Xem mẫu
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
MỤC LỤC
PHẦN I: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM THỰC VẬT
I. Nguồn nguyên liệu thu nhận ezym trang 2
II. Phương pháp thu nhận enzym từ thực vật trang 3
1. Sơ đồ quy trình công nghệ trang 3
2. Thuyết minh quy trình trang 4
III. Những tiêu chuẩn tinh khiết của enzym trang 13
trang
PHẦN II: THU NHẬN BROMELIN TỪ DỨA
I. Tổng quan về enzym bromelin trang 15
II. Phương pháp thu nhận bromelin trang 21
III. Phương pháp tinh sạch bromelin trang 23
1. Phương pháp thẩm tích trang 23
2. Lọc qua gel sephadex trang 24
3. Phương pháp sắc kí trang 24
IV. Ưng dụng trang 25
V. Chế phẩm bromelin thương mại trang 29
PHẦN III: THU NHẬN PAPAIN TỪ ĐU ĐỦ
I. Tổng quan về enzym papain trang 30
II. Phương pháp thu nhận papain trang 35
1. Thu nhựa đu đủ trang 36
2. Thu nhận papain trang 38
3. Nghiên cứu phương pháp mới thu nhận papain
ới trang 39
III. Phương pháp tinh sạch papain trang 40
IV. Ưng dụng trang 41
V. Chế phẩm bromelin thương mại trang 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO trang 44
1
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
PHẦN 1:
PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN
ENZYM THỰC VẬT
http://www.sarisegar.com/product.php
2
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
I. NGUỒN NGUYÊN LIỆU THU NHẬN ENZYM [1]:
Vì enzym là những chất không thể chế biến được bằng phương pháp tổng hợp hoá
học nên người ta thường thu chúng từ các nguồn sinh học. Mặc dù enzym có trong tất cả
các cơ quan, mô của động, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách
enzym nhất là tách với quy mô công nghiệp một cách thuận lợi về kinh tế chỉ có thể tiến
hành trong những trường hợp nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzym với hiệu suất cao.
Trong tay con người có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản: các mô và cơ quan
động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật.
1. Từ động vật:
Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhày dạ
dày, tim … những phế liệu của công nghiệp thịt – dùng để tách enzym rất tiện lợi. Dịch
tụy có chứa amilase, lipase, protese, ribonuclease và một số enzym khác.
Từ ngăn thứ tư của dạ dày bê nghé người ta thu chế phẩm renin để làm đông sữa
trong sản xuất phomat. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Khác với
pepsin, renin có khả năng đông tụ sữa cao mà không thuỷ phân sâu sắc casein. Renin là chế
phẩm enzym có giá trị lớn trong công nghiệp.
Tuy vậy, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong nền kinh tế quốc dân,
protease động vật ít thuận lợi do sản xuất chúng bị hạn chế và lượng nguyên liệu để thu
enzym không lớn lắm.
2. Từ thực vật:
Người ta cũng thu được một số chế phẩm enzym thuỷ phân như papain, bromelin,
ficin. Đó là các protease thực vật. Người ta thu papain từ nhựa (mủ) đu đủ xanh bằng cách
khuấy nhựa một thời gian và sau đó tách lấy kết tủa protein và đem sấy khô nghiền nhỏ.
Bromelin thu từ thân dứa. Sau khi hái quả người ta bỏ lá và ép thân lấy dịch rồi dùng dung
môi hữu cơ kết tủa enzym trong dịch ép. Ficin được tách từ dịch ép thân và lá giống Ficus.
Thực vật (malt đại mạch và các hạt nảy mầm khác) cũng là nguồn enzym có truyền
thống được dùng trong công nghệ rượu, bia, bánh kẹo. Malt chủ yếu có chứa amylase hoạt
động, còn các enzym thuỷ phân khác hoạt động yếu. Tuy thế, thu các chế phẩm enzym
thuần khiết từ malt không phổ biến và không kinh tế, bởi lẽ khi tách enzym tinh khiết từ
malt thì những chất không hoà tan quí giá (tinh bột, protid) sẽ không được sử dụng. Mặt
3
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
khác, malt là nguyên liệu đắt tiền. Lượng enzym thu được từ thực vật là không lớn lắm so
với lượng nhiên liệu tiêu hao.
3. Từ vi sinh vật:
Sau khi đã điểm qua các nguồn nguyên liệu động thực vật chính có thể từ đó chiết
xuất các chế phẩm enzym, chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu đó vì nguyên nhân
nào khác (về công nghệ hay kinh tế...) không thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với
quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzym nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế
quốc dân. Như vậy, trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật
là dồi dào và đầy hứa hẹn, vì dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế
phẩm enzym sẽ khắc phục được những khó khăn và hạn chế trên.
Ta có thể thu enzym từ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Đây là nguồn nguyên liệu vô
tận để sản xuất một lượng enzym lớn, việc thu chế phẩm dễ dàng bên cạnh đó enzym của
vi sinh vật có hoạt tính mạnh.
II. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM TỪ THỰC VẬT [1], [2]:
1. Quy trình công nghệ:
N guyeâ i u
n leä
Phaù eá o
t
vôõ baø
Thu ch
dò enzym hoâ
t
Taùh
c enzym
Ti s ch
nh aï
C heá m
phaå
enzym
4
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
2. Thuyết minh quy trình công nghệ:
a. Phá vỡ tế bào
Trong cơ thể sinh vật, enzym có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân
microxom, mitochrondri..…) của tế bào. Các phân tử enzym không có khả năng đi qua màng
của tế bào và màng của các cấu tử (mitochrondri) của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các
enzym nội bào, trước hết cần phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc
của tế bào bằng các biện pháp:
• Xay nhuyễn
• Nghiền: nghiền với bột thủy tinh hoặc cát sạch ….
• Đồng hóa: dùng áp cao để phá vỡ tế bào mô thực vật, từ đó làm giảm độ nhớt
của dịch chiết, phóng thích các enzym nội bào mà không làm biến tính chúng.
Điều này cũng tạo thuận lợi khi ta sử dụng phương pháp siêu lọc để làm tinh
sạch enzym.
• Sử dụng sóng siêu âm.
• Sử dụng dung môi hữu cơ: rượu butylic, aceton, glycerine...
b. Thu dịch enzym thô
Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, enzym được chiết bằng nước, bằng các dung
dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính.
Có thể sử dụng các phương pháp lắng, lọc, ly tâm, trích ly.
c. Tách enzym
Có thể sử dụng nhiều phương pháp như:
Phương pháp kết tủa enzym:
Nguyên tắc: điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn 7, do đó trong điều kiện
sinh lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này kết
hợp với đầu mang điện tích dương của phân tử nước cũng như các ion dương. Điều này
làm cho cản trở sự kết tủa của chúng. Enzym có bản chất protein, do đó để kết tủa được
enzym phải phá vỡ lớp nước xung quanh bằng cách bổ sung vào dung dịch enzym các dung
môi hoặc các hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra
khỏi phân tử protein, giúp cho protein tủa xuống.
Các dung môi thường sử dụng là acetone, ethanol, các muối trung tính ở nồng độ
cao như ammonium sulphate.
Những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng chế phẩm enzym là:
- Nồng độ của ammonium sulphate.
- pH của dịch chiết.
- Nhiệt độ kết tủa.
- Thời gian tiếp xúc của tác nhân đệm và dịch chiết.
Phương pháp siêu lọc:
5
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
Dung dịch enzym thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa nhiều tạp
chất. Đầu tiên sử dụng phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn. Sau đó chuyển sang
dùng phương pháp siêu lọc để loại bỏ các chất có phân tử lượng thấp hơn protein enzym
đồng thời cô đặc enzym.
Màng siêu lọc: được cấu tạo bằng các sợi rỗng. Trong mỗi sợi rỗng lại có chứa
nhiều sợi rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất
thấm qua. Các sợi này được chế tạo từ các loại polimer bền như fluoro polimer (FS),
cellulose acetate (CA), polysulphone(GR)…. Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử
dụng loại màng thích hợp. Ví dụ, cô đặc protein: dùng màng FS, GR, cô đặc enzym: dùng
màng GR.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc
- Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với loại sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi
chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong
quá trình siêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng.
- Ap suất: thường áp suất của dòng chảy sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho
đến khi đạt giá trị cực đại. Nếu áp suất tăng cao hơn nữa thì tốc độ dòng chảy sẽ
giảm.
Các kiểu siêu lọc:
Kiểu một bước
Thấm qua màn
Thấ
Chậu
Chậ
chứa
chứ PL1 PL2
Cô đặc
đặc
Màng siêu lọc
lọ Van
bơm
Hình II.2c.1: Kiểu lọc một bước
Kiểu lô: chất lỏng chảy tuần hoàn qua màng đến nồng độ của dịch cô đặc ở trong
chậu chứa đạt được như yêu cầu.
Thể tích đầu
Thể đầu Thấm qua
Thấ
Chậu
Chậ màng
chứa
chứ PL1 PL2
6
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
Thể tích cuối
Thể cuố
Cô đặc
đặc
van
bơm màng siêu
lọc
Hình II.2c.2: Kiểu lô
Kiểu thể tích không đổi: dòng chất lỏng được cung cấp liên tục để thể tích ở trong
chậu chứa không thay đổi và chất lỏng tuần hoàn qua màn đến nồng độ của dịch cô đặc ở
trong chậu chứa đạt được như yêu cầu.
Thấm
Thấ
Thể tích
Thể qua
Chậu
Chậ không màng
chứa
chứ PL11
PL11 PL2
đổi
đổi
Cô đặc
đặc
bơm
Hình II.2c.3: Kiểu thể tích không đổilọc van
Màng siêu lọ
Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc:
- Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể.
- Đối với enzym có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính.
- Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzym. Trong quá trình
thực hiện nếu cho thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzym càng cao.
- Trong quá trình siêu lọc nếu nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzym,
do đó nhiệt độ 10-20oC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng
suất mà không làm mất hoạt tính enzym càng cao. Trong quá trình siêu lọc có
thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt độ thấp (5oC).
Phương pháp hấp phụ:
Hấp phụ “trong thể tích” (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào trong dịch enzym) hoặc
trên cột (sắc kí hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzym. Hấp phụ
chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong 2 cách – chất hấp phụ protein tạp hoặc
chất hấp phụ enzym. Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0oC. Enzym sau đó được
chiết sau đó bằng các dung môi thích hợp.
d. Tinh sạch
7
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
Enzym rất dễ bị giảm hoạt tính và biến tính dưới tác dụng của các tác nhân bên
ngoài. Do đó khi tinh chế enzym, để tránh sự biến tính protein gây ảnh hưởng xấu đến
hoạt tính enzym, cần tiến hành nhanh quá trình trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian
ngắn, môi trường có pH thích hợp và không có mặt các chất gây biến tính.
Bốn phương pháp chính và cổ điển thường được áp dụng khi tinh chế enzym là:
- Hấp phụ trên gel
- Phương pháp thẩm tích
- Cột sắc kí (ví dụ: DEAE –cellulose)
- Kết tủa phân đoạn
- Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Để tinh chế enzym một cách hiệu quả cần kết hợp nhiều phương pháp khác nhau.
Phương pháp hấp phụ có chọn lọc:
Đây là một trong những phương pháp tinh chế enzym quan trọng và thành công
nhất, thường được dùng để làm đặc dung dịch enzym.
Nguyên tắc: cho dịch enzym chảy từ từ qua cột chất hấp phụ. Tùy theo khả năng
tương tác của các chất hấp phụ với từng loại enzym, các enzym khác nhau sẽ được hấp
phụ trên chất hấp phụ với khả năng khác nhau. Sau đó dùng các dung dịch đệm thích hợp
để chiết rút enzym ra khỏi cột.
• Có thể hấp phụ chọn lọc enzym theo hai cách:
- Hấp phụ âm tính: dùng chất hấp phụ để tách tạp chất ra khỏi dung dịch enzym.
- Hấp phụ dương tính: enzym được hấp phụ và được tách ra khỏi những cấu tử
khác trong dung dịch, sau đó được rửa giải khỏi chất hấp phụ bởi dung dịch
đệm pH kiềm hoặc các dung dịch đệm khác có khả năng rửa giải enzym. Sau
khi ly tâm để loại các hợp chất không tan, dung dịch enzym có thể được thẩm
tách để loại dung dịch đệm.
• Để hấp phụ enzym tốt nhất, cần tuân theo những nguyên tắc chung sau:
- Hàm lượng protein trong dung dịch không vượt quá 1%.
- Tỷ lệ của gel (trọng lượng khô) đối với protein thường là 20:1
- Môi trường hơi acid, pH = 5 - 6
- Nồng độ chất điện ly (muối) thấp trong dung dịch. Sự tồn tại của bất kì một
lượng muối nào cũng gây ảnh hưởng tới quá trình hấp phụ. Vì thế một lượng
lớn hơn chất hấp phụ phải được sử dụng để thu được kết quả mong muốn.
- Sự hấp phụ enzym hiệu quả nhất khi được tiến hành ở 0 oC trong lúc trộn dung
dịch với chất hấp phụ để đạt trạng thái cân bằng. Đây là một phương pháp
nhanh, sự cân bằng giữa các chất hấp phụ và dung dịch hình thành rất sớm và
chỉ sau vài phút ly tâm sẽ lắng được chất hấp phụ.
• Quá trình được tiến hành tuần tự như sau:
- Cho vào dung dịch enzym liên tiếp những lượng gel thích hợp.
- Trộn đều
- Quay lắng
- Thu hồi từng phần gel trước khi cho phần tiếp theo vào.
8
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
Để mức độ tinh khiết của enzym thu được cao nhất, lượng chất hấp phụ phải
được điều chỉnh sao cho những phân đoạn đầu tiên (phần sẽ được loại bỏ) lấy đi khoảng
10% enzym và sau khi thu những phân đoạn hoạt động, phải còn lại 10% enzym trong dung
dịch.
Để thu nhận enzym ta sẽ tiến hành rửa giải từ chất hấp phụ. Nếu enzym không
được rửa hấp bằng nước thì cần phân tán phần hấp phụ vào nước và ly tâm lại. Trong sản
xuất, để gel phân tán tốt trong nước rửa hoặc chất giải hấp cần phải có cánh khuấy với
tốc độ cao. Giải hấp enzym sẽ hiệu quả hơn trong dung dịch đệm base nhẹ (pH = 7,6).
Quá trình càng hiệu quả với dung dịch (NH4)2SO4 10%. Thể tích dung dịch rửa giải không
nên quá lớn, thường là ít hơn thể tích gel ly tâm. Tốt hơn nên tiến hành rửa giải nhiều lần
với thể tích nhỏ hơn là một lần với một lượng lớn.
Phương pháp thẩm tích
Lấy enzym thô pha trong dung dịch đệm thích hợp, sau khi tất cả enzym đã hòa tan
thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa dung dịch đệm ban đầu. Túi
cellophane được chuẩn bị bằng cách: trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm
trên. Tiến hành thẩm tích trong thời gian thích hợp, nếu có thể thì nên thay dung dịch đệm
bên ngoài nhiều lần để đạt tinh sạch cao. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên
tục bằng một máy khuấy từ.
Trong quá trình thẩm tích, khi thay đổi nhiệt độ trong một giới hạn nhất định thì
vận tốc khuếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng nhiệt độ. Nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độ vượt
qua mức cho phép thì protein enzym sẽ bị biến tính do nhiệt độ cao làm ảnh hưởng đến
những mối tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzym. Chính vì vậy, để làm giảm sự
biến tính của enzym do nhiệt, người ta thường tiến hành tinh sạch enzym ở nhiệt độ thấp.
Cột sắc ký:
Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả để chiết tách enzym tinh khiết.
Quá trình phân tách có thể dựa trên sự hấp phụ, trao đổi ion hoặc hiệu ứng rây phân tử.
Nhưng trên thực tế, hầu như các quá trình phân tách đều chịu ảnh hưởng của cả ba quá
trình trên.
Nguyên tắc: cho dung dịch chế phẩm enzym vào trong dung dịch đệm với cột trao
đổi ion đã được cân bằng, tiến hành giải hấp phụ bằng dung dịch điện giải (grdient muối)
với nồng độ tăng dần chảy qua các cột, các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi cột các
enzym vừa liên kết với nhựa. Khi đó enzym nào có ái lực với nhựa kém nhất sẽ dễ bị đẩy
ra khỏi nhựa nhất, lần lượt các enzym khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần
chiết khác nhau, trong đó có phần chứa enzym cần thu với nồng độ cao nhất.
Các chất trao đổi ion có thể được sử dụng là nhựa resin trao đổi ion (đặc biệt là
amberlite IRC-50, XE-64), những dẫn xuất khác nhau của cellulose như diethylaminoethyl
cellulose (DEAE-cellulose), carboxymethyl cellulose (CMC). Dùng nhựa trao đổi ion chỉ thu
được hiệu quả tốt đối với những enzym có trọng lượng phân tử tương đối nhỏ, có điểm
đẳng điện trong vùng kiềm, đồng thời việc rửa giải những enzym phân tử lớn ra khỏi cột
cũng gặp không ít khó khăn. Vì thế DEAE-cellulose và CMC thường được sử dụng rộng rãi
hơn do có khả năng loại bỏ được các tạp chất acid nucleic.
9
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
Quá trình phân tách được tiến hành tuần tự như sau:
- Lấy một thể tích V dung dịch (không quá 1/3 thể tích cột) cho chảy một lần qua
cột để loại muối ra khỏi dung dịch protein.
- Protein chảy ra khỏi cột với một thể tích dung dịch hơi lớn hơn so với thể tích
của nó lúc đưa vào cột.
- Trên các cột chứa sephadex G-75, G-100, G-200 đồng thời xảy ra sự phân tách
từng phần các protein tùy theo phân tử lượng của chúng.
- Ngoài sephadex, tất cả các cột đều cần gradient muối cho việc rửa giải. Các ion
của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi nhựa các enzym vừa liên kết với nhựa. Đẩy
protein kết hợp ra bởi các ion khác bằng các cách sau:
- Tăng nồng độ các dung dịch đệm.
- Tăng nồng độ dung dịch NaCl hay KCl thêm vào dung dịch.
- Thay đổi pH của dung dịch tách.
Các phân đoạn có chứa enzym với hoạt tính riêng lớn nhất (là phân đoạn chứa
enzym cần thu) được tập trung lại, loại bỏ muối và làm cô đặc (hoặc làm khô) bằng cách
loại hơi ẩm trong chân không ở nhiệt độ thấp.
Phương pháp sắc kí trao đổi ion được áp dụng rộng rãi khi phân tách hỗn hợp
protein và trong tách riêng những enzym và hormone tinh khiết tới mức tối đa. Nhờ đó,
người ta đã loại được những tạp chất protein nhỏ ra khỏi những chế phẩm enzym thuần
nhất về điện ly.
Điện di:
Là phương pháp vật lý có giá trị để phân tách các hỗn hợp protein, enzym và cũng là
phương pháp để xác định sự tinh khiết của các chế phẩm protein. Gần đây, phương pháp
này được áp dụng ở những giai đoạn tinh chế enzym cuối cùng.
Nguyên tắc:
Phân tử protein có điện tích tự do chứa nhóm acid, base. Nếu các phân tử protein
enzym không đặt ở những điểm đẳng điện (ở đó tổng điện tích âm bằng tổng điện tích
dương) thì dưới ảnh hưởng của điện trường ngoài, chúng di chuyển trong điện trường ở
những điều kiện nhất định về pH, lực ion và nhiệt độ cũng khác nhau. Do đó, hỗn hợp
protein được phân tách ra thành một số vùng riêng biệt hoặc những phân đoạn riêng biệt.
Những phân đoạn enzym thu được được xác định hàm lượng protein, hoạt độ enzym và
biểu diễn trên biểu đồ để thấy rõ.
Kết tinh:
Khi enzym đã đạt đến độ tinh khiết phù hợp, nó có thể kết tinh. Tuy nhiên, kết tinh
không có nghĩa là chế phẩm enzym tinh khiết. Hoạt độ riêng của tinh thể tăng khi các
enzym tái kết tinh và quá trình tái kết tinh cần lặp lại nhiều lần cho đến khi hoạt độ riêng
tăng đến một giá trị cao nhất, không tăng được nữa.
Phương pháp kết tinh và tái kết tinh được ứng dụng khi tinh chế enzym như là một
phương pháp phân đoạn protein có giá trị. Vì thế, tốt nhất nên xem quá trình kết tinh như là
một phương pháp cụ thể của quá trình phân đoạn, và được sử dụng ở những giai đoạn tinh
thể cuối cùng.
10
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
Sự kết tinh enzym thường được tiến hành từ các dung dịch ammonium sulfat. Để
thu được những tinh thể tốt, quá trình được tiến hành chậm và từ từ qua nhiều ngày hoặc
tuần. Phương pháp thông thường là thêm từ từ muối vào dung dịch enzym đậm đặc cho
đến khi bắt đầu thấy đục rõ. Có thể thêm dung dịch muối nồng độ cao từng giọt, từng giọt
hoặc thông qua ống mao quản hay màng thẩm tích ( trong một số trường hợp dung dịch
enzym được thẩm tích đối với dung dịch ammonium sulfate cho tới khi xuất hiện đục),
hoặc dung dịch đơn giản được làm bay hơi chậm. Sau đó, người ta để yên các dung dịch,
không khuấy trộn trong vài ngày ở nhiệt độ lạnh, khi đó những tinh thể enzym sẽ xuất
hiện như ý muốn. Khi thêm nồng độ muối cao, thường enzym kết tủa dưới dạng vô định
hình. Ngoài ra cần thử thực nghiệm nhiều giá trị pH và nhiệt độ để đạt hiệu quả kết tinh.
Thay vào đó, quá trình kết tinh được tiến hành ở những nồng độ muối xác định bằng cách
thay đổi đều đặn và từ từ pH hoặc nhiệt độ. Nếu trước khi kết tinh mà thấy dung dịch
enzym loãng thìa cần cô đặc dung dịch trước.
Quá trình kết tinh sẽ dễ dàng hơn nếu một trong những giai đoạn trước đó là quá
trình phân đoạn với dung môi hữu cơ. Những tinh thể lắng xuống đựơc tách riêng và được
tái kết tinh nhiều lần, mỗi lần lại đo hoạt độ riêng. Sự tái kết tinh được làm đi làm lại
nhiều lần cho tới khi hoạt độ riêng của chế phẩm không tăng lên nữa.
Phối hợp những phương pháp phân đoạn khác nhau khi tinh chế:
Khi tiến hành tinh chế các enzym, trình tự áp dụng các phương pháp phân đoạn
khác nhau phải được xác định. Trình tự hiệu quả nhất được xác định thông qua thực
nghiệm, nhưng cần lưu ý một số điểm sau:
- Hiển nhiên quá trình kết tinh là phân đoạn tinh chế sau cùng.
- Quá trình đun nóng nên được tiến hành đầu tiên do khả năng tách riêng một
phần đáng kể các protein không cần thiết, đặc biệt khi chế hoá những lượng
lớn dịch chiết ban đầu.
- Khi sử dụng phép diêm tích phân đoạn bằng ammonium sulphate hoặc kết tủa
bằng các dung môi hữu cơ ở những giai đoạn tinh chế đầu tiên, khi đó ta có
những thể tích dung dịch lớn, cần phải nhanh chóng tách riêng protein tủa
xuống.
- Đôi khi người ta bắt đầu sự hấp phụ âm tính hoặc dương tính trên aluminum
hydroxide hoặc calcium phosphate. Những tủa thu được khi đó dễ tách biệt
bằng cách để lắng cặn hay ly tâm ở tốc độ nhỏ.
- Hoạt tính của enzym có thể giảm trong suốt quá trình thẩm tích do enzym rất
kém bền, các chất bổ trợ bị loại bỏ nhưng nguyên nhân thông thường nhất (trừ
khi sử dụng nước tinh khiết) là do các kim loại ức chế có trong nước như Cu.
Enzym thường có ái lực cao đối với những enzym này ngay cả khi nồng độ của
chúng trong nước rất thấp. Điều này không quá nghiêm trọng đối với các chế
phẩm thô như trong các giai đoạn sau này.
Để có thể loại muối ra khỏi dung dịch, người ta cũng tiến hành thẩm tích. Cột chứa
jela sephadex có thể loại trừ muối một cách nhanh chóng và hoàn toàn khỏi những thể tích
dung dịch lớn. Các phương pháp sử dụng cột thường không tiện lợi khi áp dụng trong
phạm vi sản xuất lớn vì thế nó thích hợp hơn cho những giai đoạn sau của quá trình tinh
11
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
chế. So với các phương pháp khác, những phương pháp sử dụng cột tiêu hao một không
gian đáng kể cho việc lắp cột, rửa và rửa giải cột, đồng thời sự hoà tan enzym trong quá
trình rửa giải có thể xảy ra.
Sự đun nóng thường đưa lại kết quả tốt đẹp khi kết tủa những enzym không có
hoạt tính. Tuy nhiên nó lại ức chế đáng kể một số enzym, do đó hoạt tính của enzym chỉ
tăng lên rất ít.
Những phương pháp làm đặc dung dịch protein như thổi không khí từ quạt máy vào
dung dịch đựng trong các túi cellophane, làm đông đặc bằng cách làm bốc hơi chân không,
làm đông khô,… thường gây biến tính enzym và ngoài sự cô đặc enzym còn xảy ra sự gia
tăng nồng độ muối. Tốt nhất để cô đặc dung dịch protein-enzym, ta tiến hành siêu ly tâm
hoặc xử lý bằng huyền phù dextran sephadex khô.
Nếu chế phẩm enzym đã được tinh chế tương đối tốt và chỉ còn chứa một lượng
nhỏ protein không hoạt động, thì điện di có thể đưa lại những kết quả mỹ mãn về mặt làm
giàu enzym. Muốn vậy ta cần có enzym với thể tích nhỏ.
Phương pháp sắc kí trao đổi ion trên các ionit cellulose có thể được sử dụng để
chiết xuất sơ bộ các enzym. Từ hỗn hợp protein phức tạp, ta có thể tách riêng từng phân
đoạn protein enzym. Vì thế phương pháp này cùng với sự sử dụng các chất trao đổi ion
khác nhau có thể được sử dụng trước khi điện di hoặc sau khi điện di.
Ở bất kì giai đoạn tinh chế nào, enzym đều có thể được chiết ra dưới dạng khô
bằng cách đông khô. Thế nhưng, cùng với việc tinh chế loại trừ những chất lẫn theo, tính
dễ hỏng của enzym cũng tăng lên. Các chế phẩm enzym thô có thể được duy trì khá lâu ở
40oC.
Các phương pháp khác:
• Ngoài những phương chính kể trên còn có một số phương pháp khác sử dụng cho từng
trường hợp riêng cụ thể và được áp dụng khi các phương pháp nêu trên không đem lại
hiệu quả cao. Có thể kể đến ba phương pháp sau:
• Làm biến tính bởi chloroform (còn gọi là phương pháp Tsuchihashi): lắc dung dịch
enzym với hỗn hợp cồn và chloroform để tách các protein không hoạt động ra trước.
• Sử dụng các chất gây tủa khác: thêm vào thận trọng một lượng xác định muối kim loại
nặng (Pb) ở giai đoạn đầu để loại bỏ những protein không mong muốn mà không làm
giảm hoạt độ enzym.
• Cô đặc: đối với những trường hợp chất hấp phụ có ái lực cao với enzym thì nước giải
hấp chỉ chứa enzym với nồng độ thấp, do đó nếu ta cô đặc dung dịch enzym tới một
lượng nhỏ hơn sẽ đạt được hiệu quả tinh chế cao hơn. Có thể sử dụng các cách sau:
- Đông lạnh dung dịch enzym và tách bỏ đá.
- Đặt dung dịch enzym vào ống thẩm tích và để nó trong dòng không khí ấm.
- Làm đông khô (thường được sử dụng, cô đặc cả enzym và muối).
- Cô đặc dung dịch bằng siêu lọc: muối và nước chảy qua màng lọc, còn enzym bị
giữ lại, sau đó rửa màng lọc thu nhận enzym.
- Thêm sephadex khô vào giúp giữ lại cả muối và nước và làm tăng nồng độ
enzym trong dung dịch.
12
- Ñeà taøi: Thu nhaän bromelin vaø papain
Trong tất cả các phương pháp phân đoạn enzym (điện di, sắc kí…), cần phải loại
trừ những ion kim loại nặng, chất oxi hóa… độc đối với enzym có trong dung dịch muối
trong nước hoặc những pha rắn bất động bằng cách dùng thuốc thử tiolic, các chất khử
thích hợp (EDTA, mercaptoethanol, unitiol), complexon…
III. NHỮNG TIÊU CHUẨN TINH KHIẾT CỦA ENZYM [2]:
Để xác định xem enzym được chiết ra có phải là tinh khiết không hay còn lẫn các
protein không hoạt động khác, ta sử dụng một số phương pháp chủ yếu dựa trên tính chất
vật lý của protein.
- Làm lắng (kết tủa) dung dịch protein trong phần quay phân tích của máy siêu ly
tâm: nếu phát hiện một đỉnh của protein thì đó là protein thuần nhất, tuy nhiên
kết quả không chính xác lắm vì những protein có phân tử lượng bằng nhau sẽ
lắng với tốc độ như nhau và cho cùng một đỉnh chung.
- Điện di: dung dịch enzym khi được điện di khu vực trong jela tinh bột hoặc
thạch chỉ ra một đỉnh cân đối là enzym thuần khiết, tuy nhiên khi hàm lượng
những protein tạp nhỏ (
- Ñeà t aøi : Thu nhaän brom i n vaø papai n
el
THU NHẬN BROMELIN TỪ DỨA
I. TỔNG QUAN VỀ ENZYM BROMELIN [2]:
1. Đặc điểm nguồn thu nguyên liệu:
14
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
Cây dứa (Ananas comusus) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromecliaceae có nguồn gốc
từ Nam Mỹ. Hiện nay, ở nước ta loại dứa được trồng nhiều nhất là Ananas comusus được
sử dụng như nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận enzym và ngoài ra còn
được sử dụng trong một số lĩnh vực khác như dược, mỹ phẩm……Phần thân, chồi và lá
sau khi thu hoạch quả có thể được sử dụng để thu nhận enzym bromelin làm giấy, lấy sợi
hoặc làm phân bón.
Hình I.1.1: Chồi dứa Hình I.1.2: Cây dứa
2. Đặc điểm enzym bromelin:
Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzym thực vật chứa nhóm –SH, có khả năng
phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa (thân, chồi, trái,
vỏ).
Trước đây, cây dứa được sử dụng như một loại cây làm thuốc. Năm 1957, Heinicke
nhận thấy trong thân cây dứa có một lượng lớn bromelin và ngưới ta bắt đầu tìm cách
chiết tách nó. Tuỳ theo nguồn thu nhận mà người ta phân biệt bromelin thân hay bromelin
quả và bromelin thân là nhóm enzym có giá trị kinh tế. Ở mỗi bộ phận khác nhau trên cây
dứa, bromelin có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạo khác nhau.
Bromelin là enzym thuỷ phân protein, nó phân cắt protein trong cơ thể sinh vật. Một
trong những lợi ích của nó là làm chất giúp cho tiêu hoá vì nó hoạt động trong môi trường
acid của dạ dày và cả môi trường kiềm của ruột non. Bromelin có thể thay thế được cả
enzym tiêu hoá khác như pepsin và trypsin. Bromelin có tác dụng kháng viêm, kháng sưng
bằng cách ngăn cản những tiềm chất gây viêm.
Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó có khả năng thuỷ phân khá mạnh và
hoạt động tốt ở pH từ 6 - 8, trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da (lớn gấp 1,5 lần so với
papain)
15
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
Thịt quả chỉ có hoạt tính enzym bromelin kể từ ba tháng trước khi chín, trong đó
hoạt tính enzym cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín. Khi trái chín, hoạt tính
bromelin giảm xuống nhưng không mất hẳn.
Bromelin có thể thu được trong thân dứa: trung bình có thể thu được 3,6 kg
bromelin từ 378L dịch từ thân cây dứa.
3. Tính chất enzym bromelin:
Thành phần chủ yếu của bromelin có chứa nhóm sulfhydryl thuỷ giải protein. Trong
dịch chiết bromelin còn có chứa một ít peroxydase, phosphatase và chất ức chế protease.
Phần lớn các hoạt động sinh lý của bromelin không chỉ phụ thuộc vào phân đoạn có hoạt
tính thuỷ phân protein mà nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác trong bromelin.
Hiện tại người ta ghi nhận được bromelin trong thân dứa có 8 thành phần cơ bản có
hoạt tính thuỷ phân protein. Hai thành phần chính được gọi là F4 và F5. Phân đoạn có tính
mạnh nhất là F9 chiếm khoảng 2% protein trên tổng số. Người ta ước tính rằng khoảng
50% protein của F4 và F5 là glycosylate, trong khi đó ở F9 không có glycosylate. pH tối
thích của các phân đoạn F4 và F5 là 4,0 –4,5 và của F9 thì gần với pH trung tính. Dịch chiết
bromelin toàn phần có hoạt động trong khảng pH 4,5 – 9,8. Bromelin được chiết tách từ
các phần khác nhau trên cây dứa và bromelin từ các nguồn khác nhau sẽ có hoạt động sinh
lý khác nhau nhưng hoạt tính thuỷ phân protein thì giống nhau. Bromelin không ổn định với
nhiệt độ do đó các hoạt động sinh lý của nó sẽ giảm đi nếu như quá trình chiết tách hay
điều kiện bảo quản không thích hợp.
Bromelin có thể thấm hoàn toàn qua dạ dày và ruột của động vật. Nồng độ cao
nhất của bromelin được tìm thấy trong máu sau khi ăn một giờ. Tuy nhiên hoạt động thuỷ
phân protein của nó bị bất hoạt nhanh chóng có lẽ là do tác động của các protease nội sinh
và yếu tố α − 2 − macroglobulin của huyết thanh.
a. Cấu tạo hoá học:
Bromelin thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như
papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử glycan gồm 3 manose, 2 glucoamin,
1 xylose và 1 fructose. Sợi hydrate cacbon này liên kết hoán vị với sợi polypeptide. Trong
sợi hydrate cacbon này dường như một nửa sợi không liên quan đến cơ chế xúc tác của
phân tử.
Khi phân tích thành phần amino acid ở bromelin thân và bromelin quả thì tuỳ theo
phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần amino acid thay đổi
khác nhau. Bromelin có thành phần amino acid thay đổi trong khoảng 321-144 amino acid
và bromelin quả là 283-161 amino acid.
Bromelin thân là một sợi polypepide có amino acid ở đầu amine là valine và ở đầu
cacbonhydrate là glycin, còn bromelin quả có amino acid ở đầu amine là alanin.
Bảng I.3.1: Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelin.(mg/100g
protein)
Amino acid Thân Quả xanh Quả chín
16
- Ñeà taøi: Thu nhaän bromelin vaø papain
Aspartic acid 29 – 29,4 29,8 29,8
Glutamic acid 23 23,2 23,4
Glycine 24,6 – 35 32,6 32,2
Alanine 35 – 35,4 23,8 24,4
Valine 21,6 – 22 19,8 20,1
Leucine 10 10 10
Threonine 21 – 21,2 16,4 16,2
Cysteine 28 – 28,2 32,2 32
Methionine 13,6 – 14 13,5 13,8
Proline 14 – 14,2 11,6 12,1
Phenylalanine 8,8 – 9 7,6 8
Tyrosine 20,8 – 21 22,4 22,2
Tryptophan 8 – 8,1 5,6 -
Histidine 1,9 – 2 1,4 1,3
Lysine 22,9 – 23 7,8 8,3
Arginine 11,5 – 12 8,6 9,1
Amid 41,6 – 42 43 43,4
Glucoamine 5,8 – 6 0,2 0,2
Cacbonhydrate 1,46 3,2 3,2
Cấu trúc không gian của bromelin:
Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelin và nhận thấy cách sắp xếp
amino acid trong phân tử bromelin như sau:
Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –
-Gly – Cys – Lys -
Bromelin là một protease trong tâm hoạt hoạt động có chứa cysteine và hai sợi
polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S-. Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp
xếp phức tạp.
Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt
tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra, trong phân tử còn
có các ion Zn 2+ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzym.
b. Tính chất vật lý:
Bromelin tan nhẹ trong nước và glycerine nhưng không tan trong dung môi hữu cơ.
Cũng như papain, bromelin hoạt động tốt nhất ở vùng pH trung tính, nhiệt độ 70 0C. Vì tâm
hoạt động của bromelin có chứa nhóm -SH nên dễ dàng bị ức chế bởi chất oxi hóa như
H202, metyl bromua, ion kim loại …và được hoạt hóa bởi chất khử (cystein, sunfit, bisunfit,
cyanid…).
Các nghiên cứu về tính chất vật lý của bromelin thân dứa được Murachi và cộng sự
nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau:
Bảng I.3.2: Những tính chất vật lý của protein thân:
Tính chất vật lý Kí hiệu Giá trị
Hằng số sa lắng S 2.73S
17
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
Hằng số khuyếch tán D 7.77 x 10-7 cm2/s
Thể tích riêng phần V 0.743 mL/g
Độ nhớt bên trong [l] 0.039 dl/g
Tỷ số ma sát f/f0 1.26
Điểm đẳng điện pI 9.55
Sự hấp thu A cm ở 280 nm
1%
20.1
33.200*
Trọng lượng phân tử
32.100**
35.500***
*
: tính từ phương pháp sa lắng- khuếch tán
**
: tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong
***
: tính bằng phương pháp Archibald
c. Hoạt tính của bromelin:
Hoạt tính phân giải của bromelin:
Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase. Bromelin thân có
nhiều cơ chất tự nhiện và có thể thuỷ phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp.
• Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của
bromelin:
Bảng I.3.3: Hoạt tính phân giải casein của bromelin
Hoạt tính phân giải casein (UI/mg)
Cơ chất
Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín
Casein 7,4 4,0 3,0
Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelin thân cao hơn bromelin
quả xanh và bromelin quả chín.
• Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của
bromelin:
Bảng I.3.4: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelin
Hoạt tính phân giải casein (UI/mg)
Cơ chất
Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín
BAA 3,7 9,1 7,2
Bảng I.3.5: Hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau * của bromelin
I.3.5:
thân
Cơ chất tổng hợp
BAA BAEE BAEM
1,2 x 10-3 1,7 x 10-1 3,2 x 10-2
*
: ở điều kiện nhiệt độ 5oC và pH 6,0
BAA: Benzoyl-L-Arginine amide
18
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
BAEE : Benzoyl-L-Arginine ethyl ester
BAEM : Benzoyl-L-Arginine methyl ester
Bromelin quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelin thân và bromelin
quả chín. So với BAA, hằng số xúc tác của bromelin thân trên BAEE cao hơn gấp 140 lần.
4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelin
Giống như các chất xúc tác sinh học khác, bromelin chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố
như cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm
chức, phương pháp trích ly, phương pháp tinh sạch...
Anh hưởng bởi cơ chất :
Trên những loại cơ chất khác nhau thì bromelin có hoạt tính khác nhau. Nếu cơ chất
là hemoglobin thì bromelin mạnh gấp 4 lần papain, với casein tương đương, với cơ chất
như BAA, BAEE thì thấp hơn.
Anh hưởng bởi nhiệt độ:
Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng
càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, nồng
độ enzym, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzym.
Ở dịch chiết quả (pH 3,5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60oC thì bromelin vẫn còn hoạt
tính nhưng bromelin tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ. Ở 5 oC, pH 6,1 thì enzym bị mất
50% hoạt tính trong vòng 20 phút. Quá trình đông khô làm mất 27% hoạt tính.
Anh hưởng của độ pH:
pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym. pH tối
thích của bromelin không ổn định mà tuỳ thuộc nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và
nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzym, bản chất dung dịch đệm, sự hiện diện của chất
tăng hoạt.
Khi thu nhận bromelin thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là amonium sulfate hoặc
molypdenum carbonate thì enzym có hoạt tính cao nhất ở pH 4,8 và ổn định ở pH 4,6 – 5,4.
Bromelin thân đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH 6,0 và pH 8,0, ổn
định ở pH 3,5 – 5,6 với nhiệt độ 63oC. Enzym bromelin đã tinh sạch chỉ còn lại 60-70%
hoạt tính. Enzym bromelin có biên độ pH rộng (3-10) nhưng pH tối thích của enzym là 5-8
tuỳ thuộc vào cơ chất.
Anh hưởng bởi ion kim loại:
Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính enzym do chúng thường gắn vào trung
tâm hoạt động của enzyme. Muối thuỷ ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của
enzym bromelin và mức độ kiềm hãm thay đổi tuỳ thuộc nồng độ muối. Ngoài ra còn có
những chất có tác động ức chế bromelin do chúng kết hợp với nhóm -SH của trung tâm
phản ứng của enzyme.
Anh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản:
19
- Ñeà taøi : Thu nhaän br om i n vaø papai n
el
Bảng I.4.1: Anh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt tính của
I.4.1:
bromelin
Hoạt tính (UI/mg protein)
Điều kiện bảo quản
Dịch chiết Đông khô
Nguyên liệu tươi 1600 1150
Bảo quản ở 4oC trong 5 ngày 830 630
Sấy khô ở 4oC 1880 1360
Chồi, thân,
Chồ
lá dứa
dứ
II. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN BROMELIN [2]:
Quy trình công nghệ:
Xay nhuyễn
nhuyễ
Lọc
b
Ly tâm 1
b
Kết tủa
tủ Hấp phụ
phụ Siêu lọc
lọ
Ly tâm 2
dịc
Sấy
20
Bromelin
nguon tai.lieu . vn
