Xem mẫu
Journal of Science – 2015, Vol.7 (1), 75 – 83
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
NUÔI CẤY MÔ LÁ ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa L. Harms) TẠO RỄ TƠ VÀ NHẬN
BIẾT HOẠT CHẤT SAPONIN TÍCH LŨY
Nguyễn Trung Hậu1, Trần Văn Minh2
1
2
Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh
Trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
Thông tin chung:
Ngày nhận bài: 21/07/15
Ngày nhận kết quả bình duyệt:
12/08/15
Ngày chấp nhận đăng : 08/15
Title:
Hairy root induction derived
from leaves of Dinh lang
(Polyscias fruticosa L. Harm)
and identification of saponin
in cultures
Từ khóa:
Rễ tơ, nuôi cấy lá, saponin,
Polyscias fruticosa, tăng sinh
ABSTRACT
The one year old leaves of Dinh Lang was sterilized with dilution Javel water
(50%) for 10 minutes. The sterile leaf explants rate reached to 96.3%. MS
medium supplemented with NAA 1 mg/l was favored for hairy-root induction
(0.322 g/cum). Hairy-root was strongly proliferated on the MS medium
supplemented with 0.5 mg/l NAA. Oleanolic acid and saponin concentration
accumulating in hairy-roots was analysed by HPLC method. The results were
shown that oleanolic acid 40.1 µg/g and saponin 396.2 µg/g were accumulated in
cultures. A new technique for saponin accumulation via hairy-root cultures of
Dinh lang was set up.
TÓM TẮT
Lá cây đinh lăng 1 năm tuổi được khử trùng bằng nước javel pha loãng 50%
trong 10 phút. Mẫu lá vô trùng đạt hiệu suất 96,3%. Môi trường MS có bổ sung
NAA 1 mg/l thích hợp cho nuôi cấy phát sinh rễ tơ đạt 0,322 g/cum. Rễ tơ tăng
Keywords:
Hairy-root, leaf culture, saponin, sinh mạnh trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l. Hàm lượng oleanolic
Polyscias fruticosa, proliferation acid và saponin tích tụ được xác định bằng HPLC. Kết quả cho thấy qua nuôi cấy
tích tụ trong rễ tơ 40,1 µg/g và saponin 396,2 µg/g.
1.
Đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) là cây
sống nhiều năm, ưa ẩm, ưa sáng, có khả năng chịu
hạn, chịu nóng nhưng không chịu ngập úng; sinh
trưởng và phát triển trên nhiều loại đất nhưng tốt
nhất là đất pha cát; và trồng được quanh năm.
Thời vụ trồng tốt nhất là mùa xuân. Cây ra hoa từ
tháng 4 đến tháng 7 hàng năm (Phạm Hoàng Hộ,
2003).
MỞ ĐẦU
Ngày nay, việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có
hoạt tính sinh học cao để làm thuốc là một xu thế
được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm. Việt
Nam là một trong những quốc gia thuộc vùng
nhiệt đới, nơi chứa đựng giá trị đa dạng sinh học
cao chưa được khám phá (Đỗ Huy Bích và cs.,
2004). Khoảng 40 - 50 năm trở lại đây, nhiều nhà
khoa học trên thế giới đã chú ý đến tác dụng tăng
lực, bồi bổ cơ thể của nhiều cây cùng họ với cây
nhân sâm (LaCaille - Dubois và Wagner, 1996).
Một số cây trong họ này cho những vị thuốc bổ
nổi tiếng và được dùng từ lâu đời trong nhân dân
ta như nhân sâm, ngũ gia bì, tam thất, đinh lăng,
v.v. có tác dụng như nhiều cây trong cùng họ
(Trần Hùng, 2003).
Đinh lăng có tác dụng hồi phục sức khỏe, chống
stress, tăng khả năng chịu đựng của cơ thể, giảm
rối loạn tiền đình, phòng chống nhiễm ký sinh
trùng sốt rét, bức xạ siêu cao tầng (Nguyễn Thị
Thu Hương và cs., 2001). Đinh lăng còn có tác
dụng kháng viêm, giảm đau, chống xơ vữa động
mạch dựa trên tác dụng hạ cholesterol toàn phần
và lipid toàn phần trong huyết thanh. Có tác dụng
75
Journal of Science – 2015, Vol.7 (1), 75 – 83
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
pháp lý tưởng, có tiềm năng ứng dụng rất lớn cho
sản xuất các hoạt chất thứ cấp có trong nhiều loại
thực vật (Gupta và cs., 2012; Shanks và Morgan,
1999; Toivonen, 1993).
kháng khuẩn và kháng tốt trên các chủng Gr (+)
như Staphylococcus, yếu ở vi khuẩn Gr (-) và nấm
mốc. Cao đinh lăng có độc tính thấp LD50 là 8,51
g/kg thể trọng. Lá đinh lăng chứa saponin
triterpen chiếm 1,65% là một genin dạng acid
oleanolic có tác dụng dược liệu. Trung tâm Sâm
và Dược liệu TPHCM đã phân lập được 5 loại
hợp chất polyacetylen từ lá đinh lăng là:
panaxynol, panoxydol, heptadeca - 1,8(E) – dien 4,6 diyn - 3,4 diol, heptadeca - 1,8 (E) – dien - 4,6
diyn – 3 ol – 10 on, heptadeca - 1,8 (Z) - 4,6 diyn
– 3 ol – 10 on. Trong rễ chỉ tìm thấy 5 hợp chất
polyacetylen panaxynol, panoxydol, heptadeca 1,8 (E) – dien - 4,6 diyn – 3 ol – 10 on là ba hợp
chất giống trong lá. Các hợp chất này có tác dụng
kháng khuẩn mạnh và có tác dụng ức chế tế bào
khối u (Trần Công Luận, 1996).
2.
Vật liệu nuôi cấy: Vật liệu được sử dụng trong
nghiên cứu là mô lá non cây đinh lăng (Polyscias
fruticosa L. Harms) một năm tuổi được thu thập
tại Quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh.
Phương pháp: Mô lá non của cây đinh lăng một
năm tuổi được thu thập và khử trùng bằng cồn
70% trong 1 phút, rửa mẫu bằng nước cất vô trùng
3 lần, sau đó khử trùng bằng nước javel (50 100%) bổ sung với 3 - 4 giọt tween 80% trong
thời gian 10 - 20 phút, tiếp tục rửa mẫu 3 lần bằng
nước cất vô trùng. Mẫu sau khử trùng được cấy
vào môi trường nuôi cấy.
Với nhu cầu sử dụng các loài dược liệu làm thuốc
ngày càng tăng, do khai thác liên tục trong nhiều
năm không chú ý tới bảo tồn và phát triển, cộng
với nhiều nguyên nhân khác đã làm cho nguồn tài
nguyên dược liệu Việt Nam bị giảm sút nghiêm
trọng, nhiều loài đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt
chủng.
Môi trường nuôi cấy là môi trường MS
(Murashige và Skoog, 1962) được khử trùng ở
121 oC (1 at) trong 30 phút. Mẫu nuôi cấy được
đặt trong phòng nuôi ở nhiệt độ 26 + oC, cường độ
chiếu sáng 22,2 µmol/m2/s, thời gian chiếu sang
12 giờ/ngày. Có bổ sung 2,4D (2,4dichlorophenoxyacetic
acid),
NAA
(αnaphthaleneacetic acid), IBA (β-indolbutyric
acid), kinetin (6-furfurylaminopurine), oleanic
acid (Sigma Aldrich) và saponin (không có chuẩn
này)
Nuôi cấy mô in vitro nhằm mục tiêu bảo tồn, cải
thiện chất lượng và phát triển các loài dược liệu
mang lại hiệu quả thiết thực (Shahzad và Sahai,
2013). Trong đó, kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ in vitro
(Asada và cs., 1998; Fukui và cs., 1998; Jung và
cs., 1994; Liu và cs., 1997) giúp tạo nguồn
nguyên liệu sản xuất saponin (Routa và cs., 2000;
Kwon và cs., 1997), không phụ thuộc điều kiện
thời tiết, khí hậu môi trường, giảm chi phí và
nguồn lực đầu tư, là một trong những phương
Tỷ lệ mẫu vô trùng =
Tỷ lệ mẫu chết =
Hệ số tăng sinh =
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, nuôi cấy 3 bình tam giác
cho 1 lần lặp lại, mỗi bình nuôi cấy 7 mẫu. Kết
quả thí nghiệm được xử lý thống kê ANOVA
bằng phần mềm Microsoft Excel. Chỉ tiêu theo
dõi:
Số mẫu không nhiễm
Tổng số mẫu nuôi cấy (%)
Số mẫu bị hoại tử
Tổng số mẫu nuôi cấy (%)
Sinh khối sau nuôi cấy
Sinh khối ban đầu đưa vào nuôi cấy (%)
76
Journal of Science – 2015, Vol.7 (1), 75 – 83
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
50 mL nước nóng và ủ tại 90 oC trong 10 phút.
Thêm 7,5 mL HCl đậm đặc và đun hoàn lưu cách
thủy trong 2 giờ. Tiếp theo, chiết 4 lần x 100 mL
dicloromethan. Pha dicloromethan cô quay tới gần
cạn, phần còn lại được thổi khô hoàn toàn bằng
dòng khí N2. Hòa tan phần cặn bằng pha động, lọc
qua màng lọc 0,45 micro trước khi tiêm.
Hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp Agilent 1200
(USA) bao gồm: bơm đôi cao áp (trộn dòng áp
suất cao), bộ tiêm mẫu tự động, lò cột, đầu dò
DAD.
Thiết kế thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ
chất khử trùng javel và thời gian khử trùng đến tỷ
lệ mẫu vô trùng in vitro: Các mẫu lá sau khi khử
trùng sẽ được cắt thành những đoạn nhỏ có kích
thước 0,5 cm x 1 cm. Sau đó nuôi cấy trên môi
trường MS không chứa chất điều hòa sinh trưởng.
Sau 2 tuần, quan sát và ghi nhận kết quả.
Để định lượng saponin tổng số, các nhánh đường
gắn trên aglycone được thủy phân trong môi
trường acid để chuyển hết về dạng aglycone. Do
đó, saponin tổng số được định lượng thông qua
acid oleanolic.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều
hòa sinh trưởng 2,4D và NAA đến tạo rễ tơ in
vitro: Mẫu nuôi cấy vô trùng sau 2 tuần nuôi cấy
trong thí nghiệm 1 được chuyển sang nuôi cấy
trên môi trường tạo rễ. Môi trường MS bổ sung
2,4D (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) và NAA (0,5; 1,0;
1,5; 2,0 mg/l). Sau 4 tuần, ghi nhận kết quả.
* Quy trình HPLC phân tách và định
lượng oleanolic acid và saponin:
Hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp agilent 1200
(USA) bao gồm: bơm đôi cao áp (trộn dòng áp
suất cao), bộ tiêm mẫu tự động, lò cột, đầu dò
DAD.
Pha tĩnh: cột ACE3- C18 (4.6 mm x 150 mm, 3,5
µm), được ổn nhiệt ở 20 0C.
Pha động: chương trình pha động được thực hiện
tại tốc độ dòng 0,5 mL/phút tại tỷ lệ pha A: pha B
là 10:90 v/v. Trong đó, pha A là đệm trietylamine
(TEA)/HCl, pH 3 và pha B là MeOH chứa 0,1%
acid formic., bước sóng 210 nm.
* Phương pháp tính toán hàm lượng
oleanoic acid và saponin tổng số trong mẫu được
thực hiện theo phương pháp ngoại chuẩn: Pha 5
điểm chuẩn oleanoic acid các nồng độ C1, C2,
C3, C4, C5. Sau đó tiến hành ghi tín hiệu sắc ký
của các điểm chuẩn này. Từ sắc ký đồ thu được
của các điểm chuẩn, lấy tín hiệu diện tích mũi sắc
ký của từng điểm chuẩn được các giá trị S1, S2,
S3, S4, S5. Từ đó, dựng đường tuyến tính diện
tích mũi sắc ký theo nồng độ thu được hàm số bậc
nhất: y = ax + b. Trong đó, y là diện tích mũi, x là
nồng độ dung dịch chuẩn oleanoic đã biết từ sắc
ký đồ của các mẫu phân tích, lấy diện tích của
mũi sắc ký oleanoic acid được giá trị S mẫu. Giá
trị S mẫu được áp vào đường tuyến tính y = ax + b
sẽ thu được giá trị nồng độ oleanoic acid trong
mẫu.
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các chất
điều hòa sinh trưởng 2,4D, NAA và IBA, kinetin
đến quá trình tăng sinh rễ tơ in vitro: Mẫu nuôi
cấy vô trùng sau 2 tuần nuôi cấy trong thí nghiệm
1 được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường tạo
rễ tơ MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng
2,4D (0,3; 0,5; 1,0 mg/l), NAA (0,3; 0,5; 1,0
mg/l), IBA (0,3; 0,5; 1,0 mg/l) và kinetin (1 mg/l)
để tìm môi trường tối ưu nhất ảnh hưởng đến tăng
sinh rễ tơ. Sau 4 tuần, ghi nhận kết quả.
Thí nghiệm 4: Định lượng saponin trong
mẫu rễ tơ:
Định lượng saponin bằng phương pháp
phân tích HPLC (Trịnh Thị Nhung, 2012): Ngoài
phương pháp tạo bọt (Nguyễn Kim Phi Phụng,
2007), oleanic acid và saponin được phân tích
định lượng bằng phương pháp HPLC.
* Chuẩn bị mẫu phân tich oleanolic acid:
́
Cân 150 mg mẫu vào ống COD, chiết siêu âm 4
lần với 10 mL ethylacetatat chứa 1% acid formic.
Thổi khô ethyl acetat. Hòa tan phần cặn bằng pha
động, lọc qua màng lọc 0,45 micro trước khi tiêm
vào hệ thống HPLC.
Quá trình thủy phân mẫu giúp chuyển các
saponin về dạng acid oleanoic. Do đó, hàm lượng
saponin tổng số (mSaponin) được tính bằng cách lấy
* Chuẩn bị mẫu phân tích saponin tổng
số: Cân 150 mg mẫu vào bình cầu cổ nhám. Thêm
77
Journal of Science – 2015, Vol.7 (1), 75 – 83
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
hàm lượng acid olenoic sau thủy phân (m Oleanoic
STP) trừ cho hàm lượng acid oleanoic không thủy
phân (m Oleanoic KTP).
Khử trùng mẫu bằng javel (50% và 100%) trong 3
khoảng thời gian 10 phút, 15 phút và 20 phút, cho
tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao (51,4 - 96,3%). Khử
trùng mẫu với javel nồng độ 50% trong thời gian
10 phút cho tỉ lệ mẫu chết thấp nhất (4,7%) và tỉ
lệ mẫu sống vô trùng đạt cao nhất (96,3%) so với
các nghiệm thức khác (Bảng 1). Nước javel
thương mại (có thành phần hoạt chất hypochlorite
- Na 5%) thích hợp dùng để khử trùng các loài
nấm và một phần khuẩn xâm nhập trên bề mặt và
mô lá nuôi cấy. Như vậy, nồng độ javel 50%, khử
trùng mẫu trong 10 phút thích hợp cho khử trùng
mẫu lá cây đinh lăng.
mSaponin = m Oleanoic STP - m Oleanoic KTP
Trong đó, hàm lượng oleanoic được tính theo
phương pháp ngoại chuẩn.
3.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ chất
khử trùng javel và thời gian khử trùng đến tỷ
lệ mẫu vô trùng in vitro
Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng javel và thời gian khử trùng mẫu đến tỷ lệ mẫu chết và mẫu vô
trùng
Chất khử trùng
Javel
(50%)
Javel
(100%)
Thời gian khử trùng
(phút)
10
15
20
10
15
20
Tỷ lệ mẫu chết
(%)
4,7a
20,4b
16,4b
20,3c
24,2d
48,6e
Tỷ lệ vô trùng
(%)
96,3a
79,6b
83,6b
79,7c
75,8d
51,4e
(Các số liệu được theo sau bởi các ký tự khác nhau có ý nghĩa khác biệt với độ tin cậy 95 %).
với các nghiệm thức khác (Bảng 2) (Hình 1). Ở
các nghiệm thức có bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng 2,4D cho thấy không có sự hình thành rễ
tơ; 2,4D là một loại auxin có hoạt lực mạnh, kích
thích sự phân chia tế bào nhu mô phát sinh mô sẹo
hay tế bào tiền phôi (Trần Văn Minh, 2013). Như
vậy, môi trường thích hợp nuôi cấy tạo rễ tơ từ lá
cây đinh lăng là môi trường MS + 1 mg/l NAA.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều hòa
sinh trưởng 2,4D và NAA đến tạo rễ tơ in vitro
Môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4D không
có tác dụng tạo rễ tơ. Bổ sung NAA vào môi
trường nuôi cấy có tác dụng hình thành rễ tơ. Bổ
sung NAA (1 mg/l) vào môi trường nuôi cấy MS
kích thích tạo rễ tơ cao 0,322 g/cụm. Ở môi
trường có nồng độ NAA (0,5 – 1 mg/l) trọng
lượng rễ tạo ra tương đương nhau và nhiều hơn so
Bảng 2. Ảnh hưởng của 2,4D và NAA đến quá trình tạo rễ tơ
Nồng độ chất ĐHST ngoại sinh (mg/l)
Trọng lượng tươi rễ tơ (g/cụm)
NAA 0,5
0,309a
NAA 1,0
0,322a
NAA 1,5
0,296b
NAA 2,0
0,263b
2,4D 0,5
0
2,4D 1,0
0
78
Journal of Science – 2015, Vol.7 (1), 75 – 83
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
2,4D 1,5
0
2,4D 2,0
0
Hình 1. Hình thái rễ tơ tạo ra từ lá đinh lăng in vitro trong môi trường MS có bổ sung (a): NAA (2 mg/l); (b): NAA
(1 mg/l); (c): 2,4D (1,5 mg/l); (d): 2,4D (1 mg/l)
sung IBA tạo sợi rễ mảnh và nhỏ hơn so với rễ tơ
được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung NAA
(Hình 3,4,5). Kinetin không có tác động đến quá
trình tăng sinh rễ tơ; kinetin là một loại cytokinin
thường sử dụng trong các nghiên cứu kích thích
tăng sinh và biệt hóa vùng tế bào nhu mô như tăng
kích thước củ lily in vitro…, hay kích thích khả
năng biệt hóa tế bào tiền phôi ở cây tiêu sọ…
(Trần Văn Minh, 2013). Như vậy, môi trường
thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh rễ tơ in vitro cây
đinh lăng là môi trường MS + NAA (0,5 mg/l).
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các chất điều
hòa sinh trưởng 2,4D, NAA và IBA, kinetin
đến quá trình tăng sinh rễ tơ in vitro
Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung 2,4D (Hình
1) không có sự tăng sinh rễ. Trên môi trường nuôi
cấy bổ sung NAA và IBA đều có sự tăng sinh rễ
tơ sau 4 tuần nuôi cấy. Trên môi trường nuôi cấy
có bổ sung NAA cho tăng sinh rễ tơ nhiều hơn
môi trường có bổ sung IBA. Với nồng độ NAA
(0,5 mg/l) bổ sung vào môi trường, trọng lượng rễ
tăng sinh là 2,018 g/cụm (Bảng 3) (Hình 2). Rễ tơ
in vitro được nuôi cấy trong môi trường có bổ
Bảng 3. Ảnh hưởng của NAA, IBA và 2,4D đến quá trình tăng sinh rễ tơ
Nồng độ chất ĐHST ngoại sinh (mg/l)
Trọng lượng tươi rễ tơ (g/cụm)
NAA 0,3
1,977b
NAA 0,5
2,018a
NAA 1,0
1,985b
NAA 0,3 + KI 1,0
1,979b
NAA 0,5 + KI 1,0
1,988b
NAA 1,0 + KI 1,0
1,965b
IBA 0,3
1,808c
IBA 0,5
1,854c
79
nguon tai.lieu . vn
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
NUÔI CẤY MÔ LÁ ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa L. Harms) TẠO RỄ TƠ VÀ NHẬN
BIẾT HOẠT CHẤT SAPONIN TÍCH LŨY
Nguyễn Trung Hậu1, Trần Văn Minh2
1
2
Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh
Trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
Thông tin chung:
Ngày nhận bài: 21/07/15
Ngày nhận kết quả bình duyệt:
12/08/15
Ngày chấp nhận đăng : 08/15
Title:
Hairy root induction derived
from leaves of Dinh lang
(Polyscias fruticosa L. Harm)
and identification of saponin
in cultures
Từ khóa:
Rễ tơ, nuôi cấy lá, saponin,
Polyscias fruticosa, tăng sinh
ABSTRACT
The one year old leaves of Dinh Lang was sterilized with dilution Javel water
(50%) for 10 minutes. The sterile leaf explants rate reached to 96.3%. MS
medium supplemented with NAA 1 mg/l was favored for hairy-root induction
(0.322 g/cum). Hairy-root was strongly proliferated on the MS medium
supplemented with 0.5 mg/l NAA. Oleanolic acid and saponin concentration
accumulating in hairy-roots was analysed by HPLC method. The results were
shown that oleanolic acid 40.1 µg/g and saponin 396.2 µg/g were accumulated in
cultures. A new technique for saponin accumulation via hairy-root cultures of
Dinh lang was set up.
TÓM TẮT
Lá cây đinh lăng 1 năm tuổi được khử trùng bằng nước javel pha loãng 50%
trong 10 phút. Mẫu lá vô trùng đạt hiệu suất 96,3%. Môi trường MS có bổ sung
NAA 1 mg/l thích hợp cho nuôi cấy phát sinh rễ tơ đạt 0,322 g/cum. Rễ tơ tăng
Keywords:
Hairy-root, leaf culture, saponin, sinh mạnh trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l. Hàm lượng oleanolic
Polyscias fruticosa, proliferation acid và saponin tích tụ được xác định bằng HPLC. Kết quả cho thấy qua nuôi cấy
tích tụ trong rễ tơ 40,1 µg/g và saponin 396,2 µg/g.
1.
Đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) là cây
sống nhiều năm, ưa ẩm, ưa sáng, có khả năng chịu
hạn, chịu nóng nhưng không chịu ngập úng; sinh
trưởng và phát triển trên nhiều loại đất nhưng tốt
nhất là đất pha cát; và trồng được quanh năm.
Thời vụ trồng tốt nhất là mùa xuân. Cây ra hoa từ
tháng 4 đến tháng 7 hàng năm (Phạm Hoàng Hộ,
2003).
MỞ ĐẦU
Ngày nay, việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có
hoạt tính sinh học cao để làm thuốc là một xu thế
được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm. Việt
Nam là một trong những quốc gia thuộc vùng
nhiệt đới, nơi chứa đựng giá trị đa dạng sinh học
cao chưa được khám phá (Đỗ Huy Bích và cs.,
2004). Khoảng 40 - 50 năm trở lại đây, nhiều nhà
khoa học trên thế giới đã chú ý đến tác dụng tăng
lực, bồi bổ cơ thể của nhiều cây cùng họ với cây
nhân sâm (LaCaille - Dubois và Wagner, 1996).
Một số cây trong họ này cho những vị thuốc bổ
nổi tiếng và được dùng từ lâu đời trong nhân dân
ta như nhân sâm, ngũ gia bì, tam thất, đinh lăng,
v.v. có tác dụng như nhiều cây trong cùng họ
(Trần Hùng, 2003).
Đinh lăng có tác dụng hồi phục sức khỏe, chống
stress, tăng khả năng chịu đựng của cơ thể, giảm
rối loạn tiền đình, phòng chống nhiễm ký sinh
trùng sốt rét, bức xạ siêu cao tầng (Nguyễn Thị
Thu Hương và cs., 2001). Đinh lăng còn có tác
dụng kháng viêm, giảm đau, chống xơ vữa động
mạch dựa trên tác dụng hạ cholesterol toàn phần
và lipid toàn phần trong huyết thanh. Có tác dụng
75
Journal of Science – 2015, Vol.7 (1), 75 – 83
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
pháp lý tưởng, có tiềm năng ứng dụng rất lớn cho
sản xuất các hoạt chất thứ cấp có trong nhiều loại
thực vật (Gupta và cs., 2012; Shanks và Morgan,
1999; Toivonen, 1993).
kháng khuẩn và kháng tốt trên các chủng Gr (+)
như Staphylococcus, yếu ở vi khuẩn Gr (-) và nấm
mốc. Cao đinh lăng có độc tính thấp LD50 là 8,51
g/kg thể trọng. Lá đinh lăng chứa saponin
triterpen chiếm 1,65% là một genin dạng acid
oleanolic có tác dụng dược liệu. Trung tâm Sâm
và Dược liệu TPHCM đã phân lập được 5 loại
hợp chất polyacetylen từ lá đinh lăng là:
panaxynol, panoxydol, heptadeca - 1,8(E) – dien 4,6 diyn - 3,4 diol, heptadeca - 1,8 (E) – dien - 4,6
diyn – 3 ol – 10 on, heptadeca - 1,8 (Z) - 4,6 diyn
– 3 ol – 10 on. Trong rễ chỉ tìm thấy 5 hợp chất
polyacetylen panaxynol, panoxydol, heptadeca 1,8 (E) – dien - 4,6 diyn – 3 ol – 10 on là ba hợp
chất giống trong lá. Các hợp chất này có tác dụng
kháng khuẩn mạnh và có tác dụng ức chế tế bào
khối u (Trần Công Luận, 1996).
2.
Vật liệu nuôi cấy: Vật liệu được sử dụng trong
nghiên cứu là mô lá non cây đinh lăng (Polyscias
fruticosa L. Harms) một năm tuổi được thu thập
tại Quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh.
Phương pháp: Mô lá non của cây đinh lăng một
năm tuổi được thu thập và khử trùng bằng cồn
70% trong 1 phút, rửa mẫu bằng nước cất vô trùng
3 lần, sau đó khử trùng bằng nước javel (50 100%) bổ sung với 3 - 4 giọt tween 80% trong
thời gian 10 - 20 phút, tiếp tục rửa mẫu 3 lần bằng
nước cất vô trùng. Mẫu sau khử trùng được cấy
vào môi trường nuôi cấy.
Với nhu cầu sử dụng các loài dược liệu làm thuốc
ngày càng tăng, do khai thác liên tục trong nhiều
năm không chú ý tới bảo tồn và phát triển, cộng
với nhiều nguyên nhân khác đã làm cho nguồn tài
nguyên dược liệu Việt Nam bị giảm sút nghiêm
trọng, nhiều loài đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt
chủng.
Môi trường nuôi cấy là môi trường MS
(Murashige và Skoog, 1962) được khử trùng ở
121 oC (1 at) trong 30 phút. Mẫu nuôi cấy được
đặt trong phòng nuôi ở nhiệt độ 26 + oC, cường độ
chiếu sáng 22,2 µmol/m2/s, thời gian chiếu sang
12 giờ/ngày. Có bổ sung 2,4D (2,4dichlorophenoxyacetic
acid),
NAA
(αnaphthaleneacetic acid), IBA (β-indolbutyric
acid), kinetin (6-furfurylaminopurine), oleanic
acid (Sigma Aldrich) và saponin (không có chuẩn
này)
Nuôi cấy mô in vitro nhằm mục tiêu bảo tồn, cải
thiện chất lượng và phát triển các loài dược liệu
mang lại hiệu quả thiết thực (Shahzad và Sahai,
2013). Trong đó, kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ in vitro
(Asada và cs., 1998; Fukui và cs., 1998; Jung và
cs., 1994; Liu và cs., 1997) giúp tạo nguồn
nguyên liệu sản xuất saponin (Routa và cs., 2000;
Kwon và cs., 1997), không phụ thuộc điều kiện
thời tiết, khí hậu môi trường, giảm chi phí và
nguồn lực đầu tư, là một trong những phương
Tỷ lệ mẫu vô trùng =
Tỷ lệ mẫu chết =
Hệ số tăng sinh =
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, nuôi cấy 3 bình tam giác
cho 1 lần lặp lại, mỗi bình nuôi cấy 7 mẫu. Kết
quả thí nghiệm được xử lý thống kê ANOVA
bằng phần mềm Microsoft Excel. Chỉ tiêu theo
dõi:
Số mẫu không nhiễm
Tổng số mẫu nuôi cấy (%)
Số mẫu bị hoại tử
Tổng số mẫu nuôi cấy (%)
Sinh khối sau nuôi cấy
Sinh khối ban đầu đưa vào nuôi cấy (%)
76
Journal of Science – 2015, Vol.7 (1), 75 – 83
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
50 mL nước nóng và ủ tại 90 oC trong 10 phút.
Thêm 7,5 mL HCl đậm đặc và đun hoàn lưu cách
thủy trong 2 giờ. Tiếp theo, chiết 4 lần x 100 mL
dicloromethan. Pha dicloromethan cô quay tới gần
cạn, phần còn lại được thổi khô hoàn toàn bằng
dòng khí N2. Hòa tan phần cặn bằng pha động, lọc
qua màng lọc 0,45 micro trước khi tiêm.
Hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp Agilent 1200
(USA) bao gồm: bơm đôi cao áp (trộn dòng áp
suất cao), bộ tiêm mẫu tự động, lò cột, đầu dò
DAD.
Thiết kế thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ
chất khử trùng javel và thời gian khử trùng đến tỷ
lệ mẫu vô trùng in vitro: Các mẫu lá sau khi khử
trùng sẽ được cắt thành những đoạn nhỏ có kích
thước 0,5 cm x 1 cm. Sau đó nuôi cấy trên môi
trường MS không chứa chất điều hòa sinh trưởng.
Sau 2 tuần, quan sát và ghi nhận kết quả.
Để định lượng saponin tổng số, các nhánh đường
gắn trên aglycone được thủy phân trong môi
trường acid để chuyển hết về dạng aglycone. Do
đó, saponin tổng số được định lượng thông qua
acid oleanolic.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều
hòa sinh trưởng 2,4D và NAA đến tạo rễ tơ in
vitro: Mẫu nuôi cấy vô trùng sau 2 tuần nuôi cấy
trong thí nghiệm 1 được chuyển sang nuôi cấy
trên môi trường tạo rễ. Môi trường MS bổ sung
2,4D (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) và NAA (0,5; 1,0;
1,5; 2,0 mg/l). Sau 4 tuần, ghi nhận kết quả.
* Quy trình HPLC phân tách và định
lượng oleanolic acid và saponin:
Hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp agilent 1200
(USA) bao gồm: bơm đôi cao áp (trộn dòng áp
suất cao), bộ tiêm mẫu tự động, lò cột, đầu dò
DAD.
Pha tĩnh: cột ACE3- C18 (4.6 mm x 150 mm, 3,5
µm), được ổn nhiệt ở 20 0C.
Pha động: chương trình pha động được thực hiện
tại tốc độ dòng 0,5 mL/phút tại tỷ lệ pha A: pha B
là 10:90 v/v. Trong đó, pha A là đệm trietylamine
(TEA)/HCl, pH 3 và pha B là MeOH chứa 0,1%
acid formic., bước sóng 210 nm.
* Phương pháp tính toán hàm lượng
oleanoic acid và saponin tổng số trong mẫu được
thực hiện theo phương pháp ngoại chuẩn: Pha 5
điểm chuẩn oleanoic acid các nồng độ C1, C2,
C3, C4, C5. Sau đó tiến hành ghi tín hiệu sắc ký
của các điểm chuẩn này. Từ sắc ký đồ thu được
của các điểm chuẩn, lấy tín hiệu diện tích mũi sắc
ký của từng điểm chuẩn được các giá trị S1, S2,
S3, S4, S5. Từ đó, dựng đường tuyến tính diện
tích mũi sắc ký theo nồng độ thu được hàm số bậc
nhất: y = ax + b. Trong đó, y là diện tích mũi, x là
nồng độ dung dịch chuẩn oleanoic đã biết từ sắc
ký đồ của các mẫu phân tích, lấy diện tích của
mũi sắc ký oleanoic acid được giá trị S mẫu. Giá
trị S mẫu được áp vào đường tuyến tính y = ax + b
sẽ thu được giá trị nồng độ oleanoic acid trong
mẫu.
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các chất
điều hòa sinh trưởng 2,4D, NAA và IBA, kinetin
đến quá trình tăng sinh rễ tơ in vitro: Mẫu nuôi
cấy vô trùng sau 2 tuần nuôi cấy trong thí nghiệm
1 được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường tạo
rễ tơ MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng
2,4D (0,3; 0,5; 1,0 mg/l), NAA (0,3; 0,5; 1,0
mg/l), IBA (0,3; 0,5; 1,0 mg/l) và kinetin (1 mg/l)
để tìm môi trường tối ưu nhất ảnh hưởng đến tăng
sinh rễ tơ. Sau 4 tuần, ghi nhận kết quả.
Thí nghiệm 4: Định lượng saponin trong
mẫu rễ tơ:
Định lượng saponin bằng phương pháp
phân tích HPLC (Trịnh Thị Nhung, 2012): Ngoài
phương pháp tạo bọt (Nguyễn Kim Phi Phụng,
2007), oleanic acid và saponin được phân tích
định lượng bằng phương pháp HPLC.
* Chuẩn bị mẫu phân tich oleanolic acid:
́
Cân 150 mg mẫu vào ống COD, chiết siêu âm 4
lần với 10 mL ethylacetatat chứa 1% acid formic.
Thổi khô ethyl acetat. Hòa tan phần cặn bằng pha
động, lọc qua màng lọc 0,45 micro trước khi tiêm
vào hệ thống HPLC.
Quá trình thủy phân mẫu giúp chuyển các
saponin về dạng acid oleanoic. Do đó, hàm lượng
saponin tổng số (mSaponin) được tính bằng cách lấy
* Chuẩn bị mẫu phân tích saponin tổng
số: Cân 150 mg mẫu vào bình cầu cổ nhám. Thêm
77
Journal of Science – 2015, Vol.7 (1), 75 – 83
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
hàm lượng acid olenoic sau thủy phân (m Oleanoic
STP) trừ cho hàm lượng acid oleanoic không thủy
phân (m Oleanoic KTP).
Khử trùng mẫu bằng javel (50% và 100%) trong 3
khoảng thời gian 10 phút, 15 phút và 20 phút, cho
tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao (51,4 - 96,3%). Khử
trùng mẫu với javel nồng độ 50% trong thời gian
10 phút cho tỉ lệ mẫu chết thấp nhất (4,7%) và tỉ
lệ mẫu sống vô trùng đạt cao nhất (96,3%) so với
các nghiệm thức khác (Bảng 1). Nước javel
thương mại (có thành phần hoạt chất hypochlorite
- Na 5%) thích hợp dùng để khử trùng các loài
nấm và một phần khuẩn xâm nhập trên bề mặt và
mô lá nuôi cấy. Như vậy, nồng độ javel 50%, khử
trùng mẫu trong 10 phút thích hợp cho khử trùng
mẫu lá cây đinh lăng.
mSaponin = m Oleanoic STP - m Oleanoic KTP
Trong đó, hàm lượng oleanoic được tính theo
phương pháp ngoại chuẩn.
3.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ chất
khử trùng javel và thời gian khử trùng đến tỷ
lệ mẫu vô trùng in vitro
Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng javel và thời gian khử trùng mẫu đến tỷ lệ mẫu chết và mẫu vô
trùng
Chất khử trùng
Javel
(50%)
Javel
(100%)
Thời gian khử trùng
(phút)
10
15
20
10
15
20
Tỷ lệ mẫu chết
(%)
4,7a
20,4b
16,4b
20,3c
24,2d
48,6e
Tỷ lệ vô trùng
(%)
96,3a
79,6b
83,6b
79,7c
75,8d
51,4e
(Các số liệu được theo sau bởi các ký tự khác nhau có ý nghĩa khác biệt với độ tin cậy 95 %).
với các nghiệm thức khác (Bảng 2) (Hình 1). Ở
các nghiệm thức có bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng 2,4D cho thấy không có sự hình thành rễ
tơ; 2,4D là một loại auxin có hoạt lực mạnh, kích
thích sự phân chia tế bào nhu mô phát sinh mô sẹo
hay tế bào tiền phôi (Trần Văn Minh, 2013). Như
vậy, môi trường thích hợp nuôi cấy tạo rễ tơ từ lá
cây đinh lăng là môi trường MS + 1 mg/l NAA.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều hòa
sinh trưởng 2,4D và NAA đến tạo rễ tơ in vitro
Môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4D không
có tác dụng tạo rễ tơ. Bổ sung NAA vào môi
trường nuôi cấy có tác dụng hình thành rễ tơ. Bổ
sung NAA (1 mg/l) vào môi trường nuôi cấy MS
kích thích tạo rễ tơ cao 0,322 g/cụm. Ở môi
trường có nồng độ NAA (0,5 – 1 mg/l) trọng
lượng rễ tạo ra tương đương nhau và nhiều hơn so
Bảng 2. Ảnh hưởng của 2,4D và NAA đến quá trình tạo rễ tơ
Nồng độ chất ĐHST ngoại sinh (mg/l)
Trọng lượng tươi rễ tơ (g/cụm)
NAA 0,5
0,309a
NAA 1,0
0,322a
NAA 1,5
0,296b
NAA 2,0
0,263b
2,4D 0,5
0
2,4D 1,0
0
78
Journal of Science – 2015, Vol.7 (1), 75 – 83
Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
2,4D 1,5
0
2,4D 2,0
0
Hình 1. Hình thái rễ tơ tạo ra từ lá đinh lăng in vitro trong môi trường MS có bổ sung (a): NAA (2 mg/l); (b): NAA
(1 mg/l); (c): 2,4D (1,5 mg/l); (d): 2,4D (1 mg/l)
sung IBA tạo sợi rễ mảnh và nhỏ hơn so với rễ tơ
được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung NAA
(Hình 3,4,5). Kinetin không có tác động đến quá
trình tăng sinh rễ tơ; kinetin là một loại cytokinin
thường sử dụng trong các nghiên cứu kích thích
tăng sinh và biệt hóa vùng tế bào nhu mô như tăng
kích thước củ lily in vitro…, hay kích thích khả
năng biệt hóa tế bào tiền phôi ở cây tiêu sọ…
(Trần Văn Minh, 2013). Như vậy, môi trường
thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh rễ tơ in vitro cây
đinh lăng là môi trường MS + NAA (0,5 mg/l).
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các chất điều
hòa sinh trưởng 2,4D, NAA và IBA, kinetin
đến quá trình tăng sinh rễ tơ in vitro
Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung 2,4D (Hình
1) không có sự tăng sinh rễ. Trên môi trường nuôi
cấy bổ sung NAA và IBA đều có sự tăng sinh rễ
tơ sau 4 tuần nuôi cấy. Trên môi trường nuôi cấy
có bổ sung NAA cho tăng sinh rễ tơ nhiều hơn
môi trường có bổ sung IBA. Với nồng độ NAA
(0,5 mg/l) bổ sung vào môi trường, trọng lượng rễ
tăng sinh là 2,018 g/cụm (Bảng 3) (Hình 2). Rễ tơ
in vitro được nuôi cấy trong môi trường có bổ
Bảng 3. Ảnh hưởng của NAA, IBA và 2,4D đến quá trình tăng sinh rễ tơ
Nồng độ chất ĐHST ngoại sinh (mg/l)
Trọng lượng tươi rễ tơ (g/cụm)
NAA 0,3
1,977b
NAA 0,5
2,018a
NAA 1,0
1,985b
NAA 0,3 + KI 1,0
1,979b
NAA 0,5 + KI 1,0
1,988b
NAA 1,0 + KI 1,0
1,965b
IBA 0,3
1,808c
IBA 0,5
1,854c
79