Xem mẫu

Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41

Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology

NUÔI CẤY MÔ LÁ ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA L. HARMS ) TẠO
MÔ SẸO VÀ NHẬN BIẾT HOẠT CHẤT SAPONIN TÍCH LŨY
Nguyễn Trung Hậu1, Mai Thị Phương Hoa2, Trần Văn Minh3
Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh
Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Thành phố Hồ Chí Minh
3
Trường Đại học Quốc Tế, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
1
2

Thông tin chung:
Ngày nhận bài: 22/07/2015
Ngày nhận kết quả bình duyệt:
19/08/2015
Ngày chấp nhận đăng: 09/2016
Title:
Callus induction derived from
leaf of Dinh Lang (Polyscias
Fruticosa L. Harm) and
identification of saponin in
cultures
Từ khóa:
phát sinh mô sẹo, tốc độ tăng
sinh, Polyscias fruticosa,
saponin,
nuôi cấy dịch huyền phù
Keywords:
Lavandula angustifolia,
creating the bud, disinfected,
tissue culture,
micropropagation

ABSTRACT
To sterilize leaf samples of Dinh lang (Polyscias fruticosa L. Harm),
they were collected from 3 years old plants, surface-sterilized with
TCCA (0.5%) for 15 minutes. Sterilized leaf samples were cultured on
MS medium, supplemented with NAA (2 mg/l) for callus initiation. The
medium for the best callus proliferation was MS supplemented with
NAA (3 mg/l), reached to 0.390 g/cluster and proliferation rate of 1.921
(folds) after 6 weeks of cultures. Survey the growth dynamic of callus,
they were transferred to MS medium supplemented with NAA (3 mg/l)
and coconut water (10%). Multiplication rate reached to compensation
point at 1.548 (folds) after 4 weeks, higher than control without coconut
water (1.455 folds). Contents of oleanolic acid 115,9 µg/g and saponin
378,8 µg/g accumulating in cultures were measured by HPLC method.
TÓM TẮT
Mẫu lá từ cây mẹ 3 năm tuổi được khử trùng bằng TCCA (0,5%) trong 15 phút.
Mẫu lá vô trùng được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 2 mg/l cho
phát sinh mô sẹo. Môi trường nuôi cấy tăng sinh mô sẹo tốt nhất là môi trường
MS có bổ sung NAA 3 mg/l, đạt 0,390 g/cụm mô sẹo và tốc độ tăng sinh là
1,921 lần sau 6 tuần nuôi cấy. Khảo sát động thái sinh trưởng của mô sẹo, mô
sẹo được cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung NAA 3 mg/l và nước dừa
10%. Tốc độ tăng sinh đạt 1,445 lần. Hàm lượng oleanolic acid 115,9 µg/g và
saponin 378,8 µg/g tích tụ trong nuôi cấy mô sẹo được định lượng bằng HPLC.

Đinh lăng có tác dụng tăng cường sinh lực, tăng
tính hòa tan các dược chất khác, chống viêm,
kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế hoạt động của
virus, diệt các loài nhuyễn thể, tăng tính thấm biểu
mô đường hô hấp, an thần (Huan và cs., 1998),
chống oxy hóa, giảm stress (Bensita và cs., 1998).
Một số loài trong chi Polyscias còn chứa
hederagenin,
oleanolic
acid
glycosides,
polyacetylenic, có tác dụng lợi tiểu như

1. MỞ ĐẦU
Đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) thuộc
họ Araliaceae, là loài cây có thân bụi, lá thường
xanh được trồng nhiều ở các quần đảo Thái Bình
Dương và vùng Đông Nam Á như Indonesia, Lào,
Malaysia, Papua New Guinea, Philippines,
Singapore, Thái Lan và Việt Nam (Brickell,
2003).

33

Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41

Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology

furosemide (Lutomski và Trần Công Luận, 1992;
Lutomski và cs., 1992).

furfurylaminopurine), oleanic acid (Sigma
Aldrich) và saponin (không có chuẩn này). TCCA
90 (Trichloroisocyanuric 90).

Một số nghiên cứu về thành phần hóa học ở đinh
lăng đã được công bố. Masruri và cs. (2007) đã
phát hiện 3 hợp chất từ vỏ rễ đinh lăng 3-O-β-DGlucopyranosyl (1→2)-β-D-Glukopiranosyl, 3-Oβ-Drhamnopyranosyl
(1→2)-β-Drhamnopyranosyl (1→3)-β-D-glucopyranosyl và
3-O-β-D-glucopyranosyl. Huan và cs. (1998) đã
định tính trong dịch chiết rễ, thân và lá đinh lăng
có các glycosid, alkaloid, tanin, vitamin B1,
khoảng 20 loại acid amin khác và phân lập được
11 triterpen. Trần Công Luận và cs. (2001) đã
định tính 5 hợp chất polyacetylen từ lá đinh lăng,
trong đó 2 hợp chất chủ yếu: panaxynol và
heptadeca 1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol có tác
dụng kháng khuẩn.

Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo: Mô lá non của
cây đinh lăng 3 - 4 năm tuổi được thu thập và khử
trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, rửa mẫu bằng
nước cất vô trùng 3 lần, sau đó khử trùng bằng
TCCA 90 (Trichloroisocyanuric 90) nồng độ 0,5 1,5%, bổ sung với 3 - 4 giọt tween 80% trong thời
gian 5 - 15 phút, tiếp tục rửa mẫu 5 lần bằng nước
cất vô trùng. Mẫu sau khử trùng được cấy vào môi
trường nuôi cấy tạo mô sẹo và nhân sinh khối.
Thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu
nhiên với 9 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức lặp lại
3 lần, mỗi lần lặp lại nuôi cấy trong 3 bình tam
giác 300 ml, mỗi bình tam giác nuôi cấy 5 mẫu.
Số liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm
Statgraphics Centurion XV. Chỉ tiêu theo dõi:

Những tính chất sinh học đặc sắc của Polyscias
fruticosa được phát hiện qua nuôi cấy tạo mô sẹo
(Slepyan và cs., 1975b) và tế bào huyền phù
(Furmanowa và cs., 2002). Hoạt chất oleanolic
acid glycosides trong dịch chiết sinh khối tế bào
qua nuôi cấy bằng bioreactor ở Viện Sinh lý Thực
vật (Viện Hàn lâm Khoa học Moscow) đã thương
mại hóa dưới thương hiệu “Vitamal” được uống
hàng ngày đặc trị tính thích ứng và miễn dịch môi
trường (Furmanowa và cs., 2002).

Tỷ lệ mẫu vô trùng = Số mẫu không nhiễm / Tổng
số mẫu nuôi cấy (%)
Tỷ lệ mẫu chết = Số mẫu bị hoại tử / Tổng số mẫu
nuôi cấy (%)
Hệ số tăng sinh = Sinh khối sau nuôi cấy / Sinh
khối ban đầu đưa vào nuôi cấy (%)
Xác định hàm lượng saponin bằng phương pháp
phân tích HPLC (Trịnh Thị Nhung, 2012): Ngoài
phương pháp tạo bọt (Nguyễn Kim Phi Phụng,
2007), oleanic acid và saponin được phân tích
định lượng bằng phương pháp HPLC:

Trong bài báo này, chúng tôi nghiên cứu khả năng
tạo mô sẹo và tích lũy saponin trong mô sẹo nuôi
cấy là nền tảng cho phát triển kỹ thuật nuôi cấy
huyền phù tế bào đinh lăng dễ thu nhận saponin.

 Chuẩn bị mẫu phân tích oleanolic acid: cân
150 mg mẫu vào ống COD, chiết siêu âm 4 lần
với 10 mL ethylacetatat chứa 1% acid formic.
Thổi khô ethyl acetat. Hòa tan phần cặn bằng
pha động, lọc qua màng lọc 0,45 micro trước
khi tiêm vào hệ thống HPLC.
 Chuẩn bị mẫu phân tích saponin tổng số: cân
150 mg mẫu vào bình cầu cổ nhám, thêm 50
mL nước nóng và ủ tại 90 oC trong 10 phút.
Thêm 7,5 mL HCl đậm đặc và đun hoàn lưu
cách thủy trong 2 giờ. Tiếp theo, chiết 4 lần x
100 mL dicloromethan, pha dicloromethan cô
quay tới gần cạn, phần còn lại được thổi khô
hoàn toàn bằng dòng khí N2. Hòa tan phần cặn

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu: Chồi ngọn dài 20 cm của cây đinh lăng 3
năm tuổi được thu thập tại huyện Trảng Bom, tỉnh
Đồng Nai được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy.
Phương pháp
Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS (Murashige
và Skoog, 1962) được khử trùng ở 121 oC (1 atm)
trong 30 phút. Mẫu nuôi cấy được đặt trong phòng
sáng ở nhiệt độ (26 + 2) oC, cường độ chiếu sáng
22,2 µmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày.
Có bổ sung 2,4D (2,4-dichlorophenoxyacetic
acid), NAA (α-naphthaleneacetic acid), kinetin (634

Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41

Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology

bằng pha động, lọc qua màng lọc 0,45 micro
trước khi tiêm.

trong đó, hàm lượng oleanoic được tính theo
phương pháp ngoại chuẩn.

Để định lượng saponin tổng số, các nhánh đường
gắn trên aglycone được thủy phân trong môi
trường acid để chuyển hết về dạng aglycone. Do
đó, saponin tổng số được định lượng thông qua
acid oleanolic.

Thiết kế thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ chất khử
trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu vô
trùng. Lá đinh lăng với kích thước 4 cm x 5 cm,
có màu xanh được sử dụng để khử trùng. Mẫu lá
sau khi khử trùng được cấy vào môi trường có
kích thước 2 cm x 2,5 cm. Sau 3 tuần nuôi cấy,
xác định tỷ lệ mẫu sống vô trùng.

* Quy trình HPLC phân tách và định lượng
oleanolic acid và saponin
Hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp Agilent 1200
(USA) bao gồm: bơm đôi cao áp (trộn dòng áp
suất cao), bộ tiêm mẫu tự động, lò cột, đầu dò
DAD.

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của NAA và 2,4D đến
tạo sẹo của mẫu lá đinh lăng. Mẫu lá đinh lăng
sống vô trùng từ thí nghiệm 1 được cắt với kích
thước 0,5 cm x 1 cm, cấy vào môi trường MS bổ
sung chất điều hòa sinh trưởng và được đặt trong
tối. Ghi nhận tỷ lệ tạo mô sẹo và đặc điểm của mô
sẹo sau 6 tuần nuôi cấy.

Pha tĩnh: cột ACE3- C18 (4.6 mm x 150
mm, 3,5 µm), được ổn nhiệt ở 20 0C.
Pha động: chương trình pha động được
thực hiện tại tốc độ dòng 0,5 mL/phút tại tỷ lệ pha
A: pha B là 10:90 v/v. Trong đó, pha A là đệm
trietylamine/HCl, pH 3 và pha B là MeOH chứa
0,1 % acid formic bước sóng 210 nm.
* Phương pháp tính toán hàm lượng oleanoic acid
và saponin tổng số trong mẫu được thực hiện theo
phương pháp ngoại chuẩn: Pha 5 điểm chuẩn
oleanoic acid các nồng độ C1, C2, C3, C4, C5.
Sau đó tiến hành ghi tín hiệu sắc ký của các điểm
chuẩn này. Từ sắc ký đồ thu được của các điểm
chuẩn, lấy tín hiệu diện tích mũi sắc ký của từng
điểm chuẩn được các giá trị S1, S2, S3, S4, S5.
Từ đó, dựng đường tuyến tính diện tích mũi sắc
ký theo nồng độ thu được hàm số bậc nhất: y = ax
+ b. Trong đó y là diện tích mũi, x là nồng độ
dung dịch chuẩn oleanoic đã biết từ sắc ký đồ của
các mẫu phân tích, lấy diện tích của mũi sắc ký
oleanoic acid được giá trị S mẫu. Giá trị S mẫu
được áp vào đường tuyến tính y = ax + b sẽ thu
được giá trị nồng độ oleanoic acid trong mẫu.

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NAA và kinetin
đến sự tăng sinh mô sẹo. Mẫu sẹo lá đinh lăng từ
thí nghiệm 2 được tách với khối lượng 0,2 g/mẫu,
có kích thước (0,25 x 0,25 x 0,25) cm/mẫu, cấy
chuyển vào môi trường MS bổ sung các chất điều
hòa sinh trưởng. Sau 6 tuần theo dõi, ghi nhận sự
tăng sinh mô sẹo và đặc điểm của mô sẹo.
Thí nghiệm 4: Động thái sinh trưởng của mô sẹo
được khởi phát từ lá đinh lăng. Xác định đường
cong tăng trưởng của tế bào mô sẹo được khởi
phát từ lá đinh lăng trên môi trường MS bổ sung
NAA 3 mg/l (G3) và NAA 3 mg/l + CW (10%)
(GD3). Mẫu mô sẹo lá đinh lăng từ thí nghiệm 2
được tách với khối lượng 0,2 g/mẫu, có kích
thước (0,25 x 0,25 x 0,25) cm/mẫu. Xác định
đường cong tăng trưởng của tế bào mô sẹo khởi
phát từ lá đinh lăng sau 6 tuần nuôi cấy, xác định
hệ số tăng sinh mô sẹo và đặc điểm của mô sẹo.
Thí nghiệm 5: Định lượng oleanic acid và
saponin trong khối mô sẹo khởi phát từ lá đinh
lăng bằng HPLC.

Quá trình thủy phân mẫu giúp chuyển các saponin
về dạng acid oleanoic. Do đó, hàm lượng saponin
tổng số (mSaponin) được tính bằng cách lấy hàm
lượng acid olenoic sau thủy phân (m Oleanoic STP)
trừ cho hàm lượng acid oleanoic không thủy phân
(m Oleanoic KTP).

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ chất
khử trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ
mẫu sống vô trùng.

mSaponin = m Oleanoic STP - m Oleanoic KTP
35

Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41

Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology

Kết quả Bảng 1 cho thấy không có sự khác biệt về
tỷ lệ mẫu sống vô trùng giữa nghiệm thức T8 và
T9, nhưng nghiệm thức T8 và T9 cho tỷ lệ mẫu
sống vô trùng (100%) cao hơn có ý nghĩa thống
kê so với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức
T1 cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng (60%) thấp nhất
có ý nghĩa thống kê khi so sánh với các nghiệm
thức. Trong khi đó không có sự khác biệt về tỷ lệ
mẫu sống vô trùng (93,33%) giữa các nghiệm
thức T3, T6 và T7 nhưng các nghiệm thức này
cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao hơn có ý nghĩa

khi so sánh với nghiệm thức T5 (86,67%), T4
(80,00%) và T2 (73,33 %). Do nồng độ chất khử
trùng càng cao thì mẫu lá vô trùng biểu hiện sức
sống càng yếu.
Như vậy, nghiệm thức T3 (TCCA 90 (0,5%) trong
thời gian 15 phút) cho hiệu quả khử trùng tốt nhất
(Hình 1). Điều này cho thấy ở nồng độ TCCA 90
(0,5%) trong thời gian 15 phút đủ để tiêu diệt
nguồn lây nhiễm, đồng thời hạn chế thấp nhất ảnh
hưởng đến sinh trưởng mô lá cây đinh lăng.

Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ TCCA 90 và thời gian khử trùng đến khả năng khử trùng mẫu lá

Tỷ lệ mẫu sống vô
trùng (%)

Đặc điểm mẫu vô trùng

TCCA 90 (%)

Thời gian khử
trùng (phút)

T1

0,5

5

60,00e

Mẫu sống có màu xanh

T2

0,5

10

73,33d

Mẫu sống có màu xanh

T3

0,5

15

93,33b

Mẫu sống có màu xanh

T4

1,0

5

80,00c

Mẫu sống có màu xanh

T5

1,0

10

86,67c

Mẫu sống có màu vàng

T6

1,0

15

93,33b

Mẫu sống có màu vàng

T7

1,5

5

93,33b

Mẫu sống có màu vàng

T8

1,5

10

100,00a

Mẫu sống có màu vàng

T9

1,5

15

100,00a

Mẫu sống có màu vàng

NT

Nồng độ

(> 50% số mẫu)

Hình 1. Mẫu lá khử trùng ở nghiệm thức T3 và T8 sau 3 tuần nuôi cấy

36

Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 33 – 41

Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology

Tương tự, ở các nghiệm thức bổ sung 2,4D vào
môi trường nuôi cấy, nồng độ 2,4D tăng từ 0,5
đến 1 mg/l thì tỷ lệ tạo mô sẹo tăng có ý nghĩa
thống kê, trong đó nghiệm thức D2 (1 mg/l) cho
tỷ lệ tạo sẹo là cao nhất (46,67%). Nhưng tiếp
tục tăng nồng độ 2,4D cao hơn 1 mg/l đến 4 mg/l
thì khả năng tạo sẹo lại giảm có ý nghĩa thống kê,
nghiệm thức D4 (4 mg/l) cho kết quả thấp nhất
(20 %).

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của NAA và 2,4D
đến tạo sẹo của mẫu lá đinh lăng.
Mẫu lá đinh lăng vô trùng được nuôi cấy trên môi
trường MS có bổ sung NAA và 2,4D nhằm kích
thích quá trình tạo sẹo ở lá đinh lăng. Kết quả ghi
nhận ở Bảng 2 cho thấy trên môi trường nuôi cấy
MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng sẽ
không tạo sẹo. Ở các nghiệm thức còn lại, trong
các môi trường nuôi cấy khác nhau, lượng mẫu
tạo mô sẹo có ý nghĩa thống kê. Nồng độ NAA
càng tăng (từ 0,5 đến 2 mg/l) thì tỷ lệ mẫu tạo mô
sẹo càng tăng. Số mẫu tạo mô sẹo đạt kết quả cao
nhất (80%) ở nghiệm thức A3 (NAA 2 mg/l). Tuy
nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ NAA cao hơn 2
mg/l đến 4 mg/l (A4) thì khả năng tạo sẹo lại
giảm. Số mẫu tạo mô sẹo đạt kết quả thấp nhất
(40%) ở nghiệm thức A4 (4 mg/l).

Trong hai loại auxin (NAA, 2,4D) bổ sung trong
thí nghiệm thì NAA thích hợp cho việc tạo sẹo
hơn. Sau 6 tuần nuôi cấy, ta nhận thấy ở nghiệm
thức A3 (NAA 2 mg/l) có tỷ lệ mẫu lá tạo sẹo lớn
nhất (80%), sẹo có màu trắng và kích thước khối
mô sẹo tạo ra cũng lớn hơn nghiệm thức D2 (Hình
2).

Bảng 2. Ảnh hưởng của NAA và 2,4D đến sự tạo mô sẹo lá

NAA

2,4D

Tỷ lệ mẫu tạo sẹo

Đặc điểm mô sẹo

(mg/l)

(mg/l)

(%)

(> 50% số mẫu)

MS0

-

-

0,00

-

A1

0,5

-

53,33c

Sẹo ướt xốp, có màu vàng

A2

1

-

66,67b

Sẹo ướt xốp, có màu vàng

A3

2

-

80,00a

Sẹo ướt xốp, có màu trắng

A4

4

-

40,00d

Sẹo ướt xốp, có màu trắng

D1

-

0,5

33,33e

Sẹo ướt xốp, có màu vàng

D2

-

1

46,67d

Sẹo ướt xốp, có màu vàng

D3

-

2

26,67f

Sẹo ướt xốp, có màu nâu

D4

-

4

20,00f

Sẹo ướt xốp, có màu nâu

NT

Hình 2. Mẫu lá được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo
(MS0, A3, và D2 sau 6 tuần nuôi cấy)
37

nguon tai.lieu . vn