificity, the positive predictive value and the negative predictive value
are 94.9%, 100%, 100%, 94.44%, respectively.
Conclusion: Detecting NS1 Dengue antigen can be used in early Dengue fever and Dengue
haemorrhagic fever diagnosis.
vùng Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương.
ĐẶT VẤNĐỀ
Có khoảng 2,5-3,0 tỉ người sống trong vùng có
Sốt Dengue (SD)/sốt xuất huyết (SXH)
nguy cơ bị nhiễm bệnh, ước tính số trường
Dengue là bệnh nhiễm virút cấp tính gây ra
hợp mắc hàng năm khoảng 50-100 triệu người,
bởi 4 týp virút Dengue: DEN-1, DEN-2, DEN-3
trong đó hơn 90% trường hợp là trẻ em dưới
và DEN-4. Bệnh được truyền từ người sang
15 tuổi(3,8,23,32,33). Sốt Dengue/SXH Dengue vẫn
người qua trung gian muỗi Aedes aegypti. Bệnh
còn là thách thức cho các nhà dịch tể học lẫn
đang lưu hành trên 100 quốc gia thuộc các khu
thầy thuốc lâm sàng và vẫn chưa có vắcxin
vực có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới ở
phòng bệnh(17).
* Khoa Vi Sinh, Bệnh viện Đồng Tháp ** Bộ môn Vi Sinh, Đại Học Y Dược TP. HCM
Chuyên Đề Nội Khoa
1
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009
Nghiên cứu Y học
Tại Việt Nam, sốt Dengue/ SXH Dengue là
một trong những bệnh truyền nhiễm có tỉ lệ
mắc và chết cao nhất ở trẻ em và bệnh đã và
đang trở thành vấn đề y tế nghiêm trọng.
Trong năm 2007, trong 20 tỉnh thành khu vực
phía Nam ghi nhận có 87.950 trường hợp mắc
và có 81 trường hợp chết. Đồng Tháp là một
trong những tỉnh có số mắc và chết cao nhất
trong khu vực này với số mắc là 13.012 và có 9
trường hợp tử vong(4,5,6,11).
xét nghiệm này trên người Việt Nam còn chưa
được ghi nhận đầy đủ.
NS1 của virus Dengue là 1 glycoprotein,
trọng lượng phân tử 46-50 kD, thể hiện dưới 2
dạng: dạng kết hợp màng (mNS1) và dạng tiết
(sNS1) quyết định tính đặc hiệu nhóm và loài.
Chức năng của NS1 đến nay chưa được xác
định đầy đủ nhưng người ta nhận thấy nó
tham gia vào quá trình sao chép RNA của
virút, cần thiết cho sự tồn tại của virút (20,33).
Lượng NS1 dạng tiết (sNS1) có nồng độ cao
trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm virút
Dengue trong giai đoạn sớm khi có biểu hiện
lâm sàng và có liên quan với mức độ virút
trong máu(22).
ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
Nhiễm virút Dengue hiện nay được phát
hiện bằng nhiều xét nghiệm như: phân lập
virút, phản ứng chuỗi polymerase sao chép
ngược (RT-PCR), ELISA phát hiện kháng
nguyên, phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu
(HI), phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn men
(MAC-ELISA, GAC-ELISA), thử nghiệm miễn
dịch nhanh (sắc ký miễn dịch). Tuy nhiên một
số xét nghiệm đòi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền,
một số thì không phát hiện sớm được bệnh do
đáp ứng kháng thể chậm, khi bệnh nhân đã
qua giai đoạn cấp(1,3,16,23,24,25,28,31,33). Vì vậy, việc
phát hiện sớm và chính xác là một nhu cầu cần
thiết cho cả thầy thuốc lẫn bệnh nhân.
Gần đây hãng Bio-Rad cung cấp bộ kit
phát hiện kháng nguyên NS1 của virút bằng
kỹ thuật ELISA. Đây là một hứa hẹn khả quan
tại Việt Nam bởi vì xét nghiệm này có thể phát
hiện bệnh sớm trong giai đoạn bệnh nhân còn
sốt hơn nữa không đòi hỏi phương tiện đắt
tiền(2,22,28,29,33,34,35). Tuy nhiên, hiện nay giá trị của
2
Chuyên Đề Nội Khoa
Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Xét
nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1
trong chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết
Dengue” nhằm đạt được những mục tiêu: xác
định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán
dương và giá trị tiên đoán âm của xét nghiệm
ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít
Platelia™ Dengue NS1 Ag.
Thiết kế nghiên cứu
Tiền cứu, mô tả cắt ngang.
Đối tượng nghiên cứu
Nhóm nghiên cứu: 196 mẫu máu được xác
định nhiễm virút Dengue bằng xét nghiệm MACELISA Dengue (mẫu máu lần 1, khi bệnh nhân
mới vào viện, là âm tính và mẫu máu lần 2, từ
ngày sốt thứ 6 trở đi là dương tính).
Nhóm chứng âm: 170 mẫu máu từ người
khỏe mạnh hiến máu tình nguyện, có xét
nghiệm MAC-ELISA Dengue âm tính.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ 29/09/06 đến
29/08/07 tại Khoa Nhiễm và Khoa Vi sinh-Bệnh
viện Đồng Tháp.
Phương pháp nghiên cứu
- Kỹ thuật xét nghiệm: xét nghiệm MACELISA Dengue (bộ kít do Labô Arbovirus Khoa Vi sinh Miễn Dịch - Viện Pasteur Thành
phố Hồ Chí Minh sản xuất), xét nghiệm ELISA
phát hiện kháng nguyên NS1 (bộ kít Platelia™
Dengue NS1 Ag do hãng Bio-Rad
Laboratories, Marnes La Coquette, Pháp sản
xuất). Xác định týp virút Dengue bằng kỹ
thuật TaqMan Real time RT-PCR thực hiện tại
Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng thuộc Đại học
Offord - Anh quốc tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt
Đới Thành phố Hồ Chí Minh với các mẫu máu
lấy lần thứ nhất khi bệnh nhân nhập viện.
- Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA phát hiện
kháng nguyên NS1: áp dụng nguyên tắc miễn
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009
dịch men kiểu sandwich một bước trên plaque.
Bệnh phẩm và chứng được ủ trực tiếp, cùng
lúc với cộng hợp trong các giếng đã gắn với
kháng thể đơn dòng từ chuột (MAb) ở nhiệt
độ 37ºC trong 90 phút. Nếu mẫu có kháng
nguyên sẽ tạo thành phức hợp MAb-NS1MAb/peroxidase. Sau khi rửa, phức hợp miễn
dịch được biểu hiện khi thêm vào giếng dung
dịch sinh màu để khởi đầu cho phản ứng tạo
màu. Sau khi ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng,
ngừng phản ứng bằng dung dịch acid. Đọc kết
quả bằng quang phổ kế với bước sóng 450/620
nm. Sự hiện diện kháng nguyên NS1 trong
mẫu được xác định bằng cách so sánh độ hấp
thu của mẫu thử (OD) với độ hấp thu của
ngưỡng phát hiện (CO).
- Thu thập dữ liệu từ bệnh nhân và kết quả
xét nghiệm.
- Xử lý số liệu bằng phần mềm Stata 8.0.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Một số đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu
Trong 196 mẫu nghiên cứu, có 102 nam
(52,04%) và 94 nữ (47,96%). Độ tuổi trung bình là
11,18 ± 6,36 (2-35). Số trẻ em
nguon tai.lieu . vn
Nghiên cứu Y học
XÉT NGHIỆM ELISA PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN NS1
TRONG CHẨN ĐOÁN SỐT DENGUE/SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE
Phan Văn Bé Bảy*, Hoàng Tiến Mỹ**
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue là một trong những bệnh truyền nhiễm quan trọng
nhất tại Việt Nam. Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 của virút Dengue trong huyết thanh
bệnh nhân giúp phát hiện nhiễm virút Dengue trong giai đoạn sớm.
Mục tiêu: Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên đoán âm của xét
nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag.
Phương pháp: Tiền cứu, mô tả cắt ngang.
Kết quả: Độ nhạy của xét nghiệm ELISA bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag là 94,90%, độ đặc hiệu là
100%, giá trị tiên đoán dương là 100% và giá trị tiên đoán âm là 94,44%.
Kết luận: Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 của virút Dengue có thể ứng dụng rộng rãi
để chẩn đoán sớm sốt Dengue/SXH Dengue.
ABSTRACT
ELISA TO DETECT NS1 ANTIGEN FOR THE DIAGNOSIS OF DENGUE FEVER
AND DENGUE HAEMORRHAGIC FEVER
Phan Văn Bé Bảy, Hoàng Tiến Mỹ
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 13 - Supplement of No 1 - 2009: 249 - 255
Background: Dengue fever/Dengue haemorrhagic fever is one of the most important emerging
infectious diseases in Vietnam. Recently, detecting NS1 Dengue antigen in patients’ sera has been described
as an alternative method for early diagnosis.
Objectives: Evaluating the sensitivity, the specificity, the positive predictive value and the negative
predictive value of the Platelia™ Dengue NS1 Ag.
Method: Prospective, description, cross-sectional study
Results: The sensitivity, the specificity, the positive predictive value and the negative predictive value
are 94.9%, 100%, 100%, 94.44%, respectively.
Conclusion: Detecting NS1 Dengue antigen can be used in early Dengue fever and Dengue
haemorrhagic fever diagnosis.
vùng Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương.
ĐẶT VẤNĐỀ
Có khoảng 2,5-3,0 tỉ người sống trong vùng có
Sốt Dengue (SD)/sốt xuất huyết (SXH)
nguy cơ bị nhiễm bệnh, ước tính số trường
Dengue là bệnh nhiễm virút cấp tính gây ra
hợp mắc hàng năm khoảng 50-100 triệu người,
bởi 4 týp virút Dengue: DEN-1, DEN-2, DEN-3
trong đó hơn 90% trường hợp là trẻ em dưới
và DEN-4. Bệnh được truyền từ người sang
15 tuổi(3,8,23,32,33). Sốt Dengue/SXH Dengue vẫn
người qua trung gian muỗi Aedes aegypti. Bệnh
còn là thách thức cho các nhà dịch tể học lẫn
đang lưu hành trên 100 quốc gia thuộc các khu
thầy thuốc lâm sàng và vẫn chưa có vắcxin
vực có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới ở
phòng bệnh(17).
* Khoa Vi Sinh, Bệnh viện Đồng Tháp ** Bộ môn Vi Sinh, Đại Học Y Dược TP. HCM
Chuyên Đề Nội Khoa
1
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009
Nghiên cứu Y học
Tại Việt Nam, sốt Dengue/ SXH Dengue là
một trong những bệnh truyền nhiễm có tỉ lệ
mắc và chết cao nhất ở trẻ em và bệnh đã và
đang trở thành vấn đề y tế nghiêm trọng.
Trong năm 2007, trong 20 tỉnh thành khu vực
phía Nam ghi nhận có 87.950 trường hợp mắc
và có 81 trường hợp chết. Đồng Tháp là một
trong những tỉnh có số mắc và chết cao nhất
trong khu vực này với số mắc là 13.012 và có 9
trường hợp tử vong(4,5,6,11).
xét nghiệm này trên người Việt Nam còn chưa
được ghi nhận đầy đủ.
NS1 của virus Dengue là 1 glycoprotein,
trọng lượng phân tử 46-50 kD, thể hiện dưới 2
dạng: dạng kết hợp màng (mNS1) và dạng tiết
(sNS1) quyết định tính đặc hiệu nhóm và loài.
Chức năng của NS1 đến nay chưa được xác
định đầy đủ nhưng người ta nhận thấy nó
tham gia vào quá trình sao chép RNA của
virút, cần thiết cho sự tồn tại của virút (20,33).
Lượng NS1 dạng tiết (sNS1) có nồng độ cao
trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm virút
Dengue trong giai đoạn sớm khi có biểu hiện
lâm sàng và có liên quan với mức độ virút
trong máu(22).
ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
Nhiễm virút Dengue hiện nay được phát
hiện bằng nhiều xét nghiệm như: phân lập
virút, phản ứng chuỗi polymerase sao chép
ngược (RT-PCR), ELISA phát hiện kháng
nguyên, phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu
(HI), phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn men
(MAC-ELISA, GAC-ELISA), thử nghiệm miễn
dịch nhanh (sắc ký miễn dịch). Tuy nhiên một
số xét nghiệm đòi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền,
một số thì không phát hiện sớm được bệnh do
đáp ứng kháng thể chậm, khi bệnh nhân đã
qua giai đoạn cấp(1,3,16,23,24,25,28,31,33). Vì vậy, việc
phát hiện sớm và chính xác là một nhu cầu cần
thiết cho cả thầy thuốc lẫn bệnh nhân.
Gần đây hãng Bio-Rad cung cấp bộ kit
phát hiện kháng nguyên NS1 của virút bằng
kỹ thuật ELISA. Đây là một hứa hẹn khả quan
tại Việt Nam bởi vì xét nghiệm này có thể phát
hiện bệnh sớm trong giai đoạn bệnh nhân còn
sốt hơn nữa không đòi hỏi phương tiện đắt
tiền(2,22,28,29,33,34,35). Tuy nhiên, hiện nay giá trị của
2
Chuyên Đề Nội Khoa
Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Xét
nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1
trong chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết
Dengue” nhằm đạt được những mục tiêu: xác
định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán
dương và giá trị tiên đoán âm của xét nghiệm
ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít
Platelia™ Dengue NS1 Ag.
Thiết kế nghiên cứu
Tiền cứu, mô tả cắt ngang.
Đối tượng nghiên cứu
Nhóm nghiên cứu: 196 mẫu máu được xác
định nhiễm virút Dengue bằng xét nghiệm MACELISA Dengue (mẫu máu lần 1, khi bệnh nhân
mới vào viện, là âm tính và mẫu máu lần 2, từ
ngày sốt thứ 6 trở đi là dương tính).
Nhóm chứng âm: 170 mẫu máu từ người
khỏe mạnh hiến máu tình nguyện, có xét
nghiệm MAC-ELISA Dengue âm tính.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ 29/09/06 đến
29/08/07 tại Khoa Nhiễm và Khoa Vi sinh-Bệnh
viện Đồng Tháp.
Phương pháp nghiên cứu
- Kỹ thuật xét nghiệm: xét nghiệm MACELISA Dengue (bộ kít do Labô Arbovirus Khoa Vi sinh Miễn Dịch - Viện Pasteur Thành
phố Hồ Chí Minh sản xuất), xét nghiệm ELISA
phát hiện kháng nguyên NS1 (bộ kít Platelia™
Dengue NS1 Ag do hãng Bio-Rad
Laboratories, Marnes La Coquette, Pháp sản
xuất). Xác định týp virút Dengue bằng kỹ
thuật TaqMan Real time RT-PCR thực hiện tại
Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng thuộc Đại học
Offord - Anh quốc tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt
Đới Thành phố Hồ Chí Minh với các mẫu máu
lấy lần thứ nhất khi bệnh nhân nhập viện.
- Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA phát hiện
kháng nguyên NS1: áp dụng nguyên tắc miễn
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009
dịch men kiểu sandwich một bước trên plaque.
Bệnh phẩm và chứng được ủ trực tiếp, cùng
lúc với cộng hợp trong các giếng đã gắn với
kháng thể đơn dòng từ chuột (MAb) ở nhiệt
độ 37ºC trong 90 phút. Nếu mẫu có kháng
nguyên sẽ tạo thành phức hợp MAb-NS1MAb/peroxidase. Sau khi rửa, phức hợp miễn
dịch được biểu hiện khi thêm vào giếng dung
dịch sinh màu để khởi đầu cho phản ứng tạo
màu. Sau khi ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng,
ngừng phản ứng bằng dung dịch acid. Đọc kết
quả bằng quang phổ kế với bước sóng 450/620
nm. Sự hiện diện kháng nguyên NS1 trong
mẫu được xác định bằng cách so sánh độ hấp
thu của mẫu thử (OD) với độ hấp thu của
ngưỡng phát hiện (CO).
- Thu thập dữ liệu từ bệnh nhân và kết quả
xét nghiệm.
- Xử lý số liệu bằng phần mềm Stata 8.0.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Một số đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu
Trong 196 mẫu nghiên cứu, có 102 nam
(52,04%) và 94 nữ (47,96%). Độ tuổi trung bình là
11,18 ± 6,36 (2-35). Số trẻ em