Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC5 liên quan tới tính chống chịu stress từ giống lúa Indica

Tp chí Khoa hc HQGHN: Khoa hc T nhiên và Công ngh, Tp 30, S 4 (2014) 40-47 Phân lp gen mã hóa nhân t phiên mã OsNAC5 liên quan t i tính chng chu stress t ging lúa Indica Nguyn Duy Phương*, Phm Thu Hng, Phm Xuân Hi Vin Di truyn Nông nghip, Vin Khoa hc Nông nghip Vit Nam, Phm Văn ng, Hà Ni, Vit Nam Nhn ngày 09 tháng 2 năm 2014 Chnh sa ngày 18 tháng 6 năm 2014; Chp nhn ăng ngày 15 tháng 10 năm 2014 Tóm tt: H NAC (NAM, ATAF1/2, CUC2) là h gen l n nht thuc nhóm gen mã hóa nhân t phiên mã ưc tìm thy thc vt, có vai trò quan trng trong s phát trin và áp ng v i iu kin bt li ca thc vt. Trong nghiên cu này, chúng tôi ã phân lp ưc mt on gen mã hóa cho nhân t phiên mã OsNAC5 t cDNA ca ging lúa Indica x lý hn. Gen OsNAC5 phân lp ưc có chiu dài 993 nucleotide, có mc tương ng v trt t nucleotide so v i trình t gen OsNAC5 ca ging lúa Japonica ã ưc công b trên ngân hàng gen th gi i (mã s NM_001072451.1) t 98%. Kt qu phân tích trình t axit amin suy din cho thy nhân t phiên mã OsNAC5 ca ging lúa Indica có 330 amino acid, cha mt trình t tín hiu nh v nhân PRDRKYP c trưng cho các nhân t phiên mã phía u N và năm vùng peptide khác c trưng ca h protein NAC. T khóa: Chu hn, lúa Indica, nhân t phiên mã, OsNAC5, chuyn gen. 1. M u* Dư i iu kin bt li ca môi trư!ng như hn, mn, lnh…, thc vt phi thay "i các quá trình sinh lý và sinh hóa tn ti và thích nghi. # mc phân t, iu kin bt li môi trư!ng s$ làm cho thc vt gia tăng mc biu hin và tích lũy ca hàng lot các gen và protein áp ng bt li môi trư!ng. Các gen áp ng bt li môi trư!ng ưc chia làm 2 nhóm: (1) nhóm gen chc năng trc tip chng li iu kin bt li và (2) nhóm gen iu hòa biu hin ca các gen chc năng tham gia trc tip vào phn ng chng chu iu kin bt li [1]. Các _______ *Tác gi liên h. T.: 84-983249148 Email: phuongnd.bio@gmail.com 40 gen mã hóa nhân t phiên mã thuc nhóm th hai và là nhóm gen l n. Nhóm gen mã hóa nhân t phiên mã mc dù không tham gia trc tip vào phn ng áp ng v i iu kin hn ca thc vt nhưng s biu hin ca chúng li có vai trò kích hot s biu hin ca rt nhiu gen chc năng khác tham gia vào quá trình áp ng hn, d&n t i làm tăng cư!ng kh năng chu hn thc vt. Phát hin này ã m ra mt hư ng nghiên cu rt m i cho lĩnh vc chn ging chuyn gen thc vt, ó là ch c n chuyn mt hay mt vài gen mã hóa nhân t phiên mã thay vì vài trăm gen chc năng vào cây tăng cư!ng tính chng chu ca cây trng. Chính vì lí do này mà các nghiên cu phân lp, c tính hoá các gen mã hóa nhân t phiên mã liên quan N.D. Phương và nnk. / Tp chí Khoa hc HQGHN: Khoa hc T nhiên và Công ngh, Tp 30, S 4 (2014) 40-47 41 n tính chng chu v i các iu kin bt li ang tr thành nh hư ng nghiên cu y tim năng trong vic chn to ging chu hn, mn, lnh. Các nhân t phiên mã h NAC cha trình t ng nht ( u tiên ưc phát hin t petunia NAM và t Arabidopsis ATAF1, ATAF2 và CUC) gi là vùng hot ng NAC u N là mt h gen c trưng ca thc vt, có vai trò quan trng trong vic xác nh mô phân sinh nh chi; bit hóa các cơ quan r, hoa trong sinh trưng phát trin thc vt; phn ng v i iu kin b t"n thương và tác nhân gây hi tn công; tăng cư!ng tính chu hn, mn và các iu kin bt li th!i tit [2-5]. Cho t i nay ã có khong 117 gen NAC trong h gen Arabidopsis và 151 gen NAC trong h gen lúa, 26 gen NAC h cam chanh, 152 gen NAC u tương và thuc lá ã ưc phân lp nhưng ch mt s ít gen NAC ưc nghiên cu chc năng [6-9]. Ph n l n protein ca gen NAC cha vùng bám DNA tn cùng u N có bo th cao, trình t tín hiu nh v nhân và mt vùng tn cùng u C bin "i [7]. Gen mã hóa nhân t phiên mã h NAC liên quan n tính chng chu v i bt li môi trư!ng lúa, SNAC1 u tiên ưc phân lp và nghiên cu chi tit c tính [7]. Cây lúa chuyn gen SNAC1 tăng cư!ng tính chu hn, mn và kt qu phân tích microarray cho thy biu hin ca gen ngoi sinh SNAC1 ã hot hóa hàng lot gen chc năng liên quan n tính chu hn. Kt qu th nghim trên ng rung các cây lúa chuyn gen SNAC1 cho năng sut cao hơn 22-34% so v i các cây i chng iu kin hn. Tương t, nhóm nghiên cu ca Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki (2007), ã phân lp và nghiên cu c tính gen OsNAC6. Kt qu bt li th!i tit, cây lúa chuyn gen OsNAC6 còn tăng cư!ng tính kháng bnh bc lá so v i cây i chng [5]. Trong mt s nghiên cu g n ây, gen OsNAC5 cũng ưc chng minh là có liên quan n tính chng chu v i iu kin bt li ca môi trư!ng. Protein OsNAC5 nh v trong nhân và biu hin mnh trong các iu kin hn, mn, lnh và x lý ABA [10]. Trong nghiên cu này, chúng tôi ã phân lp ưc gen OsNAC5 t ging lúa indica và nhân dòng vào vector pGEMT v i m(c tiêu làm phong phú ngun gen ph(c v( cho công tác nghiên cu to ging cây trng chu hn, mn theo nh hư ng chuyn gen. 2. Nguyên liu và phương pháp nghiên cu 2.1. Nguyên liu Ging lúa Indica do Trung tâm Kĩ thut Di truyn và Công ngh Sinh hc Quc t ()n ) cung cp; chng vi khu*n E. coli DH5α do B môn Bnh hc phân t, Vin Di truyn Nông nghip cung cp. Các on oligonucleotide dùng cho phn ng PCR nhân bn gen ưc thit k da trên trình t gen ã công b trên Ngân hàng gen th gi i (mã s NM_001072451.1) và t"ng hp bi hãng Sigma (Bng 1). Bng 1. Trình t các oligonucleotide s d(ng trong nghiên cu Tên mi Trình t mi OsNAC5- 5’-GGATCCATGGAGTGCGGTGGT-3’ Fw OsNAC5- 5’-GGATTCTTAGAACGGCTTCTG-3’ Rv SP6 5’-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3’ nghiên cu cho thy các cây lúa chuyn gen T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ tăng cư!ng tính chu hn, mn và lnh. c bit, ngoài vic tăng cư!ng tính chng chu v i 42 N.D. Phương và nnk. / Tp chí Khoa hc HQGHN: Khoa hc T nhiên và Công ngh, Tp 30, S 4 (2014) 40-47 2.2. Phương pháp Tách chit RNA tng s t cây lúa x lí stress: dideoxyribonucleotide. Kt qu gii trình t ưc x lí bng ph n mm BioEdit. Trình t gen sau khi x lí ưc so sánh v i cơ s d, liu trên Gene Bank và phân tích bng ph n mm Ht lúa Indica ưc phá ng 42oC trong 3 ngày, sau ó cho ny m m và sinh trưng 15 ngày trong dung dch MS 28oC. Cây non ưc x lý stress trong 3 h bng cách: (1) ngâm r trong dung dch NaCl 200 mM (x lí mn); (2) ngâm r trong dung dch PEG 20% (x lí hn); ngâm r trong nư c và gi, 4oC (x lí lnh); (4) t cây trên giy thm trong không khí (x lí mt nư c). RNA t"ng s ưc tách chit t 5 g lúa ã x lý stress, s d(ng m GITC theo phương pháp ca Sambrook và cng s, 1982 [11]. Tng hp cDNA: 2,5 µg m&u RNA tinh sch ưc dùng cho phn ng t"ng hp cDNA bng b kit “sinh t"ng hp cDNA” theo quy trình ca hãng Stratagene, s d(ng mi oligo dT. Phân lp gen OsNAC5: Gen OsNAC5 phân lp t cDNA ca cây lúa ã x lý stress bng k- thut PCR v i chu kỳ nhit: 940C-5 phút; (940C – 30 giây, 560C – 20 giây, 720C - 40 giây) x 35 chu kỳ; 720C - 7 phút và bo qun 40C. Sn ph*m PCR ưc tinh sch bng b kit GenJET¬TM Gel Extraction ca hãng Fermentas. Nhân dòng gen OsNAC5: on gen OsNAC5 nhân bn bng PCR ưc nhân dòng bng b kit pGEMT Easy theo qui trình i kèm ca hãng Promega. Plasmid tái t" hp pGEMT/OsNAC5 ưc tách chit t vi khu*n E. coli bng b kit GenJETTM Plasmid Miniprep ca hãng Fermentas và bo qun -20oC. Gii trình t gen OsNAC5: Trình t gen ưc xác nh bng thit b t ng ABI 3100 da trên nguyên t/c ca phương pháp Sanger có s d(ng các Genetyx 4.0. 3. K t qu và tho lun Phân lp gen OsNAC5 t cDNA ca ging lúa Indica x lý stress: Da vào trình t nucleotide ca gen OsNAC5 ưc công b trên ngân hàng gen (AB028184.1), chúng tôi ã thit k cp mi OsNAC5-F/OsNAC5-R (Bng 1) s d(ng cho phn ng PCR nhân bn on gen OsNAC5 t cDNA ca ging lúa Indica x lí stress. Phn ng PCR ưc thc hin 35 chu kì, các nhit g/n mi 52oC trong 40 giây và 56oC trong 20 giây. Kt qu in di sn ph*m PCR trên gel agarose 1% cho thy nhit g/n mi 52oC chúng tôi ã thu ưc băng DNA có kích thư c xp x 1 kb, tương ng v i kích thư c lý thuyt ca gen OsNAC5, tuy nhiên trong sn ph*m ca phn ng cũng còn cha nhiu băng DNA không c hiu (Hình 1A). Khi thc hin phn ng PCR v i nhit g/n mi 56oC trong 20 giây, chúng tôi ã thu ưc 1 băng DNA c hiu phn ng sd(ngcDNA t"ng hp t m&u RNA tách chit thân cây lúa x lý trong dung dch PEG 20%. Sn ph*m thu ưc có kích thư c khong g n 1000 bp (ging 4, Hình 1B), úng v i kích thư c tính toán lý thuyt ca on gen c n nhân bn là 990 bp cho thy chúng tôi ã phân lp ưc on gen mong mun t cDNA ca cây lúa x lý stress. Ngoài ra, da trên s tương ng gi,a sn ph*m ca các phn ng PCR v i cp mi gen actin (gen ni chu*n) s d(ng khuôn là các m&u cDNA này (s liu không trình bày), chúng tôi có th tm th!i xác nh gen này biu hin mnh nht trong iu kin hn ti th!i im 3 gi! sau khi tip xúc v i iu kin stress so v i các iu kin stress khác. N.D. Phương và nnk. / Tp chí Khoa hc HQGHN: Khoa hc T nhiên và Công ngh, Tp 30, S 4 (2014) 40-47 43 Hình 1. Kt qu in di sn ph*m PCR nhân bn on gen OsNAC5 t cDNA ca ging lúa Indica x lý stress trên gel agarose 1%. Ghi chú: A. Phn ng PCR v i nhit g/n mi 52oC-40 giây, ging M: Thang DNA chu*n 1kb; ging 1 – 3: cDNA t"ng hp t RNA tách chit thân, ging 4 – 6: cDNA t"ng hp t RNA tách chit r, ging 1 và 4: m&u lúa x lý v i NaCl 200 mM, ging 2 và 5: m&u lúa x lý v i PEG 20%, ging 3 và 6: m&u lúa x lý 4oC; ging 7: i chng âm. B. Phn ng PCR v i nhit g/n mi 56oC-20 giây, ging 1: i chng âm, ging 2: m&u lúa khô trong không khí; ging 3: m&u lúa x lý v i NaCl 200 mM, ging 4: m&u lúa x lý v i PEG 20%, ging 5: m&u lúa x lý 4oC. Nhân dòng gen OsNAC5 vào vector xác nh s có mt ca gen OsNAC5 trong th pGEMT Sn ph*m PCR nhân bn gen OsNAC5 t cDNA sau khi tinh sch bng b kit GenJET¬TM Gel Extraction (Fermentas) ưc chúng tôi ghép ni trc tip v i vector pGEMT, s d(ng bng b kit nhân dòng pGEM®-T Vector System II (Promega). Sn ph*m ca phn ng ghép ni ưc bin np vào t bào kh bin E.coli chng DH5α và cy tri trên môi trư!ng chn lc LB có b" sung cht kháng sinh ampicillin 50 µg/ml, cht cm ng IPTG và cơ cht X-Gal. Theo lý thuyt, các khu*n lc xut hin trên b mt môi trư!ng có màu tr/ng là khu*n lc cha plasmid tái t" hp, trong khi ó các khu*n lc có màu xanh là nh,ng khu*n lc mang plasmid nguyên bn t óng vòng. bin np, chúng tôi chn ng&u nhiên mt s khu*n lc tr/ng và kim tra bng PCR v i cp mi c hiu OsNAC5-F/OsNAC5-R. Kt qu in di sn ph*m PCR trên gel agarose 1% cho thy phn ng PCR t khuôn là các khu*n lc s 1 – 6, 8 và 9 cho mt bng DNA c hiu có kích thư c xp x 1kb, tương ng v i kích thư c lý thuyt ca gen OsNAC5 (Hình 2, ging 1 - 6, 8 và 9). Ngưc li, phn ng PCR kim tra khu*n lc s 7 hay s 10, chúng tôi không thu ưc băng DNA nào hay băng DNA có kích thư c l n hơn 1 kb. Kt qu này chng t2 các khu*n lc s 1 – 6, 8 và 9 là nh,ng khu*n lc mang vector tái t" hp pGEMT cha on gen mong mun OsNAC5. Hình 2. Kt qu PCR kim tra mt s khu*n lc tr/ng v i cp mi c hiu. Ghi chú: Ging M: Thang chu*n DNA 1kb; ging 1 - 10: sn ph*m PCR t khuôn là khu*n lc s 1 – 10; ging 11: i chng âm (khuôn là H2O). 44 N.D. Phương và nnk. / Tp chí Khoa hc HQGHN: Khoa hc T nhiên và Công ngh, Tp 30, S 4 (2014) 40-47 kh4ng nh các khu*n lc thu ưc có thc s mang plasmid tái t" hp cha on gen OsNAC mong mun hay không, chúng tôi ã chn ng&u nhiên 1 khu*n lc tr/ng dương tính nuôi và tinh sch plasmid theo quy trình ca b kit GenJETTM Plasmid Miniprep. S có mt ca on gen OsNAC5 trong plasmid ưc chúng tôi xác nh bng phương pháp PCR và phương pháp x lý v i enzyme c/t gi i hn. Hình 3. Kt qu kim tra vector tái t" hp pGEMT/OsNAC5. Ghi chú: A. Kt qu in di sn ph*m PCR trên gel agarose 1%, ging M: Thang DNA chu*n 1kb, ging 1 và 3: i chng âm (khuôn là H2O), ging 2 và 4: khuôn là pGEMT/OsNAC5, ging 1 và 2: PCR v i cp mi T7/SP6, ging 3 và 4: PCR v i cp mi OsN5-F/OsN5-R. B. Kt qu in di sn ph*m c/t gi i hn trên gel agarose 1%, ging M: Thang DNA chu*n; ging 1: vector tái t" hp pGEMT-OsNAC5 nguyên bn; ging 2: sn ph*m c/t enzyme gi i hn EcoRI/PmlI; ging 3: sn ph*m enzyme gi i hn BamHI; ging 4: sn ph*m c/t enzyme gi i hn PstI. Phn ng PCR kim tra plasmid tái t" hp ưc chúng tôi thc hin v i 2 cp mi: cp mi c hiu ca vector pGEMT (T7/SP6) có khong cách 186 bp trên vector pGEMT và cp tính v i các enzyme c/t gi i hn khác nhau. Trên cp mi c hiu ưc dùng nhân bn on gen OsNAC5 có thit k trình t nhn bit ca enzyme BamHI và v trí chèn on gen mi c hiu ca on gen OsNAC5 (OsNAC5- OsNAC5 nm gi,a 2 v trí nhn bit ca F/OsNAC5-R). Sn ph*m PCR sau ó ưc in di trên gel agarose 1%. Kt qu in di sn ph*m PCR trên gel agarose 1% trên Hình 3 cho thy v i cp mi c hiu chúng tôi thu ưc mt băng DNA có kích thư c khong 1 kb (Hình 3A, ging 4). Sn ph*m PCR v i cp mi enzyme EcoRI XhoI. Ngoài ra trong trình t ca on gen OsNAC5 có mt v trí nhn bit ca enzyme PmlI (ti v trí 745) và hai v trí nhn bit ca enzyme PstI (ti v trí 19 và 973), trong khi trên vector pGEMT không có trình t nhn bit ca các enzyme này. Chính vì vy chúng vector cho mt băng DNA có kích thư c tôi s d(ng các enzyme này xác nh s có khong 1,2 kb, kích thư c này phù hp v i kích thư c on DNA theo tính toán lý thuyt, bao gm 990 bp ca on gen OsNAC5 và 186 bp ca vector pGEMT (Hình 3A, ging 2). kh4ng nh ch/c ch/n on DNA ã ưc chèn vào vector pGEMT là gen OsNAC5, chúng tôi tin hành thí nghim x lý plasmid tái t" hp ã ưc tinh sch t khu*n lc dương mt ca on gen OsNAC5 trong vector tái t" hp. Kt qu thu ưc trên Hình 3B cho thy sn ph*m ca phn ng c/t ng th!i bng EcoRI/PmlI cho ba băng DNA, băng DNA th nht có kích thư c khong 3,0 kb là b khung nguyên bn ca vector pGEMT, hai băng DNA còn li chính là on gen OsNAC5 b c/t ôi thành hai on nh2 có kích thư c khong 750 ... - tailieumienphi.vn