Nghiên cứu chiết tách, xác định axit hydroxycitric trong lá, vỏ quả của cây bứa, ứng dụng tạo muối kali hydroxy citrat

Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH AXIT HYDROXYCITRIC TRONG LÁ, VỎ QUẢ CỦA CÂY BỨA, ỨNG DỤNG TẠO MUỐI KALI HYDROXY CITRAT A STUDY ON THE EXTRACTION, SEPARATION AND DETERMINATION OF HYDROXYCITRIC ACID IN FRESH LEAVES AND DRIED RINDS OF THE FRUITS OF GARCINIA OBLONGIFOLIA CHAMP. EX BENTH FOR MAKING POTASSIUM HYDROXYCITRATE SALT SVTH : NGUYỄN MINH HIỀN Lớp 04HH – Khoa Hóa – Trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng GVHD: PGS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG Khoa Hóa – Đại học Sư Phạm Đà Nẵng TÓM TẮT Sau khi chiết tách các axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa khô, kiểm tra mẫu chiết bằng phổ hồng ngoại IR, xác định HCA bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC), kết quả cho thấy chiết bằng dung môi nước cho lượng axit HCA là lớn nhất, tiếp đến là axeton và metanol. Giá trị thu được chủ yếu của phương pháp HPLC được tính đến chỉ là HCA, hàm lượng trong lá và vỏ quả bứa khô lần lượt là 2,663 và 15,221%, phần axit còn lại là lượng nhỏ axit citric. Bước đầu đã tạo được muối Kali hydroxy citrat. ABSTRACT After the extraction and separation of organic acids in fresh leaves and dried rinds of the fruits of Garcinia oblongifolia champ. ex benth, the examination of samples by infrared analysis, the determination of hydroxycitric acid (HCA) by high – performance liquid chromatography (HPLC), it is shown that the extraction with the use of water produces the highest amount of HCA, followed by aceton and methanol. By HPLC, the major organic acid found is hydroxycitric acid that constitutes 2.663% and 15.221% in the leaves and rinds of the fruits respectively, and citric acid makes up the minority. This provides the basic substance for making potassium hydroxycitrate salt. 1. MỞ ĐẦU Cây bứa là loại cây tương đối dễ trồng, cho năng suất cao và có mặt ở hầu hết trên các địa bàn Miền Trung, Tây Nguyên, Nam Bộ. Từ lâu, người Việt Nam ta đã dùng lá và quả bứa làm món ăn, vỏ bứa để trị một số bệnh ngoài da…Trên thế giới việc nghiên cứu cây bứa đã được chú trọng từ lâu, những nghiên cứu trong thời gian gần đây đã chứng minh tính hiệu quả của muối 60% canxi – kali của HCA được lấy từ Garcinia cambogia (trong các sản phẩm của HCA-SX hay Super CitriMax) trong việc khống chế cân nặng. Cho đến nay ở nước ta chưa có một nghiên cứu nào mang tính cơ bản về thành phần, tính chất, khả năng ứng dụng về các hợp chất hóa học có trong cây bứa. Với những lí do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định axit hyđroxy citric trong lá, vỏ quả của cây bứa, ứng dụng tạo muối kali hidroxy citrat”. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu: Lá, vỏ quả của cây bứa (Garcinia oblongifolia Champ. Ex Benth.) tại xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang – TP. Đà Nẵng (hình 2.1). Hình 2.1: Cây, lá và vỏ quả bứa 310 Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp trọng lượng Sử dụng chiết chưng ninh, chiết soxhlet để tách axit hydroxycitric Phương pháp chuẩn độ axit – bazơ để xác định tổng lượng axit Phương pháp xác định cấu trúc hóa học bằng phổ hồng ngoại IR. Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) để định lượng các axit hữu cơ. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định một số đại lƣợng vật lí Dựa vào phương pháp trọng lượng có thể xác định được độ ẩm và hàm lượng tro trong lá, vỏ quả bứa như sau (bảng 3.1 và 3.2) Bảng 3.1: Kết quả xác định độ ẩm trong lá, vỏ quả bứa Mẫu STT mẫu m0 m1 m2 W(%) 1 9,826 2,889 7,037 71,61 Lá 2 9,960 2,898 7,062 70,90 bứa 3 10,172 3,022 7,150 70,29 4 10,024 2,978 7,046 70,29 1 10,601 1,676 8,925 84,19 2 10,596 1,646 8,950 84,47 3 10,593 1,646 8,947 84,46 4 9,865 1,613 8,252 83,65 Trong đó: m0: Khối lượng mẫu trước khi sấy m1: Khối lượng mẫu sau khi sấy m2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy W (%): độ ẩm của mẫu Nhận xét: Vậy độ ẩm trung bình trong lá là 70,90%; trong vỏ quả bứa là 84,34%. 3.1.2. Hàm lƣợng tro trong lá, vỏ quả bứa Bảng 3.2: Kết quả xác định hàm lượng tro trong lá, vỏ quả bứa sấy khô Mẫu Lá bứa Stt mẫu 1 2 3 m0 m1 28,551 32,532 29,302 33,211 26,549 30,453 m2 m3 3,981 28,679 3,919 29,434 3,910 26,689 Khối lƣợng tro (g) 0,128 0,132 0,140 % tro 3,21 3,37 3,58 4 28,141 32,244 4,103 28,274 0,133 3,24 Vỏ 1 30,924 34,356 3,432 30,978 0,054 1,57 quả 2 26,946 30,662 3,676 27,003 0,057 1,55 bứa 3 26,897 31,071 4,174 26,958 0,061 1,46 khô 4 28,564 32,550 3,986 28,620 0,056 1,40 Trong đó: m0: Khối lượng cốc (g) m1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi tro hóa (g) m2: Khối lượng mẫu m3: Khối lượng cốc và mẫu sau khi tro hóa Nhận xét: Hàm lượng tro trung bình trong lá bứa là 3,35%; trong vỏ quả khô là 1,5% 3.2. Chiết các axit hữu cơ Chiết Soxhlet: Cân khoảng 10g mẫu vỏ quả bứa dạng bột mịn chiết với 150ml axeton hay metanol ở 750C trong vòng 8 tiếng. Lọc và cô đặc dịch chiết, sau đó xử lí bằng 311 Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 than hoạt tính để tẩy màu. Lọc bằng phễu buchne, dịch chiết được trộn chung và cô đặc còn lại 50ml, lưu giữ mẫu ở 40C. Chƣng ninh trong nồi áp suất: Cân khoảng 10g mẫu lá hoặc vỏ quả tươi đã cắt nhỏ với 150ml nước cất trong nồi áp suất ở nhiệt độ 1270C, áp suất 0,15Mpa trong thời gian 1 giờ. Lọc bằng vải muslin và phần xác tiến hành chiết lần nữa cho đến khi dịch lọc không còn vị chua, kiểm tra bằng giấy pH cho môi trường trung tính. Xử lí bằng than hoạt tính, lọc bằng phếu buchne. Tiếp tục xử lí với 100ml cồn để kết tủa hết pectin. Ly tâm lọc kết tủa, cô đặc dịch nổi đến 50 ml, lưu giữ mẫu ở 40C. 3.3. Kiểm tra mẫu chiết bằng phổ hồng ngoại (IR) 0.65 0.60 0.55 0.50 3400 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 1750 1620 0.24 3450 0.22 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Wavenumbers(cm-1) 0.00 500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wavenumbers(cm-1) Hình 3.1: Phổ IR mẫu vỏ quả bứa chiết trong nước Hình 3.2: Phổ IR mẫu lá bứa chiết trong nước Nhận xét: Kết quả chụp phổ IR (xem hình 3.1 và 3.2) cho thấy xuất hiện pic có bước sóng 1620 và 1750cm-1, đó là phổ của nhóm C=O trong nhóm –COOH), có thể kết luận trong mẫu chiết từ nước của lá, vỏ quả bứa có sự tồn tại của các axit hữu cơ. 3.4. Xác định HCA trong mẫu chiết bằng sắc kí lỏng cao áp Axit HCA lại có khuynh hướng bị lacton hóa trong suốt quá trình gia nhiệt. Đối với phương pháp sắc kí lỏng cao áp, ta có thể định lượng HCA và các axit khác một cách riêng biệt mà không cần phải sấy, hóa hơi dịch chiết. 3.4.1. Xây dựng đƣờng chuẩn Chất chuẩn: (-)-Calcium threo-hydroxyxitrat tribasic hydrate Chuẩn bị HCA tự do và dung dịch chuẩn axit citric: Cho 50mg chất chuẩn hòa với 5ml nước, xử lí với 500 mg Dowes 50[H+]. Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10ppm đến 320ppm. Dung dịch chuẩn axit citric được chuẩn bị riêng biệt có nồng độ thay đổi từ 2 đến 30ppm. Kết quả xây dựng đường chuẩn được thể hiện qua hình 3.3 và 3.4. Hình 3.3: Đường chuẩn HCA Hình 3.4: Đường chuẩn axit citric 312 Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 3.4.2. Kết quả xác định HCA trong lá, vỏ quả bứa Điều kiện sắc kí để xác định (-)-HCA và axit citric trên máy sắc kí lỏng cao áp Knauer, lắp cột sắc kí C18: 250mm x 4,6ID x 5μm. Quá trình dò được thực hiện bởi đetectơ UV: bước sóng 210nm. Pha động gồm (A) metanol và (B) là axit photphoric 0,01M với tốc độ dòng 1,5ml/m, B:A theo tỉ lệ 9:1. Hình 3.5: Sắc kí đồ mẫu axit HCA và axit xitric chuẩn Hình 3.6: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong metanol Hình 3.7: Sắc kí đồ mẫu quả bứa khô chiết trong nước Hình 3.8: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong axeton Hình 3.9: Sắc kí đồ mẫu lá bứa chiết trong nước Nhận xét: Thời gian lưu của HCA và axit citric được tìm thấy trong tất cả các mẫu lần lượt là 4,992 ± 0,065; 5,609 ± 0,010 phút (hình 3.6, 3.7, 3.8, 3.9). Axit chủ yếu được tìm thấy trong lá, vỏ quả bứa bằng HPLC là HCA. Pic thứ yếu được xác định là axit citric. Thành phần axit hữu cơ xác định bằng phƣơng pháp sắc kí lởng cao áp đƣợc tính bằng công thức sau: Công thức tính HCA: %HCA = (1,37*S – 6,88)*Vđm*Kpl/m*10000 Công thức tính axit citric: %AC = (2,55*S – 5,43)*Vđm*Kpl/m*10000 Trong đó: S : Diện tích pic sắc kí Vcđ : Thể tích mẫu cô đặc (ml) Kpl : Hệ số pha loãng m : Trọng lượng mẫu thử (g) Kết quả xác định HCA và axit citric trong lá, vỏ quả bứa bằng phương pháp HPLC được thể hiện ở bảng 3.3. 313 Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 Bảng 3.3: Kết quả xác định axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa bằng HPLC Dung Mẫu môi chiết Lá bứa Nước Stt mẫu 1 2 3 Am m (g) Axit Vcđ Kpl xitric 10,359 91,422 0 100 25 10,328 91,821 0 100 25 10,093 89,091 0 100 25 HCA (%) 2,857 2,878 2,853 Axit xitric (%) 0 0 0 1 10,087 198,414 4,188 50 100 13,133 0,260 Axeton 2 10,199 199,457 4,042 50 100 13,059 0,239 3 10,086 193,552 3,854 50 100 12,804 0,218 1 10,513 238,573 5,602 50 100 15,218 0,421 Nước 2 10,086 229,983 5,358 50 100 15,278 0,408 3 10,000 226,488 5,187 50 100 15,170 0,390 1 10,199 147,534 2,840 100 50 9,572 0,089 Metanol 2 9,949 141,736 2,651 100 50 9,413 0,067 3 10,188 146,887 2,750 100 50 9,538 0,078 Nhận xét: Khi dùng dung môi nước với phương pháp chưng ninh thu được hàm lượng HCA là cao nhất (15,2%), tiếp đến là axeton cuối cùng là metanol. 3.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến tổng lƣợng axit hữu cơ trong phƣơng pháp chƣng ninh bằng nồi áp suất Tồnglƣợng 3.5.1. Khảo sát thời gian chiết tối ƣu 20 Cân khoảng 10g mẫu vỏ quả bứa 15 khô chưng ninh trong nồi áp suất với 200ml nước tiến hành trong các khoảng 10 thời gian: 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 5 phút. Nhận xét: Tổng lượng axit chiết 0 Thờigianchiết được là lớn nhất ứng với thời gian chiết là 90 phút, về sau lượng axit thu được thay đổi không đánĐồ thịthể hiệnảnh hƣởng của thờigian chiết vàotống lƣợng axit chiết 3.5.2. Khảo sát tỉ lệ rắn/ lỏng tối ƣu Để tìm ra điều kiện chưng ninh tốt ta cố định thời gian chiết là 90 phút và đổi tỉ lệ dung môi chiết, cụ thể là nước lượt là: 50, 100, 150, 200, 250, 300 ml. Nhận xét: Tỉ lệ rắn – lỏng tối ưu 10g/200ml nước. Hình 3.10: Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc của tổng lượng axit vào thời gian chiết Tồng lƣợng axitTB 20 15 10 5 nhất, thay lần là 0 50 100 150 200 250 300 Hình 3.11: Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc của tổng 3.6. Tạo muối Kali hydroxyl citrat Đồthị thểhiện ảnhhƣởngcủa tỉ lệrắn/lỏng Dựa vào kết quả khá khả quan về lượng HCA thu được bằng phương pháp chưng ninh, trên cơ sở đó xây dựng quy trình tạo muối kali hydroxyl citrat. Dịch chiết sau khi cô đặc được xử lí bằng dung dịch KOH 40%. Chất lỏng sánh như dầu lắng xuống dưới đáy phểu chiết 314 ... - tailieumienphi.vn