Xem mẫu
- 1
B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O
Đ I H C ĐÀ N NG
Đ NG QUANG VINH
NGHIÊN C U
CHI T TÁCH, CHUY N HOÁ
HYDROXYCITRIC ACID TRONG LÁ,
V QU B A VÀ NG D NG T O S N PH M GI M BÉO
Chuyên ngành: HOÁ H U CƠ
Mã s : 62 44 27 01
TÓM T T LU N ÁN TI N SĨ HOÁ H C
Đà N ng – Năm 2012
- 2
Công trình ñư c hoàn thành t i
Đ I H C ĐÀ N NG
Ngư i hư ng d n khoa h c:
1. GS. TS. ĐÀO HÙNG CƯ NG
2. PGS.TS. NGUY N THƯ NG
Ph n bi n 1: PGS.TS.Tr n Văn Th ng
Ph n bi n 2: PGS.TS. Lê T H i
Ph n bi n 3: PGS.TS. Nguy n Th Thu Lan
Lu n án s ñư c b o v t i H i ñ ng ch m Lu n án
ti n s chuyên ngành Hóa h u cơ h p t i Đ i h c Đà
N ng vào ngày 20 tháng 7 năm 2012.
Có th tìm hi u lu n văn t i:
- Trung tâm Thông tin - H c li u, Đ i h c Đà N ng
- Thư vi n trư ng Đ i h c Sư ph m, Đ i h c Đà N ng
- 3
M Đ U
1. Tính c p thi t c a ñ tài
Trên th gi i vi c nghiên c u cây b a ñã ñư c chú tr ng t lâu,
tính ñ n nay ñã có hàng trăm công trình nghiên c u v cây b a bao
g m các lĩnh v c chi t tách, xác ñ nh thành ph n hoá h c các h p
ch t h u cơ, ng d ng trong công ngh th c ph m, công ngh dư c
ph m, ñ c bi t là các lo i ch ph m gi m béo. Tuy nhiên, chưa có
công trình nào công b v nghiên c u chuy n hoá HCA và ng d ng
gi m béo m t cách chi ti t.
Cây b a là m t lo i cây r t d tr ng, phát tri n t t, cho năng su t
cao có h u h t trên các ñ a bàn Mi n Trung, Tây Nguyên. Ngư i
Vi t Nam ta dùng lá và qu b a làm món ăn, dùng v qu b a ñ tr
m t s b nh ngoài da và dùng búp non nhai ăn ñ ch a b nh ñ ng
thai... Cho ñ n nay nư c ta chưa có m t nghiên c u nào mang tính
cơ b n v thành ph n, tính ch t, kh năng chuy n hoá và ng d ng,
công ngh khai thác v các h p ch t hoá h c có trong cây b a. Đây
là nh ng v n ñ r t ñáng ñư c quan tâm nghiên c u nh m góp ph n
quy ho ch, khai thác, ch bi n và ng d ng các s n ph m c a cây
b a m t cách có hi u qu , khoa h c hơn.
V i nh ng lí do trên, chúng tôi ch n ñ tài nghiên c u: "Nghiên
c u chi t tách, chuy n hoá hydroxycitric acid trong v qu b a và
ng d ng t o s n ph m gi m béo" làm lu n án ti n sĩ chuyên ngành
hóa h u cơ c a mình.
2. M c ñích nghiên c u
- Xác ñ nh hàm lư ng, tính ch t, kh năng chuy n hoá c a
hydroxycitric acid trong lá và v qu b a.
- T o ra ch ph m ph gia th c ph m kh o nghi m gi m béo.
- Đóng góp thêm nh ng thông tin, tư li u khoa h c v cây b a.
- 4
3. Đ i tư ng và ph m v nghiên c u
* Đ i tư ng nghiên c u:
- Lá, v qu c a cây b a t i xã Hòa Liên, h. Hòa Vang, TP. ĐN.
* Ph m vi nghiên c u:
- Nghiên c u chi t tách b ng dung môi nư c và dung môi h u
cơ, ñ nh tính và ñ nh lư ng các acid có trong trong lá, v qu b a.
- Tinh ch , phân tích các ch tiêu m u thí nghi m, s n ph m.
- Ph n ng chuy n hoá HCA thành các mu i kim lo i nhóm I và
II (K, Ca).
- Đánh giá kh năng ho t tính sinh h c c a các s n ph m sau
chuy n hoá.
4. Phương pháp nghiên c u
Nghiên c u lý thuy t k t h p v i th c nghi m.
5. Ý nghĩa khoa h c và th c ti n c a ñ tài
Đ nh danh tên khoa h c cây b a vùng nguyên li u, xác ñ nh acid
h u cơ trong lá, v qu b a. Chuy n hóa HCA trong lá, v qu b a
thành các d ng mu i b n và có ho t tính sinh h c. Cung c p các
thông tin v kh năng ch ng béo phì các ch ph m chuy n hóa. C p
nh t các thông tin v lá, v qu b a và h p ch t HCA. T o cơ s ban
ñ u ñ nghiên c u chi t tách, chuy n hóa HCA t cây b a Vi t Nam
v i quy mô công nghi p ñ s n xu t th c ph m ch c năng gi m cân,
thúc ñ y s phát tri n c a ngành dư c li u trong nư c.
6. C u trúc c a lu n án
Lu n án g m ph n m ñ u, k t lu n và ki n ngh , các công trình
ñã công b , tài li u tham kh o, ph l c và 03 chương.
CHƯƠNG 1 - T NG QUAN
1.1. M T S LOÀI B A T I VI T NAM VÀ TH GI I
- 5
1.1.1. Đ c ñi m, phân b cây b a
nư c ta còn có m t s loài
b a như: B a - Garcinia
oblongifolia Champ. Ex Benth (hình
1.1); B a m i - Garcinia harmandii
Pierre; B a nhà - Garcinia
cochinchinensis (Lour) Choisy; Tai Hình 1.1. Qu , lá, hoa c a b a
chua - Garcinia pedunculata Roxb
(G. cowa Roxb); B a ñ ng - Garcinia schomburgkiana Pierre; B a
l a - Garcinaia fusca Pierre; B a Scheffer - Garcinaia schefferi
Pierre; B a Planchon - Garcinaia planchonii Pierre; B a m vàng -
Garcinia xanthochymus Hook.f.ex J. Anderson. M t s lo i b a khác
n Đ như: Garcinia cambogia; Garcinia indica; Garcinia
atroViridis.
1.2. K T QU NGHIÊN C U HYDROXYCITRIC ACID
(HCA), CÁC MU I C A HCA TRONG NƯ C VÀ TH GI I
1.2.1. K t qu nghiên c u trên th gi i
1.2.1.1. Ngu n g c (-)-HCA
(-)-HCA ñư c tìm th y trong v qu c a m t vài loài b a, bao
g m tai chua (G. cowa), G. cambogia, G. indica, và G. atroViridis.
Các loài này m c nhi u t i l c ñ a n ñ và phía tây Sri Lanka.
1.2.1.2. Hoá h c c a (-)-HCA
S khám phá (-)-HCA: Kurian và Pandiya (1931);
Screenivasan và Venkataraman (1959) nh m l n cho r ng acid trong
qu G. cambogia là tartaric acid và citric acid. Lewis và c ng s
(1964) ñã xác ñ nh chính xác acid trong qu G. cambogia là di-
hydroxy tri-cacboxylic acid hay hydroxycitric acid.
- 6
COOH COOH
HO C H H C OH
HO C COOH HOOC C OH
H C COOH H C COOH
H H
(-)-hydroxycitric acid (I) (+)-hydroxycitric acid (II)
COOH COOH
HO C H H C OH
HOOC C OH HO C COOH
H C COOH H C COOH
H H
(+)-allo-hydroxycitric acid (III) (-)-allo-hydroxycitric acid (IV)
Hình 1.8. C u trúc ñ ng phân c a hydroxycitric acid
Chi t tách: Lewis và Neelakantan (1965) ñã chi t tách (-)-HCA
t v qu G. cambogia khô s d ng phương pháp chưng ninh trong
n i áp su t (10 psi (lb/in.2) trong th i gian 15 phút v i dung môi
nư c. Moffett và c ng s (1996) phát tri n chi t tách (-)-HCA b ng
nư c, d ch chi t cho qua c t trao ñ i anion ñ h p th (-)- HCA, và
nó ñư c r a v i natri/kali hiñroxit ñ thu (-)-HCA. Bhabani S. Jena
và c ng s (2002) ñã ti n hành chi t acid trong v qu G. cowa b ng
phương pháp chi t soxhlet v i dung môi axeton ho c metanol.
Nh n xét: Các phương pháp chi t tách ñư c công b trên
nguyên t c và r t chung, chưa có nghiên c u chi ti t quá trình chi t
tách theo th i gian, t l dung môi (R/L), ho c các ñi u ki n chi t
tách khác. V phương pháp chi t tách dùng hai phương pháp chính
g m: Phương pháp chi t chưng ninh trong n i áp su t v i dung môi
nư c và phương pháp chi t soxhlet v i dung môi h u cơ là axeton,
metanol.
Hoá h c l p th : HCA có 02 trung tâm b t ñ i; vì v y, có th
t n t i 02 c p ñ ng phân l p th ho c 04 ñ ng phân khác nhau (Hình
1.8). Martius và Maue ñã t ng h p thành công 04 ñ ng phân l p th
c a hydroxycitrate. Glusker và c ng s ñã báo cáo c u trúc và c u
hình chính xác c a canxi hydroxycitrate và (-)-HCA lacton b ng
- 7
ch p X-quang tinh th . Stallings và c ng s báo cáo c u trúc tinh th
mu i etylen di amin c p ñ ng phân l p th hydroxycitrate.
Tính ch t c a (-)-HCA và lacton: Đương lư ng c a lacton s ch
là 69, xác ñ nh b ng chu n ñ ki m ho c phân tích b ng mu i b c.
C u trúc c a (-)-HCA lacton ñã ñư c ch ng minh b ng ph IR và
1
H-NMR. (-)- HCA lacton th hi n rõ d i sóng ph IR t i 3200,
1760, và 1680 cm-1. Quang ph 1
H-NMR c a (-)-HCA lacton cho
th y 02 proton t i γ-cacbon, nó cho AB quartet t i δ 2,53 và δ 2,74
v i J = 17,1Hz, và 01 proton t i α-cacbon cho th y m t singlet t i δ
5,15.
Đ nh lư ng (-)-HCA: Lowenstein và Brunengraber (1981) ñã
xác ñ nh lư ng hydroxycitrate ch a trong qu G. cambogia b ng
phương pháp s t ký khí. Jayaprakasha và Sakariah (1998, 2000,
2002) ñã phát tri n HPLC ñ xác ñ nh acid h u cơ trong qu c a G.
cambogia, m u chi t thương m i c a G. cambogia, và lá, v qu c a
G. indica.
1.2.1.3. Các mu i kim lo i c a (-)-HCA
1.2.1.3.1. Các lo i mu i kim lo i c a (-)-HCA
Ibnusaud và c ng s ñã t o mu i natri hydroxycitrate b ng cách
cho d ch chi t v qu G. cambogia tác d ng v i NaOH 800C.
Singh và c ng s ñi u ch mu i canxi c a (-)-HCA. Ganga Raju ñã
ñi u ch mu i canxi và kali c a (-)-HCA hay mu i hai kim lo i natri
c a (-)-HCA và hi u qu c a nó như là nh ng ch t b sung ăn kiêng
và nh ng s n ph m th c ăn ñ gi m cân n ng.
1.2.1.3.2. Nghiên c u t o mu i kali hydroxycitrate
Majeed và c ng s ch ra m t cách th c m i ñ ñi u ch mu i
HCK b n v ng và có ho t tính sinh h c.
1.2.1.3.4. Nghiên c u t o mu i canxi hydroxycitrate
- 8
Bhaskaran và Mehta ñã công b phương pháp hình thành mu i
canxi và kali c a HCA và h n h p c a chúng.
1.2.1.3.5. M t s nghiên c u t o mu i kim lo i c a (-)-HCA khác
Balasubramanyam và c ng s ñưa ra phương pháp t o thành c p
mu i kim lo i hòa tan nhóm IA và IIA c a (-)-HCA. Gokaraju và
c ng s công b d ng mu i hai kim lo i c a (-)-HCA v i các kim
lo i nhóm II. Gokaraju và c ng s cũng công b công th c c a mu i
ba kim lo i c a (-)-HCA. Samuel và c ng s ñã nghiên c u các mu i
ph c t p ba, b n và năm kim lo i c a (-)-HCA, thành ph n c u t o
và nh ng phương pháp t ng h p chúng, v i các mu i ch a ít nh t 3
kim lo i khác nhau ñư c l a ch n t k m, magie, natri, kali và canxi.
Nh n xét: Các tài li u chuy n hoá ñã công b ñưa ra quy trình
r t chung (quy trình nguyên t t) mà chưa ñưa ra các ñi u ki n ph n
ng m t cách chi ti t.
1.2.1.4. Hoá sinh c a (-)-HCA
S c ch c a enzyme chia tách mu i citrate b i (-)-HCA.
Enzyme chia tách citrate, là ATP citrate lyase (ATP citrate
oxaloaxetat lyase), xúc tác vi c chia tách ngo i ty th c a citrate
thành oxaloaxetat và axetyl-CoA. Watson và c ng s ñã tìm th y s
c ch m nh m c a ATP citrate oxaloaxetat lyase b i (-)-HCA là
enzyme tinh ch t gan chu t. Cheema – Dhadli tìm th y s ch c a
enzyme này c (-)-HCA t do (Ki = 8 µM) và lacton c a (-)-HCA
(Ki = 50 – 100 µM). Sullivan và c ng s và Stallings và các c ng s
ñã quan sát th y trong 4 ñ ng phân c a HCA thì (-)-HCA là ch t gây
c ch ti m năng duy nh t c a ATP citrate lyase.
1.2.1.5. Tác d ng c a (-)-HCA và mu i kim lo i c a nó
Clouatre và c ng s kh ng ñ nh các mu i Ca, Mg, K ho c Na
c a (-)-HCA có hi u qu trong vi c tăng s chuy n hóa glucose
- 9
trong cơ th , gi m n ng ñ ñư ng cao trong máu c a b nh nhân b nh
ti u ñư ng. Gokaraju và c ng s mô t vi c s d ng mu i canxi,
k m c a (-)-HCA như là ngu n b sung dinh dư ng ăn u ng.
Shrivastava và c ng s mô t dư c tính c a mu i Mg c a (-)-HCA
trong ñi u tr b nh.
Nh n xét: Trên ñây có nhi u công trình công b , nhưng chưa có
công trình nào công b m t cách chi ti t v các tác d ng c a các d n
xu t c a HCA trên ñ ng v t. Và cũng chưa có công trình nào nghiên
c u ng d ng tr c ti p HCA trong t nhiên mà không c n ph i
chuy n hoá.
1.2.2. K t qu nghiên c u trong nư c
nư c ta có m t s công trình nghiên c u v chi t tách xanthon
và các d n xu t phenol t m t s loài b a: b a Delpy; v cây b a
c ng (Garcinia pedunculata); b a núi; v b a Lanessan, Nguy n
Đình Hi p ñã nghiên c u Benzophenon có kh năng c ch các t
bào ung thư t v trái b a nam (Garcinia cochinchinense). Năm
2004, Đ Th Tuyên và các c ng s ñã nghiên c u nh hư ng c a
cao chi t t qu b a (Garcinia cambogia) lên các enzyme ch ng oxy
hoá gan chu t b nhi m ñ c CCl4 mãn tính. Tuy nhiên, chưa có
công trình nào nghiên c u các acid h u cơ t cây b a cũng như ng
d ng c a nó.
1.2.3. Nh n xét chung
Trên th gi i vi c nghiên c u cây b a ñã ñư c chú tr ng t lâu,
tính ñ n nay ñã có hàng trăm công trình nghiên c u v cây b a bao
g m các lĩnh v c chi t tách, xác ñ nh thành ph n hoá h c các h p
ch t h u cơ, ng d ng trong công ngh th c ph m, công ngh dư c
ph m, ñ c bi t là các lo i ch ph m gi m béo. Tuy nhiên, chưa có
công trình nào công b v nghiên c u chuy n hoá HCA m t cách chi
- 10
ti t.
Cho ñ n nay nư c ta chưa có m t nghiên c u nào mang tính cơ
b n v thành ph n, tính ch t, kh năng chuy n hoá và ng d ng,
công ngh khai thác v các h p ch t hoá h c có trong cây b a. Đây
là nh ng v n ñ r t ñáng ñư c quan tâm nghiên c u nh m góp ph n
quy ho ch, khai thác, ch bi n và ng d ng các s n ph m c a cây
b a m t cách có hi u qu , khoa h c hơn.
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LI U
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U
2.1. NGUYÊN LI U
Lá, qu B a ñư c hái t xã Hoà Liên – h. Hoà Vang – TP. ĐN.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U
2.2.1. Phương pháp v t lý
Nguyên li u ñư c ki m tra ñ m, hàm lư ng tro b ng phương
pháp tr ng lư ng.
Các ch ph m HCCa, HCK sau chuy n hoá ñư c ki m tra b ng:
ph h ng ngo i (IR); s c ký l ng cao áp; quang ph h p th nguyên
t ; c ng hư ng t h t nhân; ño ñ quay c c; ph kh i lư ng.
2.2.2. Phương pháp hoá lý
S d ng 03 phương pháp chi t tách ñ chi t tách HCA t lá, v
qu b a g m: chi t chưng ninh trong n i áp su t; chi t soxlet và
chi t b ng năng lư ng vi sóng. T ng lư ng acid trong d ch chi t
ñư c xác ñ nh b ng phương pháp chu n ñ . Dùng phương pháp
chuy n hoá ñ t o mu i kali và canxi c a (-)-HCA chi t tách t lá,
v qu b a.
- 11
2.2.3. Phương pháp sinh h c
Các ch ph m HCCa, HCK sau chuy n hoá ñư c ñánh giá kh
năng ch ng béo phì b ng phương pháp th tác d ng dư c lý c a ch
ph m trên chu t và ñư c ki m tra vi sinh v t b ng phương pháp phân
tích vi sinh v t.
CHƯƠNG 3 - K T QU VÀ TH O LU N
3.1. KH O SÁT NGUYÊN LI U B A
3.1.1. Đ nh danh cây b a vùng nguyên li u
K t qu ñ nh danh cây b a t i x.Hoà Liên-h.Hoà Vang-TP. ĐN:
Tên khoa h c: Garcinia oblongifolia Champ. Ex Benth. Tên latin
khác: G. bonii Pitard. H : Clusiaceae (Guttiferae) - B a.
3.1.2. X lý nguyên li u
Nguyên li u g m lá, qu b a ñư c thu hái t i x.Hoà Liên-h.Hoà
Vang-TP. ĐN ñư c r a s ch, lo i b lá, qu hư h ng ñ chu n b cho
các thí nghi m.
3.1.3. Xác ñ nh ñ m, hàm lư ng tro và kim lo i có trong
nguyên li u lá, v qu b a
3.1.3.1. Xác ñ nh ñ m
Đ m trong lá b a tươi trung bình là 70,90 %. Đ m trong v
qu b a trung bình là 84,34 %.
3.1.3.2. Xác ñ nh hàm lư ng tro
Hàm lư ng tro trong lá b a s y khô trung bình là 3,44 %. Hàm
lư ng tro trong v qu b a khô trung bình là 1,42 %.
3.1.3.3. Xác ñ nh thành ph n kim lo i n ng
K t qu phân tích thành ph n kim lo i n ng trong lá, v qu b a
cho th y các ch tiêu kim lo i n ng ñ t tiêu chu n v sinh ñ i v i
lương th c và th c ph m c a Vi t Nam và th gi i.
- 12
3.1.4. Kh o sát s ph thu c c a t ng lư ng acid, HCA, CA thu
ñư c theo ñ tu i qu b a
K t qu kh o sát t ng lư ng acid, HCA, citric acid trong 06
m u v qu b a theo ñ tu i t xanh non ñ n chín (03 – 09 tu n
tu i).
- Trong các m u ñã phân lo i t non ñ n già, m u qu b a ñ t 8
tu n tu i (qu chín) có t ng lư ng acid l n nh t (17,159%).
- Lư ng HCA thu ñư c trong 6 m u tăng d n theo ñ tu i, trong
ñó thu ñư c nhi u nh t 8 tu n tu i (15,22%). Lư ng citric acid thu
ñư c trong 6 m u tăng d n r i gi m, trong ñó thu ñư c nhi u nh t
5 tu n tu i (0,74%).
- T k t qu kh o sát cho th y t ng lư ng acid tăng t l thu n
theo th i gian, lư ng citric acid trong v qu b a tu n th 3 ñ n tu n
th 5 thì tăng sau ñó tu n th 6, 7, 8 thì gi m, còn lư ng HCA thì
tăng theo th i gian như t ng lư ng acid.
- T k t qu kh o sát trên, có th kh ng ñ nh th i ñi m thu
ho ch qu b a ñ làm nguyên li u t t nh t là lúc b a chín (8 tu n
tu i).
3.1.5. K t lu n 1
1. Tên khoa h c c a cây b a t i xã Hòa Liên, huy n Hòa Vang,
TP. Đà N ng là Garcinia oblongifolia Champ. Ex Benth. thu c h
Clusiaceae (Guttiferae) - B a.
2. Th i ñi m thu ho ch v qu b a ñ thu nh n lư ng acid h u
cơ nói chung và HCA nói riêng l n nh t là lúc b a chín, kho ng 8
tu n tu i.
3. Hàm lư ng các kim lo i n ng trong lá và v qu b a vùng
nguyên li u th p, ñ m b o tiêu chu n s d ng làm th c ph m.
3.2. NGHIÊN C U XÁC Đ NH ACID H U CƠ T LÁ, V QU B A
- 13
3.2.1. Sơ ñ quy trình chi t tách acid h u cơ t lá, v qu b a
3.2.2. Xác ñ nh t ng lư ng acid h u cơ b ng phương pháp chu n
ñ acid-bazơ
- T ng acid trong m u v qu b a khô chi t trong nư c là cao
nh t (18,59%), acid tan t t nh t trong nư c, k ñ n là axeton
(13,73%), metanol (10,49%). So sánh v i k t qu c a các loài ñã
nghiên c u như Garcina cambogia (17-19,2%), Garcina india
(12,48-15,1%), Garcina cowa (27,1%), k t qu chi t trong nư c c a
v qu b a khô Vi t Nam cho k t qu trung bình.
- T ng lư ng acid trong m u lá tươi chi t b ng nư c là 3,54%.
So sánh v i k t qu c a các loài b a ñã nghiên c u như Garcina
india (5,88-6,99%), Garcina cowa (4,457%), k t qu chi t trong
nư c c a lá b a tươi cho k t qu th p.
- V y, t ng lư ng acid chi t ñư c t v qu b a Vi t Nam b ng
năng lư ng vi sóng cho cao nh t, ti p theo b ng n i áp su t, chi t
soxhlet và cu i cùng là ngâm chi t.
3.2.3. Nghiên c u ñi u ki n s c kí và cách ti n hành xác ñ nh
HCA b ng máy s c kí l ng cao áp (HPLC)
3.2.3.1. K t qu xây d ng ñư ng chu n
Đư ng chu n ñư c xác ñ nh b ng cách thay ñ i n ng ñ c a 05
m u chu n, v i n ng ñ t 10 ñ n 320 ppm và phương trình ñư ng
chu n xác ñ nh ñư c: C = 1,37A – 6,88 v i A: di n tích pic c a
HCA, C: n ng ñ HCA, R2 = 0,9997.
3.2.3.2. K t qu xác ñ nh HCA trong d ch chi t v qu b a
Chi t b ng dung môi nư c cho lư ng HCA là l n nh t, ti p ñ n
là axeton và metanol. Giá tr thu ñư c ch y u c a phương pháp
HPLC ñư c tính ñ n ch là HCA, b i vì giá tr thu ñư c t di n tích
pic c a HCA l n nh t. So sánh v i các k t qu c a các tác gi nư c
- 14
ngoài thì hàm lư ng HCA trong v qu b a là khá cao (15,170-
15,270%), Garcina cambogia (16-18%), Garcina india (10,27-
12,74%), Garcina cowa (10,209-12,695%). K t qu trong lá b a tươi
lư ng HCA cho k t qu trung bình (2,853-2,878%) so v i k t qu
c a Garcina india (4,10-4,64%), Garcina cowa (1,672%) và không
tìm th y lư ng citric acid.
Đi u ki n s c ký ñ xác ñ nh HCA trên máy HPLC Merck
Hitachi D7000: c t s c ký Lichrospher RP18 5µm x 4,6 mm x 250
mm; ñetectơ D7240 Autosampler D7200, pha ñ ng là dung d ch acid
photphoric 0,1 % v i t c ñ dòng 1,0 ml/phút. Acid ch y u ñư c
tìm th y trong lá, v qu b a b ng HPLC là HCA, ñư c th hi n trên
s c ký ñ t i ph l c. Trên s c ký ñ , HCA cho pic ñơn trong t t c
các m u chi t. Xác ñ nh pic HCA d a vào pic c a acid HCA chu n
xu t hi n th i gian lưu là 3,802 phút. Th i gian lưu c a HCA ñư c
tìm th y trong t t c các m u là 3,8 ± 0,14 phút.
3.2.4. K t lu n 2
T nh ng k t qu nghiên c u trên có th nh n xét sau:
1. Đã xác ñ nh ñư c t ng lư ng acid h u cơ và các acid h u cơ
riêng bi t trong d ch chi t lá, v qu b a. HCA là acid h u cơ ch
y u ñư c tìm th y trong d ch chi t trong lá, v qu b a. Lư ng HCA
xác ñ nh ñư c t v qu b a Vi t Nam là khá cao (15,17-15,27%),
cao hơn 02 loài b a c a n Đ là G. indica và G. cowa.
2. Thay ñ i các dung môi và các phương pháp chi t khác nhau,
dung môi nư c cho lư ng HCA là cao nh t (15,28%), k ti p là
axeton (12,99%), metanol (9,50%). Phương pháp chi t b ng năng
lư ng vi sóng v i dung môi nư c cho lư ng HCA cao nh t
(15,28%).
- 15
3.3. NGHÊN C U CÁC Y U T NH HƯ NG QUY TRÌNH
CHI T ACID H U CƠ T LÁ, V QU B A
3.3.1. Chi t tách b ng năng lư ng vi sóng
K t qu kh o sát quá trình chi t tách theo th i gian, c p ñ máy
và t l r n l ng cho th y: th i gian chi t xu t hi u qu nh t là 25
phút; c p ñ máy thích h p là c p 2 (400W); t l r n l ng thích h p
là kho ng 10 g ch t r n trên 150 ml dung môi. T ng lư ng acid và (-
)- HCA chi t ñư c cao nh t trong ñi u ki n trên l n lư t là 18,59%
và 15,28%.
3.3.2. Chi t tách b ng b chi t soxhlet v i dung môi axeton và metanol
Chi t trong dung môi axeton cho k t qu t t hơn chi t trong
dung môi metanol. Khi tăng th i gian chi t thì t ng lư ng acid tăng
lên và v i th i gian chi t ñ t 8 gi cho k t qu cao nh t, n u ti p t c
tăng th i gian chi t thì lư ng acid tăng không ñáng k , ho c không
tăng. T ng lư ng acid thu ñư c khi s d ng dung môi axeton
(13,71%), dung môi metanol (10,40%), v i th i gian chi t là 8 gi .
3.3.3. Chi t tách b ng n i áp su t v i dung môi nư c
3.3.3.1. K t qu chi t xu t acid trong lá b a:
V i phương pháp chưng ninh lá b a tươi trong n i áp su t b ng
dung môi nư c cho k t qu t t khi th i gian chi t là 1 gi và th tích
dung môi chi t là 150 ml, t ng lư ng acid thu ñư c (2,258%).
3.3.3.2. K t qu chi t xu t acid trong v qu b a khô:
V i phương pháp chưng ninh trong n i áp su t ñi u ki n
0
0,15MPa và nhi t ñ 127 C, th i gian chi t t i ưu là 90 phút và t l
r n/l ng t i ưu là 10g/200ml nư c, t ng lư ng acid (17,16%).
3.3.4. K t lu n 3
1. Kh o sát 03 phương pháp chi t tách, k t qu phương pháp
chi t s d ng năng lư ng vi sóng v i th i gian chi t ng n (25 phút)
- 16
nhưng cho k t qu HCA cao nh t (15,28%). Do th i gian chi t ng n
nên phương pháp này ti t ki m năng lư ng, ñây là ưu ñi m n i b t
c a phương pháp m i này so v i các phương pháp mà các tác gi
nư c ngoài ñã công b .
2. Đi u ki n t i ưu ñ chi t HCA l n nh t b ng năng lư ng vi
sóng là: th i gian chi t 25 phút, t l r n l ng 150ml nư c/10gam v
qu b a khô, công su t lò vi sóng 400W. T ng lư ng acid h u cơ
chi t ñư c là 18,59%, HCA là 15,28%.
3. Trong phương pháp chi t b ng chưng ninh trong n i áp su t
các y u t v th i gian chi t, t l r n l ng ñ u nh hư ng ñ n hi u
su t chi t t ng lư ng acid.
4. V i th i gian chi t là 8 gi , chi t v i dung môi metanol lư ng
acid chi t ñư c 10,49%, chi t v i dung môi axeton lư ng acid chi t
ñư c 13,71%.
3.4. NGHIÊN C U QUY TRÌNH CHUY N HOÁ T O MU I
C A HCA
3.4.1. T o mu i kali c a HCA
3.4.1.1. Kh o sát nh hư ng c a lư ng KOH 40% ñ n quá trình
chuy n hoá t o mu i kali c a HCA
Đi u ki n chuy n hóa t o mu i kali cho s n ph m có th s y khô
là s d ng 7,0–10,0ml KOH ñ m ñ c (40%)/d ch chi t 100g v qu
b a, hàm lư ng HCK trong mu i ñi u ch xác ñ nh b ng HPLC là
77,021%.
3.4.1.2. Tinh ch mu i HCK
R a tinh ch mu i HCK thô b ng cách: tăng t l c n t 60% ÷
100% và nư c gi m 40% ÷ 0%. Hàm lư ng HCK trong mu i sau
tinh ch xác ñ nh b ng HPLC là 99,221% (các k t qu ki m tra ch t
lư ng, c u trúc HCK sau tinh ch th hi n m c 3.5).
- 17
3.4.1.3. Hi u su t t o mu i HCK
Kh i lư ng mu i HCK d ng r n tinh th t o thành trung bình là
13,523g/100g m u, hi u su t t o mu i 85,06 – 87,02%.
3.4.2. T o mu i canxi c a HCA
3.4.2.1. Kh o sát nh hư ng c a pH ñ n quá trình chuy n hoá t o
mu i canxi c a HCA
D ch chi t sau khi làm s ch ñư c trung hoà acid b ng cách cho
thêm dung d ch CaCl2. Dung d ch thu ñư c khu y tr n kho ng 30–120
phút. Khi thêm CaCl2 vào, lúc ñ u xu t hi n ít k t t a tr ng, sau xu t
hi n ngày càng dày ñ c t o thành bùn, pH c a h n h p bùn thích h p t
9,5 ñ n 11. S d ng dung d ch NaOH ñ ch nh ñ pH. Ph n k t t a
không tan là mu i HCCa, ph n mu i này ñư c s y khô trong t s y
trong th i gian 24 gi , mu i HCCa có màu tr ng xám.
3.4.2.2. Hi u su t t o mu i
Kh i lư ng mu i HCCa d ng r n t o thành trung bình là
11,207 g/100g m u, hi u su t t o mu i 83,97 – 88,83%.
3.4.3. K t lu n 3
1. Đã xác ñ nh ñư c ñi u ki n và quy trình t o mu i HCK,
HCCa. Đi u ki n thích h p t o mu i HCK là 7,0 – 10,0ml KOH ñ m
ñ c (40%)/ d ch chi t t 100g v qu b a khô và ñi u ki n thích h p
t o mu i HCCa là pH t 9,5-11, pH ñư c ñi u ch nh b i dung d ch
NaOH 10%.
2. H dung môi thích h p ñ tinh ch mu i HCK là h n h p
c n/nư c, n ng ñ c n tăng t 60% ñ n c n tuy t ñ i.
3. Kh i lư ng mu i HCK d ng r n tinh th t o thành n ñ nh
trung bình là 13,523g/100g m u, hi u su t t o mu i 85,06 – 87,02%.
Kh i lư ng mu i HCCa d ng r n t o thành n ñ nh trung bình là
- 18
11,207 g/100g m u, hi u su t t o mu i 83,97 – 88,83%.
3.5. KI M TRA C U TRÚC, Đ TINH KHI T, HÀM LƯƠNG
KIM LO I N NG VÀ VI SINH V T C A CH PH M MU I
HCCa, HCK
3.5.1. Ki m tra s n ph m mu i HCK, HCCa b ng HPLC
1. Mu i HCK
a b
Hình 3.18. S c kí ñ HPLC c a s n ph m mu i HCK trư c (a) và sau tinh ch (b)
K t qu ch y HPLC c a mu i HCK t o thành ta thu ñư c 04 pic
v i th i gian lưu khác nhau (hình 3.18a), pic có th i gian lưu g n v i
th i gian lưu c a HCA chu n cư ng ñ l n nh t, xu t hi n pic có
th i gian lưu là 3,70 phút g n v i th i gian lưu c a HCA chu n là
3,77 phút và có di n tích l n nh t chi m 77,021%. Tuy nhiên, mu i
HCK này còn l n nhi u t p ch t th hi n 03 pic còn l i ng v i
th i gian lưu là 2,25; 2,82 và 7,11. Ta ti n hành tinh ch mu i HCK
b ng cách r a v i h n h p c n nư c v i các t l khác nhau. K t qu
các t p ch t gi m, pic có th i gian lưu 7,11 bi n m t ch còn 02 pic
t p ch t có di n tích r t nh là pic có th i gian lưu 2,33 và 2,82 (hình
3.18b). Pic th hi n HCK có di n tích tăng và ñ t ñ tinh khi t
99,221%. Hàm lư ng mu i HCK t o ñư c có ñ tinh khi t cao so
v i k t qu công b c a Majeed và các c ng s (92,840%), th i gian
lưu trùng kh p nhau (3,722phút).
2. Mu i HCCa
- 19
K t qu ch y HPLC c a mu i HCCa t o thành ta thu ñư c 03
pic v i th i gian lưu khác nhau (hình 3.19a), pic có th i gian lưu g n
v i th i gian lưu c a HCA chu n (xu t hi n pic có th i gian lưu là
3,73 phút g n v i th i gian lưu c a HCA chu n là 3,77 phút) cư ng
ñ l n nh t và có di n tích l n nh t chi m 51,187%. Tuy nhiên, mu i
HCCa này còn l n nhi u t p ch t th hi n 02 pic còn l i ng v i
th i gian lưu là 2,23 và 2,78. Ta ti n hành tinh ch mu i HCCa b ng
cách r a nhi u l n v i nư c c t. K t qu các t p ch t gi m, các pic
t p ch t có di n tích r t nh là pic có th i gian lưu 2,19 và 2,79 (hình
3.19b). Pic th hi n HCCa có di n tích tăng và ñ t ñ tinh khi t
97,077%.
a b
Hình 3.19. S c kí ñ HPLC c a s n ph m mu i HCCa trư c (a) và sau tinh ch (b)
3.5.2. Ki m tra s n ph m mu i HCK, HCCa b ng ph IR
K t qu ki m tra ph IR c a mu i HCK, HCCa và HCCa chu n
v hình dáng tương t nhau (ph IR c a mu i HCCa và HCCa chu n
ñ trùng l p 98,69%). Như v y, có th sơ b k t lu n nh ng mu i
ñư c t o thành có c u trúc tương t v i HCCa chu n.
B ng 3.25: K t qu ch p ph IR c a mu i HCK, HCCa
Mu i HCCa
Pic ñ c trưng Mu i HCK Mu i HCCa
chu n
Ph dao ñ ng nhóm -OH 3400,11 cm-1 3376,22 cm-1 3310 cm-1
Ph dao ñ ng nhóm -C=O 1599,04 cm-1 1592,53 cm-1 1582 cm-1
- 20
3.5.4. Ki m tra c u trúc mu i HCCa, HCK b ng ph c ng hư ng
t h t nhân 1
COO Ca
1'
OOC
1. Mu i HCCa HO C H HO
2
C
4
H
2'
4'
3 3'
13 HO C COO HO C COO
Ph C-NMR c a mu i HCCa Ca 5 6
Ca
5' 6'
Ha C COO Ha C COO
chu n và HCCa ñi u ch ñư c th hi n Hb Hb
13 Hình 3.20. C u trúc mu i HCCa
hình 3.21a, 3.21b. Ph C-NMR c a
HCCa chu n hình 3.22a trên có 03 pic t i 39,920; 74,925; 77,716
k t qu tương ng c a methylene cacbon (C-5, 5’), methine cacbon
(C-1, 1’) và cacbon b c 4 (C-3, 3’). Các pic t i 162,862; 163,158;
174,158 là c a cacbonyl cacbon (C-2, 2’; C-4, 4’ và C-6, 6’) c a 03
nhóm cacboxylat trong mu i HCCa chu n. Đ i v i ph 13C-NMR
c a HCCa ñi u ch hình 3.21b trên có các pic tương t ph 13C-
NMR c a HCCa chu n, c th có 03 pic t i 39,921; 75,048; 77,607
k t qu tương ng c a methylene cacbon (C-5, 5’), methine cacbon
(C-1, 1’) và cacbon b c 4 (C-3, 3’). ph 13C-NMR c a HCCa ñi u
ch ch xu t hi n 01 pic t i 162,527 là c a cacbonyl cacbon (C-2, 2’;
C-4, 4’ và C-6, 6’). Đi u này có th gi i thích do ñ phân gi i c a
máy và n ng ñ c a HCCa ñi u ch cao nên các pic 163,158 b trùng
v i pic 162,527; và pic 174,158 có vùng nhô lên nhưng máy không
báo k t qu .
a bb
13
Hình 3.21. Ph C-NMR c a mu i HCCa
1
Ph H-NMR c a mu i HCCa chu n và HCCa ñi u ch ñư c th
1
hi n hình 3.22a, 3.22b. Tín hi u ph H-NMR c a proton methylen
(Ha-5, 5’ và Hb-5, 5’) xu t hi n 2,95 và 3,02. Pic singlet t i 4,3 th hi n
1
proton c a nhóm methine (H-1 và H-1’). Ph H-NMR c a HCCa ñi u ch
nguon tai.lieu . vn