Xem mẫu
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC
-----------*&*-----------
TIỂU LUẬN MÔN HỌC
Tên tiểu luận
Phương pháp xác định axit shikimic
trong quả Hồi bằng sắc ký lỏng cao áp
HPLC
Họ và tên HV: Nguyễn Thị Xuân Nhung
Mã số : CB101199
Lớp : CHTP2010
Hà Nội 2011
1
- Môc lôc
I. Tæng quan vÒ axit shikimic vµ c¸c ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm lîng..........................3
I.1. Tæng quan vÒ axit shikimic................................................................................ 3
I.2. C¸c ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm lîng axit shikimic tõ qu¶ Håi...............................5
I.2.1. X©y dùng ph¬ng ph¸p chiÕt t¸ch axit shikimic tõ qu¶ Håi............................ 5
I.2.2. X©y dùng ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm lîng axit shikimic............................... 7
II. Tµi liÖu tham kh¶o.................................................................................................. 10
2
- I. Tæng quan vÒ axit shikimic vµ c¸c ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh
hµm lîng.
I.1. Tæng quan vÒ axit shikimic
Axit shikimic lÇn ®Çu tiªn ®îc ph©n lËp vµo n¨m 1885 tõ c©y ë NhËt
B¶n, tªn lµ Shikimino-ki (Illicium anisatum). Tuy nhiªn, nã còng cã mÆt
trong c¸c c©y l¸ nhän, trong rÊt nhiÒu lo¹i qu¶ trong ®ã cã qu¶ Håi
(Illicium verum) (kho¶ng tõ 5-7%) [].
Axit shikimic ®ãng vai trß quan träng, ®îc coi lµ mét trong nh÷ng
chÊt ch×a khãa trong qu¸ tr×nh sinh tæng hîp cña rÊt nhiÒu hîp chÊt tù
nhiªn quan träng, bao gåm amino axit th¬m, alkaloid, c¸c hîp chÊt
phenolic, phenylpropanoid vµ c¸c dÉn xuÊt cña chóng, vÝ dô nh
flavonoids, lignans, lignins.
OH
OH
O
OH
OH
H×nh 1: CÊu tróc cña axit shikimic (C7H10O5)
Axit shikimic (3,4,5- Trihydroxy-1-cyclohexen-1-carboxylic axit) cã
thÓ ®îc sinh tæng hîp tõ axit chinic b»ng ph¬ng ph¸p ®Ò hydrat ho¸.
Mét sè ®Æc tÝnh ho¸ lý cña axit shikimic []
- NhiÖt ®é nãng ch¶y: 178 – 180 0C
- §é quay cùc : [α]D22 - 157 (c, 1 trong níc)
- Axit tan trong níc kho¶ng 18%, dÔ t¹o thµnh dung dÞch b·o hoµ
trong níc. Axit shikimic tan kÐm trong ete vµ rîu, kh«ng tan trong mét sè
dung m«i h÷u c¬ nh benzen, clorofooc vµ ete dÇu ho¶ [].
3
- Axit shikimic là nguån nguyªn liÖu chñ yÕu ®Ó tæng hîp ho¹t chÊt
oseltaminvir, thµnh phÇn chÝnh ®Ó s¶n xuÊt thuèc Taminflu chèng virót
cóm. Trong dÞch cóm gµ H5N1 vµ cóm lîn H1N1 gÇn ®©y, sè ngêi m¾c
vµ sè ngêi chÕt nhiÒu ®Õn møc kû lôc khiÕn WHO ph¶i ®a møc c¶nh
b¸o vÒ dÞch lªn møc 6 lµ møc cao nhÊt. ¶nh hëng cña dÞch cóm lªn
nÒn kinh tÕ toµn cÇu nãi chung vµ ViÖt Nam nãi riªng lµ kh«ng ®Õm ®-
îc. Theo c¸c tµi liÖu [] [], nguån nguyªn liÖu axit shikimic ®îc sö dông chñ
yÕu cho qu¸ tr×nh tæng hîp oseltamivir - thµnh phÇn chÝnh cña thuèc
Taminflu, ®îc chiÕt xuÊt tõ qu¶ Håi ë Trung Quèc vµ ViÖt Nam. ChÝnh
v× vËy, x©y dùng ph¬ng ph¸p chiÕt t¸ch axit shikimic víi hiÖu suÊt cao tõ
qu¶ Håi ®· ®îc nhiÒu nhµ khoa häc trong vµ ngoµi níc quan t©m.
Th«ng thêng, hµm lîng axit shikimic trong qu¶ Håi phô thuéc vµo
tõng gièng Håi, tõng vïng sinh th¸i, thêi vô thu h¸i vµ ®iÒu kiÖn chiÕt
xuÊt. ViÖc x¸c ®Þnh nhanh vµ chÝnh x¸c hµm lîng axit shikimic trong
qu¶ Håi sÏ rÊt cã Ých cho qu¸ tr×nh tuyÓn chän nguån nguyªn liÖu tèt,
tiÕn tíi cung cÊp nguån nguyªn liÖu víi khèi lîng lín cho qu¸ tr×nh chiÕt
xuÊt axit shikimic hµng lo¹t, phôc vô cho s¶n xuÊt Taminflu.
Nguån nguyªn liÖu Håi
Håi (Illicium verum) ®îc trång réng r·i ë mét sè huyÖn thuéc c¸c
tØnh L¹ng S¬n, Qu¶ng Ninh, vµ mét vµi ®Þa ph¬ng thuéc miÒn Nam
Trung Quèc. Qu¶ Håi kh« vµ tinh dÇu Håi tõ xa xa ®· ®îc sö dông lµm
thuèc vµ gia vÞ. C©y Håi tõ l©u ®· ®îc g©y trång ë d¹ng rõng trång
hoÆc b¸n hoang d¹i t¹i c¸c tØnh miÒn nói §«ng B¾c níc ta. Qu¶ Håi vµ
tinh dÇu Håi ®· ®îc xuÊt khÈu sang c¸c níc Trung Quèc, §«ng ¢u, Cuba
vµ Ph¸p. Nhng sau chiÕn tranh biªn giíi phÝa B¾c diÖn tÝch rõng Håi
còng bÞ thu hÑp nhiÒu. Ngµy nay, nh ®· tr×nh bµy ë trªn, axit shikimic
chiÕt xuÊt tõ qu¶ Håi lµ nguån nguyªn liÖu quan träng trong viÖc s¶n
xuÊt thuèc Taminflu, thuèc ®Æc hiÖu phßng chèng bÖnh ®¹i dÞch cóm.
V× vËy, nh»m t¹o ®îc nguån nguyªn liÖu æn ®Þnh vÒ sè lîng vµ chÊt l-
4
- îng, x¸c ®Þnh hµm lîng axit shikimic chiÕt xuÊt tõ Håi lµ vÊn ®Ò cÇn ®îc
u tiªn quan t©m [].
I.2. C¸c ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm lîng axit shikimic tõ qu¶ Håi
I.2.1. X©y dùng ph¬ng ph¸p chiÕt t¸ch axit shikimic tõ qu¶ Håi
Cã rÊt nhiÒu ph¬ng ph¸p sö dông ®Ó chiÕt t¸ch axit shikimic tõ c©y
Håi. Adams vµ céng sù [] chiÕt t¸ch axÝt shikimic tõ c©y Håi sö dông
ph¬ng ph¸p chiÕt Soxhlet vµ lµm s¹ch b»ng ph¬ng ph¸p trao ®æi anion
vµ Solka-Floc ®· ®¹t ®îc hiÖu suÊt tíi 7%. Payne vµ Edmonds [] còng sö
dông ph¬ng ph¸p nµy nhng sö dông kü thuËt lµm s¹ch tÈy mµu b»ng
than ho¹t tÝnh. C¸c t¸c gi¶ nµy còng cho r»ng cã thÓ s¾c ký trao ®æi ion
trong qu¸ tr×nh tinh chÕ axit shikimic do sù cã mÆt cña nhãm chøc axit
cacboxylic trong cÊu tróc cña axit shikimic. T¸c gi¶ NguyÔn ThÞ LuyÖn
vµ céng sù [] ®· tr×nh bµy c¸c nghiªn cøu chiÕt t¸ch axit shikimic tõ hoa
Håi b»ng c¸ch chiÕt trong bÓ ®iÒu nhiÖt trong níc hoÆc b»ng c¸ch ®un
Håi lu trong cån. C¸c ph¬ng ph¸p sau ®¬n gi¶n, dÔ tiÕn hµnh vµ hiÖu
suÊt thu ®îc tõ 6-7%. Díi ®©y là một sè ph¬ng ph¸p thö nghiÖm chiÕt
t¸ch axit shikimic ®· ®îc tiÕn hµnh trªn c¸c mÉu qu¶ Håi.
MÉu tiÕn hµnh thö nghiÖm lµ mÉu hçn hîp cña c¸c mÉu qu¶ Håi.
Ph¬ng ph¸p C1: ChiÕt xuÊt axit shikimic trong bÓ siªu ©m b»ng
c¸c dung m«i kh¸c nhau
Nh ®· tr×nh bµy ë phÇn tæng quan, axit shikimic tan nhiÒu trong n-
íc, tan kÐm trong ete vµ rîu, kh«ng tan trong mét sè dung m«i h÷u c¬ nh
benzen, clorofooc vµ ete dÇu ho¶. TiÕn hµnh thÝ nghiÖm sö dông mét
sè dung m«i vµ hçn hîp dung m«i ®Ó chiÕt xuÊt axit shikimic trong bÓ
siªu ©m b»ng c¸c dung m«i nh sau:
- Dung m«i 1: níc cÊt
- Dung m«i 2: cån 96%
- Dung m«i 3: cån 50%
5
- C©n chÝnh x¸c 3g mÉu hçn hîp qu¶ Håi kh« ®· ®îc nghiÒn nhá
®em tiÕn hµnh chiÕt trong bÓ siªu ©m ë 50 0C trong 30 phót lÇn lît trong
c¸c dung m«i kh¸c nhau (níc cÊt, cån 96% vµ cån 50%). TiÕn hµnh chiÕt
ba lÇn, víi c¸c thÓ tÝch dung m«i lµ 50, 30 vµ 25ml dung m«i, thu tæng
dÞch chiÕt råi ®em ch¹y s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao HPLC. Víi dÞch
chiÕt lµ dung dÞch cån, tiÕn hµnh thªm bíc thÝ nghiÖm quay c« lo¹i
dung m«i råi hoµ tan l¹i trong níc tríc khi ch¹y s¾c ký láng. KÕt qu¶ cho
thÊy chiÕt b»ng dung dÞch níc cÊt lµ tèt nhÊt, ®ång thêi chøa Ýt t¹p
chÊt h¬n lµ dÞch chiÕt cån, ¶nh hëng ®Õn qu¸ tr×nh xö lý mÉu vµ ph©n
tÝch s¾c ký láng.
Ph¬ng ph¸p C2: ChiÕt xuÊt axit shikimic b»ng ®un Håi lu trªn bÕp
c¸ch thuû
- Dung m«i lµ cån 96%
- Dung m«i lµ cån 50%
- Dung m«i lµ níc cÊt
C©n chÝnh x¸c 3g mÉu hçn hîp qu¶ Håi kh« ®· ®îc nghiÒn nhá,
®em tiÕn hµnh ®un Håi lu víi thêi gian vµ lîng dung m«i ®Ó chiÕt nh
trªn. DÞch mÉu chiÕt ®îc ®em ch¹y qua s¾c ký láng.
KÕt qu¶ cho thÊy chiÕt trong dung m«i lµ níc cÊt tèt h¬n (trung
b×nh ®¹t 4,90%) so víi khi chiÕt b»ng cån 50% (trung b×nh ®¹t 4,65%)
vµ dung m«i cån 96% (trung b×nh ®¹t 4,60%).
KÕt luËn vÒ ph¬ng ph¸p chiÕt xuÊt:
Tõ c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu trªn ®· chän được ph¬ng ph¸p chiÕt b»ng
siªu ©m víi dung m«i lµ níc, ®¬n gi¶n vµ cho hiÖu suÊt chiÕt cao nhÊt.
X¸c ®Þnh nhiÖt ®é chiÕt:
6
- TiÕn hµnh chiÕt 3 lÇn chiÕt víi lîng mÉu thö lµ 3g hçn hîp mÉu
nghiªn cøu, mçi lÇn 30 phót víi lîng dung m«i lµ níc víi thÓ tÝch lÇn lît lµ
50, 30, 25 ml, lÇn lît ë c¸c nhiÖt ®é 30oC, 50oC, 70oC.
KÕt qu¶ cho thÊy chiÕt t¹i nhiÖt ®é 50oC trong dung m«i lµ níc cÊt
tèt h¬n (trung b×nh ®¹t 5%) so víi khi chiÕt ë 30 oC (trung b×nh ®¹t
4,90%) vµ ë 70oC (trung b×nh ®¹t 4,85%).
X¸c ®Þnh sè lÇn chiÕt:
TiÕn hµnh chiÕt 3 lÇn chiÕt víi lîng mÉu thö lµ 3g hçn hîp mÉu
nghiªn cøu, mçi lÇn 30 phót víi lîng dung m«i lµ níc víi thÓ tÝch lÇn lît lµ
50, 30, 25 ml. KÕt qu¶ cho thÊy, phÇn lín axit shikimic ®îc chiÕt ra trong
lÇn thø nhÊt.
DÞch chiÕt lÇn thø nhÊt cã hµm lîng axit shikimic chiÕm 65,5%
tæng axit shikimic cña mÉu sau 3 lÇn chiÕt.
DÞch chiÕt lÇn thø t: cã hµm lîng axit shikimic kh«ng ®¸ng kÓ
(0,6%).
KÕt qu¶ trªn cho thÊy, sau ba lÇn chiÕt víi sè lîng dung m«i nh trªn,
axit shikimic ®· ®îc chiÕt kiÖt khái mÉu.
I.2.2. X©y dùng ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm lîng axit shikimic
Theo c¸c tµi liÖu ®· c«ng bè, cã rÊt nhiÒu ph¬ng ph¸p kh¸c nhau
®Ó x¸c ®Þnh hµm lîng axit shikimic nh quang phæ so mµu, ®iÖn di mao
qu¶n, s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao… Trong ph¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu
n¨ng cao, rÊt nhiÒu t¸c gi¶ ®· sö dông c¸c lo¹i cét kh¸c nhau nh cét trao
®æi ion, cét silicagen dÉn xuÊt ho¸ NH 2, cét C18 [] [] [] []…
7
- Trªn c¬ së c¸c nghiªn cøu ®ã ngêi ta ®· tiÕn hµnh x©y dùng ph¬ng
ph¸p x¸c ®Þnh hµm lîng axit shikimic b»ng s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao sö
dông cét pha ®¶o C18, bao gåm 2 giai ®o¹n.
Giai ®o¹n 1: Xö lý mÉu b»ng ph¬ng ph¸p chiÕt pha r¾n SPE (solid
phase extraction)
DÞch chiÕt tæng nÕu ®îc b¬m trùc tiÕp vµo cét s¾c ký láng sÏ cho
ra c¸c pic nhiÔu trªn s¾c ®å, ®ång thêi lµm gi¶m tuæi thä cña cét. V×
vËy, cÇn läc mÉu, lo¹i t¹p chÊt tríc khi b¬m mÉu vµo hÖ thèng s¾c ký
láng b»ng c¸ch cho mÉu ®i qua cét chiÕt pha r¾n C 18 vµ sö dông dung
m«i thÝch hîp ®Ó gi¶i hÊp, sau ®ã ®îc läc qua mµng läc Whatman tríc
khi b¬m mÉu vµo s¾c ký láng.
Giai ®o¹n 2: §Þnh lîng axit shikimic b»ng ph¬ng ph¸p ngo¹i chuÈn
trªn m¸y s¾c ký láng nèi ghÐp khèi phæ HPLC-MS
- C¸c ®iÒu kiÖn ph©n tÝch hÖ HPLC:
+ M¸y s¾c ký láng HPLC-MS 1200 nèi ghÐp khèi phæ 6310 Ion trap
(Agilent Technologies, Mü).
+ Cét Zorbax XDB C18 4,6x150mm
+ NhiÖt ®é cét: 35oC
+ HÖ dung m«i: MeOH/H2O (0.1% formic acid) = 2/98
+ Thêi gian ch¹y: 10 phót
+ Tèc ®é dßng: 0.6 ml/phót
+ B¬m mÉu: 5 µl/lÇn
+ Bíc sãng: 254nm, 220nm, 212nm
+ Bíc sãng ®Þnh lîng: 254nm
- C¸c ®iÒu kiÖn hÖ MS:
8
- + Detector: MS Ion Trap víi chÕ ®é quÐt tù ®éng vµ bÉy m¶nh ë
Negative, m¶nh bÉy ®îc chän lµ 173
+ ¸p suÊt ®Çu phun: 30psi
+ NhiÖt ®é lµm kh«: 325oC
+ HÖ nÐn khÝ dung cã tèc ®é dßng 8l/phót
+ Kho¶ng quÐt phæ: 50-300m/Z
- ChuÈn bÞ mÉu vµ ®êng chuÈn:
+ Dung dÞch axit shikimic chuÈn ®îc pha thµnh c¸c nång ®é 0.05,
0.1, 0.25, 0.5, 1, 1.25, 1.5, 2, 3, 4, 5(mg/ml) ®Ó dùng ®êng ngo¹i chuÈn
+ X¸c ®Þnh ph¬ng tr×nh håi quy tuyÕn tÝnh thu ®îc tõ ®êng ngo¹i
chuÈn lµ
+ HÖ sè t¬ng quan R2
Axit shikimic sö dông lµ axit tinh khiÕt (>99%). X¸c ®Þnh thêi gian l-
u. Phæ UV cña pic axit shikimic cã mét cùc ®¹i hÊp thô t¹i 212nm [] [] [].
KÕt luËn vÒ ph¬ng ph¸p sö dông:
Dùa vµo c¸c kÕt qu¶ thÝ nghiÖm trªn, lùa chän ph¬ng ph¸p C1
(chiÕt siªu ©m trong níc 3 lÇn ë 50oC) ®Ó chiÕt t¸ch vµ sö dông ph¬ng
ph¸p ph©n tÝch sö dông s¾c ký láng nèi ghÐp khèi phæ ®Ó x¸c ®Þnh
hµm lîng axit shikimic.
9
- II. Tµi liÖu tham kh¶o
1. Adams H., Bailey N., Brettle R., Cross R., Frederickson M., Haslam
E., Macbeach F., Davies G. Tetrahedron. 1996, 52, p. 8565-8580.
2. Claudia Mardones, Antonieta Hitschfeld, Alejandra Contreras,
Karla Lepe, Luis Gutierrez, Dietrich von Baer, 2005. Comparison of
shikimic acid determination by capillary zone electrophoresis with
direct and indirect detection with liquid chromatography for varietal
differentiation of red wines. Journal of Chromatography A, 1085, p.
285–292.
3. §ç TÊt Lîi, 1999. Nh÷ng c©y thuèc vµ vÞ thuèc ViÖt nam. Nhµ
xuÊt b¶n Y häc, trang 524-525.
4. Eykman J.F. 1885, Rec. Trav. Chim. Pays-bas, 4, p. 32.
5. Jang S. and Singh G. 1998. Tetraheron 54, p. 4697- 4753.
6. Mangas J. J., J. Moreno, B. Suarez, A. Picinelli and D. Blanco,
1998. Chromatographic Analysis of Non-Volatile Strawberry,
Compounds. Chromatographia Vol. 47, No. 3/4, p. 197-202.
7. Natural products on CD-ROM dictionary, 2000. Version 11.1,
Copyright (c) 1982-2003 Chapman & Hall/CRC.
8. NguyÔn ThÞ LuyÖn, Lª TiÕn Hng, Phan TiÕn Thµnh, 2006. ChiÕt
xuÊt acid shikimic tõ hoa Håi. T¹p chÝ Dîc häc, sè 358 n¨m 46,
trang 8-9.
9. Payne Richard and Michael Edmonds, 2005. Isolation of Shikimic
Acid from Star Aniseed. Journal of Chemistry Education, 82 (4).
JCE Featured Molecules, an interactive modeling feature,
Only@JCE Online:
http://www.JCE.DivCHED.org/JCEWWW/Features/MonthlyMolecul
es
10. Romero Rodriguez M.A., Vazquez Oderiz, M.L., Lopez Hernandez
J., Simal Lozano J., 1992. Determination of vitamin C and organic
acids in various fruits by HPLC. Journal of Chromatographic
Science 30 (11), p. 433- 437.
11. Rompp. , 1992. Chimie Lexikon. Band 5, p. 4136
12. Stavric B. and D.R. Stoltz., 1976. Shikimic acid, Food Cosmet
Toxicol. 14(2), p.141–145.
13. Tusseau D. and C. Benoit, 1987. Routine high-performance liquid
chromatographic determination of carboxylic acids in wines and
champagne. Journal of chromatography 395, p. 323-33.
14. Vò Ngäc Lé, §ç Chung Vâ, NguyÔn M¹nh Pha, Lª Thuý H¹nh.
1996. Nh÷ng c©y tinh dÇu ViÖt Nam: Khai th¸c-ChÕ BiÕn-øng
dông. Nhµ xuÊt b¶n Khoa häc kü thuËt, tr. 94-97.
15. Wang X Q, Guo Y.J, Yang C.S., 2001. Determination of shikimic
acid in fruit of Illiciacea plants by HPLC with diode array detection.
China Journal of Chinese Material Medica, 26 (7): 447-9.
1
nguon tai.lieu . vn
