Xem mẫu
- THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI
TRONG PHẢN ỨNG PCR
BẰNG FASTPCR VÀ
DNA CLUB
- Mục tiêu của bài học
Thiết kế được những trình tự primer cho những
trình tự DNA khuôn (vi sinh vật, virus và các động
vật khác)
Phân tích được những thông số của primer qua
các phần mềm
2
Tì kim rnh ự i họ
m ế tì t snh c
- Quá trình sao chép DNA trong tế bào
3
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Qui trình phản ứng PCR
Thu nhận mẫu Các vi sinh
vật,
động vật Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được Mullis và
cộng sự mô tả vào năm 1986 và cũng do
chính phát minh này Mullis đã được trao
giải nobel vào năm 1993
4
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Thành phần trong phản ứng PCR
Phản ứng PCR được thực hiện khi có:
DNA mẫu
Primers (mồi xuôi và ngược dài khoảng 18-30 bp
không bắt cặp bổ sung )
Taq polymerase ( emzyme chịu nhiệt tách từ vi khuẩn
suối mước nóng Thermus aquaticus )
4 loại deoxiribomucleotid triphọtphat (dATP , dCTP,
dTTP , dGTP) ,
Dung dịch đệm và Mg2+
5
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- MÁY PCR
PCR là một kỹ thuật duy nhất để
khuếch đại một mẫu DNA mong
muốn khuếch đại (ví dụ những đoạn
gene của vi sinh vật, vi khuẩn hay
những đoạn gene của người và
những động vật khác)
6
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Nguyên tắc trong phản ứng PCR
Biến tính
Bắt cặp
Kéo dài
7
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Nguyên tắc trong phản ứng PCR
Phản ứng PCR gồm có 3 giai
đoạn:
• Biến tính DNA mẫu T=940C
• Bắt cặp mồi Tm = 550C-650C
• Giai đoạn kéo dài, tổng hợp
DNA mới T kéo dài =700C
8
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Mục đích, nguyên tắc
Mồi là những đoạn nucleotide ngắn, bắt cặp bổ sung
với đầu 5' hay đầu 3' của mạch DNA khuôn mẫu. Mồi
được thiết kế dựa vào 2 vùng trình tự đã được biết,
nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuếch đại.
Forward primer
Reverse primer
Đoạn DNA cần khuếch đại
9
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Primer là gì?
Primer là một đoạn ngắn oligonucleotide nó là khả
năng bắt cặp bổ sung với DNA khuôn
Primer sẽ bắt cặp với đoạn DNA khuôn (DNA mục
tiêu) cần khuếch đại số lượng lớn DNA
10
Tì kim rnh ự i họ
m ế tì t snh c
- Đặc tính của primer
1. Tính chuyên biệt
2. Tính ổn định nhiệt độ của phản ứng
3. Tính tương thích cặp primer
11
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Tính chuyên biệt
Chỉ có duy nhất một vị trí bắt cặp của primer trên
khuôn DNA.
Template DNA
5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3
’ CAGTCAACTGCTAC
GTTGAACGTA GTTGAACGTA
Primer càng dài thì nó càng thể hiện tính duy nhất và
nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ bắt cặp càng cao. Để
đảm bảo tính duy nhất chiều dài của primer 17-28
base.
Thành phần (G+C) trung bình khoảng từ 50-60% sẽ
cho ta nhiệt độ lai Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c 12
- Tính chuyên biệt
Tỷ lệ G/C trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệt
độ lai thích hợp
13
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Nhiệt độ của primer
1. Nhiệt độ nóng chảy:
Tmealt: Nhiệt độ nóng chảy là nhiệt độ của mồi khi
chưa bắt cặp với DNA khuôn
Tmprimer=59.9+0.41*(%GC)-600/(chiều dài nucleotide)
khi mồi chưa bắt cặp với DNA, thường nhiệt độ nóng
chảy từ 55-650C.
2. Nhiệt độ bắt cặp:
Tanneal:Là nhiệt độ của đoạn mồi bắt cặp với DNA
khuôn
Tanneal= Tm-primer -40C
14
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Tính ổn định
Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm và nhiệt độ bắt cặp
của mồi T anneal là hai yếu tố quan trọng để đảm
bảo phản ứng PCR thành công và thu được sản phẩm
khuếch đại (một số lượng lớn bản sao của đoạn DNA
dùng làm khuôn ban đầu).
Việc tính toán bằng phương pháp thủ công để kiểm
tra các yêu cầu trên cho mỗi đoạn mồi dự định thiết
kế là rất tốn thưòi gian và công sức. Công việc này
trở nên dễ dàng và nhanh chóng nhờ các phần mềm
thiết kế mồi.
15
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Tính ổn định
Cấu trúc kẹp
tóc
16
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Thiết kế mồi
Trình tự DNA
khuôn
1. Lấy các thông
số từ phần
Thiết kế mềm
Thông số của
Primer 2. Kiểm tra đặc
phản ứng PCR
hiệu của
Primer
bằng blast
Các qui tắc
chọn primer
17
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Làm thế nào để biết trình tự khuôn
Giải trình tự DNA hoặc RNA của các sinh vật (chúng ta
sẽ biết tự nucleotide của sinh vật) từ đó thiết kế phản
ứng mồi theo trình tự đã giải.
Chúng ta có thể lấy trình tự nucleotide của các sinh vật
trên cơ sở dữ liệu NCBI rồi từ đó thiết kế những primer
qua những phần mềm thiết kế PCR
18
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
- Trình tự DNA khuôn
- Trình tự đích quan trọng trong phát hiện vi sinh vật
- Trình tự vừa có vùng bảo tồn cao cho một nhóm vi
sinh vật và vừa có vùng biến động đặc trưng cho từng
loài riêng biệt
Ví dụ 1: Các loài Ecoli co gen mã hóa ngoại độc tố: ST (heat
stable) và heat labile (LT) bảo tồn cao
Ví dụ 2: Enterotoxigenicm kim trình tự si(ETEC), Enteropathogenic19
Tì E. coli nh ọ
ế hc
- Tính tương thích
Mồi làm việc theo cặp, mồi xuôi và mồi ngược. Chúng
sử được sử dụng trong cùng điều kiện của phản ứng
PCR.
ột đặc điểm phải chú ý nhất về sự hòa hợp này là
nhiệt độ bắt cặp (Tanneal)
Nhiệt độ này thể hiện sự tương thích giữa mồi xuôi và
mồi ngược
20
Gi it ệ mô họ
ớ hiu n c
nguon tai.lieu . vn