Xem mẫu
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
Chuyên đề 3. Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro
---------- o 0 o ----------
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng
nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một
lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Bao gồm:
+ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành
+ Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
+ Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành
+ Nuôi cấy mô sẹo (callus)
+ Nuôi cấy tế bào đơn
+ Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi
đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần
Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm
nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm
(in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống
nghiệm (in vivo).
Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc
ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có
thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các
phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp này
không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là
hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâ m sản xuất giống cây trồng hàng nă m đã cung
cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa,
khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp.
*Cơ sở khoa học
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô
tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phản
phân hoá.
- Tính toàn năng của tế bào:
Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một
cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn
chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã chuyên hoá đều chứa
một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền
của một cơ thể trưởng thành. Vì vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều
1
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn
năng của tế bào. Qua đó người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô)
thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có
đầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phản
phân hoá.
- Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào
+ Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế
bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau. Trong cơ thể thực
vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu,
mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã
trải qua giai đoạn phân hoá tế bào để hình thành các mô riêng biệt.
+ Tính phản phân hoá của tế bào: dó là các tế bào khi đã được phân hoá thành
các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định
chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào.
Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân…thì giai đoạn tạo
mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia
liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân… trước đó.
Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã chuyên hoá được
biểu diễn theo sơ đồ sau:
Phân hoá tế bào
Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá
Phản phân hoá tế bào
Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một
thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và
một số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mã
hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế
bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất
định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các
gen để hình thành một các thể mới. Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào.
*Các ứng dụng
Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to
lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc sử
dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế
bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn. Mô
nuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn.
Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có
được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối
2
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rất
cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.
Ứng dụng:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn tạo
giống.
- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của các loại
cây trống khác nhau.
+ Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt
+ Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây
rau, cây hoa các loại cây trồng khác.
+ Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus
+ Bảo quản các tạp đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiếm bệnh trong
điều kiện tự nhiên, hoặccác cây dễ bị giao phấn.
Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền,
cúc…), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà
phê…), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa
sợi…) đã được phổ biến nhanh vào trong sản xuất.
*Các bước trong nhân giống in vitro
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho
nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai
đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp
với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm
tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.
Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu
Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các
yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.
Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào
mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần chọn
đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh
chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.
Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro
Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975)
Khoai tây: mầm (Morel, 1952)
Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976)
Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975)
Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978)
Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng
để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương pháp khử
trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được
3
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl 0.1% xử lý trong 5-10 phút,
NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br…
Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:
Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962)
Chất hữu cơ: đường sarcaroza
Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit
Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin
(GA3)
Bước 3: nhân nhanh
Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh s ố
lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con
đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.
Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung
chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi.
Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là
phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao
nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh
sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân hoá
chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ
nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân
phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối…
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn nhưng
chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi trường
nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường
nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là
thành một cây hoàn chỉnh. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển
từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết
sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có
chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi
phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng
tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ,
chiều cao cây…)
- Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghi
với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều
kiênj tự nhiên, mở nắp bình nuôi…
4
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat nước. Phải
chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sánh của vườn ươm cũng như có chế độ
dinh dưỡng thích hợp.
* Các phương pháp nhân giống in vitro
Tất cả các phương pháp nhân giống in vitro đều có các ưu, nhược điểm sau:
* Ưu điểm
- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng cây
giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm. Trong
khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải
sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20cm.
- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đựoc sẽ không bị
nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài
- Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây giống sạch
virus
- Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của
cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng… theo
ý muốn
- Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một thời gian
ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 36-1012/nă m, như vậy
không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn.
- Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnh
của thời vụ.
5
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
- Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong
thời gian dài ở điều kiện in vitro
* Nhược điểm
- Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra cí kích thước nhỏ và đôi
khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn
- Cây giống in vitro được cung cấp nguồn hydrat cacbon nhân tạo nên khả năng tự
tổng hợp các hợp chất hữu cơ của cây kém. Đồng thời cây giống in vitro được nuôi
dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên đọ ẩm không khí thường bão hoà.
Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bi mất cân bằng nước, gây hiện
tượng cây bị héo và chết. Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều
kiện in vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiện
bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh.
- Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao.
- Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống
+ Tính bất định về mặt di truyền
+ Sự nhiễm mẫu
+ Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy
+ Hiện tượng thuỷ tinh hoá
6
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
Chuyên đề 4:
Vì sao có thể nuôi cấy mô phân sinh (meristem) để tạo ra cây sạch virus?
Các bước và điều kiện cần thiết của một hệ thống sản xuất giống sạch bệnh?
------------- o 0 o -------------
* Tác hại của virus:
Trong thế giới các loài sinh vật thì thế giới của các loài vi sinh vật vô cùng đa dạng
và phức tạp mà đến nay vẫn còn rất nhiều loài mà con người vẫn chưa biết đến.
Người ta thường phân vi sinh vật thành 2 loại là vi sinh vật có tác dụng tốt cho con
người và vi sinh vật có hại cho con người. Trong thế giới vi sinh vật ấy thì virus là
một loại rất nguy hiểm. Đối với cả con người và các loài động thực vật khác khi đã
nhiễm bệnh virus thì không có một loại thuốc nào có thể chữa được, mà chỉ phụ
thuộc vào khả năng đề kháng của cơ thể. Vì vậy, để đề phòng và chống lại tác hại
của virus người ta đã tạo ra các loại vacxin và thuốc kháng sinh nhằm tăng cường
sức đề kháng cho cơ thể.
Phổ tác động của virus là rất lớn. Nó không những tác động đến con người, động
thực vật, thậm chí cả những loài vi sinh vật khác. Trong nông học, chúng ta quan
tâm chủ yếu đến thực vật vì đây là đối tượng chủ yếu trong sản xuất nông nghiệp.
Theo thống kê, có khoảng 600 loài virus trên thực vật mà con người đã biết đến,
trong đó có ít nhất 80 loại có thể truyền qua hạt giống. Bệnh virus hại thực vật là
một loại bệnh nguy hiểm, dễ la n truyền qua nhân giống vô tính (do tồn tại trong các
mô sống), qua mô giới truyền bệnh (các loại côn trùng như rệp, bọ phấn, nhện, v.v.),
qua tiếp xúc cơ giới (vết cắt, xây xát, v.v.).
Tác hại của virus là vô cùng lớn. Nó ảnh hưởng trực tiếp tới năng s uất và phẩm
chất của nông sản.
Côn trùng Biểu hiện một số bệnh virus
truyền bệnh
7
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
* Cơ sở lý luận của phương pháp:
Virus tồn tại ở mọi cơ thể sống. Theo White (1934), Limasset & Cornuet (1950),
Morel & Martin (1952): nồng độ virus ở mô phân sinh đỉnh rễ, đỉnh chồi và lá bao
thứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa với mô phân sinh ở phía d ưới.
Như vậy, có thể sử dụng mô phân sinh đỉnh để tạo ra cây sạch virus hoàn toàn từ cây
đã nhiễm bệnh.
Gần đây, vào năm 1987 bằng những nghiên cứu của mình, ông Meyer cho thấy
phương pháp nuôi cấy meristem để loại virus là hoàn toàn đúng đắn. Sự loại virus
phụ thuộc rất nhiều sự có mặt của một hay nhiều loại virus xâm nhiễm. Ví dụ có thể
sử dụng đỉnh sinh trưởng với kích thước 1-2mm để loại virus chủ yếu hại khoai tây
(trừ virus X đòi hỏi kích thước 0,2mm).
Theo nghiên cứu của Mathews (1970) & Wang et Hu (1980) thì hoàn toàn có cơ sở
khẳng định mô phân sinh đỉnh không có virus. Theo các ông có thể do các lý do sau:
- Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ mô dẫn, hệ thống này không có trong mô
phân sinh đỉnh.
- Trong sự phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các
thông tin di truyền của virus.
- Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng mô phân sinh đỉnh mạnh hơn các vùng khác
trong cây.
- Nồng độ auxin cao ở mô phân sinh đỉnh có thể ngăn cản quá trình sao chép
virus.
* Kỹ thuật làm sạch virus in vitro:
- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh: tách chính xác mô phân sinh đỉnh có kích thước
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
1,0mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở
kích thước 0,1-0,2mm.
Có thể xử lý nhiệt độ cao 35-370C một thời gian dài cho cây mẹ trước khi tách mô
phân sinh đỉnh (5-10 tuần). Hoặc có thể xử lý các mẫu sau khi đưa vào nuôi cấy in
vitro ở nhiệt độ 39-400C trong 1-2 tuần. Ở nhiệt độ này, thường các mARN của virus
sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao.
- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý hóa chất: Khi nuôi cấy mô phân sinh
đỉnh có kích thước 0,5-1,0mm có thể kết hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy các
chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh. Các chất kháng virus như 2-thiouracil,
ribavirin, vidarabin làm tăng kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản
của virus.
- Vi ghép: Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng bệnh
trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch virus. Kỹ thuật này thường sử dụng với
cây thân gỗ, đặc biệt họ cam chanh.
Một số ứng dụng kỹ thuật làm sạch virus:
Kỹ thuật tạo củ khoai tây bằng phương pháp in vitro: Một hiện trạng sản xuất
khoai tây là rất dễ bị nhiễm virus do quá trình nhân giống vô tính. Vì vậy cần tạo ra
các giống khoai tây sạch bệnh virus. Đó là lý do mà ngày nay khoai tây được nhân
giống bằng phương pháp in vitro khá phổ biến. Để nhân giống in vitro khoai tây cần
thực hiện các bước sau đây:
+ Bước 1: Chọn cây giống đủ tiêu chuẩn. Cây đủ tiêu chuẩn lấy mẫu cso chiều
cao 7-10cm, có từ 8-10 lá, cây phải sinh trưởng khỏe, thân mập. Thông thường nuôi
cấy 8-10 cây trong bình 250ml.
+ Bước 2: Rót môi trường tạo củ vào các bình 250ml đã chọn. Môi trường tạo củ
gồm MS và 12% saccarose. Lượng môi trường cho mỗi bình là 50-70ml.
+ Bước 3: Tiến hành nuôi cây giống trong điếu kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ
20-220C.
+ Bước 4: Sau 2 tháng cây đã hình thành củ. Lúc này tiến hành thu hoạch củ in
vitrro. Như vậy, đã tạo được củ sạch bệnh virus.
9
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
Cây sau khi nuôi cấy Cây khi hình thành củ
Nhân giống in vitro hoa đồng tiền: Các bước thực hiện như sau:
+ Bước 1: Khử trùng mẫu. Mẫu lấy là các nụ hoa bình thường. Nụ hoa được lấy
về sau đó khử trùng bằng HgCl 2 nồng độ 0,1% trong 7 phút.
+ Bước 2: Cắt nụ hoa thành các lát mỏng. Dùng các lát mỏng này để tạo thể tiền
chồi bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo (MS, 1ppmBA, 0,2ppm Ki,
0,2pp IAA).
+ Bước 3: Nhân nhanh chồi mầm. Tách thể tiền chồi và nuôi cấy trong môi
trường nhân tạo (MS, 1ppm Ki).
+ Bước 4: Tạo cây hoàn chỉnh. Sau nhân nhanh tách cây và nuôi trong môi
trường nhân tạo (MS, 0,1ppm α-NAA).
+ Bước 5: Sau tạo cây hoàn chỉnh thì đưa cây con ra vườn thích nghi. Cây con
được trồng trong giá thể (1 trấu hun + 1 mùn) và đảm bảo những điều kiện tốt nhất
cho cây con phát triển. Sau đó cây con được đưa ra vườn sản xuất. Tiến hành chăm
sóc bình thường.
10
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
Nụ hoa Tạo thể tiền chồi Nhân nhanh
Vườn ươm Cây giống Vườn sản xuất
* Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus: Sau khi đã nuôi cấy thành công cây
sạch bệnh thì việc nhân nhanh và duy trì nguồn giống sạch bệnh là vô cùng quan
trọng. Chính vì vậy, ở giai đoạn này việc chuẩn đoán bệnh virus tái nhiễm là không
việc không thể thiếu, để từ đó phát hiện ra các cá thể nhiễm bệnh và loại ra khỏi
nguồn giống. Có một số phương pháp chuẩn đoán bệnh virus như sau:
- Phương pháp chuẩn đoán bằng mắt (thông qua triệu chứng bệnh): Đây là
phương pháp đơn giản nhất cho phép có thể xác định bệnh virus thông qua biểu hiện
của cây trồng. Phương pháp này đòi hỏi phải có kinh nghiệm quan sát và so sánh do
có thể nhầm lẫn với một số loại bệnh không phải virus gây ra. Phương pháp này
cũng không thể cho phép xác định chính xác loại bệnh virus đang nhiễm.
11
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
- Phương pháp chuẩn đoán bằng cây chỉ thị: Vào những năm 1940, phương pháp
này được coi là phương pháp nhạy và chính xác nhất để xác định bệnh virus. Nhờ
phương pháp này đã xác định được 2 virus phổ biến là X và A (Leviel 1986).
Phương pháp này dựa trên những biểu hiện đặc trưng của cây chỉ thị khi nhiễm
bệnh. Người ta đã tìm ra khoảng 200 cây chỉ thị chủ yếu thuộc họ cà (Solanaceae),
họ rau dền (Amaranthaceae), họ rau muối (Chenopodaceae), họ đậu (Fabaceae), họ
cúc (Asteraceae), trong đó họ cà chiếm ưu thế. Tuy nhiên phương pháp này vẫn bộc
lộ một số nhược điểm như:
+ Thời gian chuẩn đoán kéo dài do phải qua một quá trình ủ bệnh mới xuất hiện
triệu chứng.
+ Việc xuất hiện các triệu chứng đặc trưng còn phụ thuộc vào điều kiện thí
nghiệm như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, v.v.
+ Phương pháp lây nhiễm cho cây chỉ thị khá phức tạp, có loại phải truyền qua
côn trùng truyền bệnh (các vecto truyền bệnh) rất phức tạp.
+ Tốn khá nhiều công để trồng trọt, chăm sóc cây chỉ thị, nuôi d ưỡng côn trùng
truyền bệnh. Cần có nhà nuôi cấy cách ly. Kinh phí đầu tư lớn.
+ Việc chuẩn đoán bệnh cuốn lá bằng phương pháp này khó tiến hành.
+ Phương pháp này chỉ sử dụng khi số lượng cá thể ít.
Ví dụ như bệnh hoa lá dưa leo (Cucumic Mosaic Virus) sử dụng cây chỉ thị là cây
Chenopodium quinoa.
- Phương pháp huyết thanh: Phương pháp này được đánh giá là nhanh và hiệu quả.
Có thể cho kết quả sau 48 giờ. Do đó chi phí cho xét nghiệm là ít. Muốn xem phản
ứng huyết thanh người ta trộng lẫn huyết thanh đặc hiệu cho mỗi loại virus với dịch
cây cần chuẩn đoán bệnh. Kết quả thu được kết tủa ở dạng bông hay dạng mây mờ
(phản ứng kháng nguyên + kháng thể). Phương pháp này đã có nhiều cải tiến như
làm sạch protein virus trước khi tiêm vào thỏ; tạo ra kháng thể đơn dòng có tính đặc
hiệu rất cao đã nâng cao chất lượng của huyết thanh.
- Phương pháp chuẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử: Kính hiển vi điện tử có độ
phóng đại từ một đến hàng chục vạn lần, có thẻ quan sát được các sợi, thể hạt của
virus. Tuy nhiên phương pháp này còn hạn chế do:
+ Chi phí cho thiết bị khá lớn.
+ Số lượng mẫu hạn chế, phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu khá phức tạp.
+ Không phát hiện được virus cầu do chúng khá giống cơ quan tử của tế bào.
- Phương pháp chuẩn đoán bằng test ELISA (enzym linked immunosorbent assay):
Test ELISA là một tiến bộ trong lĩnh vực chuẩn đoán bệnh virus hại cây trồng.
Phương pháp có độ đặc hiệu cao. Chính xác, nhậy, nhanh, dễ tiến hành nên nhanh
chóng trở thành phương pháp thông dụng.
Test ELISA được Enguall và Permann (1971;1972) đề cập đầu tiên trong lĩnh vực
nhân y. Từ năm 1986 nó được sử dụng như một test có độ nhạy rất cao để chuẩn
đoán virus ở thực vật (Clark, Adams và Barbara 1976). Với khả năng phát hiện
12
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
nhạy, mọi virus nhất là virus cuốn lá hại khoai tây (nồng độ thấp), phương pháp này
là tốt nhất, dễ sử dụng (Casper 1977).
Nguyên lý của phương pháp vẫn dựa vào phản ứng kháng nguyên và kháng thể,
nhưng kháng thể được liên kết với một enzym (enzym linked). Phức enzym – kháng
thể- kháng nguyên sẽ dễ nhận biết do một phản ứng màu nhờ hính sự có mặt của
emzym xúc tác. Phản ứng màu thường là sử dụng các phản ứng phân giải 4-
nitrophenolphosphat bởi photphataza. Khi tách phosphat, α-nitrophenol sẽ có màu
vàng. Mỗi enzym có thể xúc tác cho hàng ngàn phân tử cơ chất nên tín hiệu màu
được khuếch đại rất rõ. Phản ứng test được tiến hành khi gắn trên các mặt bản thử
plastic, nên có tên gọi là immunosorbent. Như vậy, trên bản thử lỗ nào có màu vàng,
nơi ấy có mặt phức kháng nguyên – kháng thể - enzym, tức là có virus. Cho đến nay
có thể nói test ELISA là công cụ chính trong việc chuẩn đoán bệnh virus. Bằng
phương pháp ELISA có thể chuẩn đoán chính xác cả mặt định tính và định lượng.
- Chuẩn đoán bằng kỹ thuật phân tích ADN:
Phương pháp này cho kết quả nhanh và chính xác. Phương pháp thông dụng gọi là
phương pháp PCR.
Nguyên lý chung của phương pháp là xác định trực tiếp sự có mặt của phần lõi axit
nucleic của virus. Phần lõi này có trình tự rất đặc hiệu tùy theo mỗi loại virus. Từ đó
mà có thể là phát hiện trực tiếp qua bảng phản ứng PCR. Sử dụng các cặp mồi là các
đoạn nucleotid (dài từ 10-30 nu) có trình tự bổ sung với hai đầu (phía 3’) của hai sợi
đoạn ADN cần nhân. Sau thời gian cho phản ứng trên máy PCR khoảng 3 giờ có thể
lấy mẫu và đánh giá kết quả. Nếu mẫu sạch virus tức là không có khuôn ADN của
virus thì cặp mồi không bắt cặp, quá trình nhân ADN không xảy ra. Còn ở mẫu
bệnh, sự nhân ADN diễn ra mạnh mẽ (sau 30 chu kỳ có thể nhân hàng trăn triệu
đoạn ADN). Có thể nhận biết ADN qua phương pháp điện di. Từ đây cso thể kết
luận mẫu có nhiễm bệnh hay không. Tuy nhiên, một số virus có cấu tạo phần axit
nucleic là ARN, trong trường hợp này cần phải chuyển ARN virus sang dạng ADN
(cADN) sau đó phát hiện ADN này bằng phương pháp PCR.
Phương pháp này được coi là vũ khí vô cùng lợi hại của con người. Phương pháp
này có thể phát hiện virus ở nồng độ rất thấp với độ chính xác rất cao. Chính vì vậy,
phương pháp này đã được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất các giống
sạch bệnh virrus hiện nay.
13
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
Chuyên đề 5:
Trình bày kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro và ứng dụng của chúng trong công
tác giống cây trồng?
------------- o 0 o -------------
* Khái niệm về cây đơn bội:
Các cây trồng khác nhau thường có mức bội thể khác nhau. Có thể là đơn bội (n),
lưỡng bội (2n), tứ bội (4n), v.v. Tuy nhiên phổ biến trong tự nhiên là lưỡng bội (2n)
và tứ bội (4n). Như vậy, với các loại cây trồng này kiểu hình thể hiện ra ngoài là sự
tác động tổng hợp của nhiều kiểu gen, phụ thuộc và tính trạng là lặn hay trội. Trong
công tác chọn giống người chú ý nhiều tới thể đơn bội (n), bởi lẽ cây trồng ở dạng
đơn bội thường rất khó tồn tại trong tự nhiên. Nó chỉ sống được trong điều kiện nhân
tạo của con người. Cây đơn bội mang bộ NST (n), vì vậy để cho nó sống được người
ta phải tiến hành đồng hợp tử tuyệt đối, tức là tạo ra alen hoàn toàn giống nhau.
Những biểu hiện của cây đơn bội (kiểu hình) thể hiện chính xác kiểu gen mà nó
đang có, kể cả các gen lặn. Đây sẽ là nguồn vật liệu di truyền vô cùng quý giá trong
công tác chọn giống.
* Các đường hướng tạo cây đơn bội:
Cơ thể thực vật trong tự nhiên chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào
đơn bội. Nếu như chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n).
Tuy nhiên trong tự nhiên rất hiếm gặp các cây đơn bội, vì vậy các nhà khoa học đã
tiến hành nghien cứu bằng các con đường khác nhau nhằm tạo ra cây đơn bội làm
nguồn vật liệu cho công tác chọn giống. Vào năm 1924, Blakeslee và cộng sự đã
chứng minh được rằng có thể thu được các dòng nhị bội thuần đồng hợp bằng cách
nhị bội hóa các thể đơn bội. Đến năm 1964, hai ông Guka & Maheshwari (Ấn Độ)
đã lần đầu tiên tạo thành công cây đơn bội bằng nuôi cây bao phấn cà độc dược.
Tiếp sau đó với các đóng góp của Nitsch và Noieel (1973-1976) đã càng khẳng định
việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy là hoàn toàn có thể thành công. Cho đến
nay, đã có khoảng 170 loài cây trồng được tạo ra bằng con đường đơn bội.
Việc tạo cây đơn bội có thể có nhiều hướng khác nhau:
- Tạo cây đơn bội (dòng thuần) bằng con đường tự phối. Đây là một hướng có thể
coi là thủ công và rất mất thời gian. Thường phải mất đến 5-7 thế hệ mới tạo được
dạng đồng hợp tử. Đây cũng là một phương pháp khó thực hiện và tốn kém.
- Tạo cây đơn bội bằng in vitro. Đây là phương pháp chiếm ưu thế bởi sự tiện
dụng và nhanh chóng của phương pháp này. Chỉ mất 1 thế hệ để tạo ra cây đơn bội.
Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển
thành cây khi nuôi cấy bao phấn, hạt phấn và gần đây, người ta còn nuôi cây kích
thích các tế bào trứng (noãn chưa thụ tinh) phát triển thành cây đơn bội. Đặc biệt với
cây ngô đã nhanh chóng tạo hàng loạt cây đơn bội ứng dụng trong công tác giống
cây trồng.
14
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
* Khả năng ứng dụng trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây
trồng:
Cây đơn bội có thể ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau:
- Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen.
- Tạo đột biến ở mức đơn bội.
- Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng.
Sơ đồ các hướng ứng dụng cây đơn bội:
Dòng thuần ổn định (F1, F2)
Chọn giống ưu thế lai
dòng đồng hợp tử tuyệt đối
Nhị bội hóa số lượng NST
(Tự phát, xử lý, colchicine)
Cá thể đơn bội
Lai với các thể đơn bội khác
bằng dung hợp tế bào trần Nuôi cây tế bào trần
(lai Soma) của các thể đơn bội
Gây đột biến, chọn lọc in vitro
Tái sinh cây
Nguyên liệu khởi đầu
cho chọn giống
* Kỹ thuật tạo cây đơn bội:
- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn:
+ Nguyên lý:
Nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa
các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích
các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội.
15
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
Sự phát sinh cây đơn bội từ hạt phấn được gọi là sự sinh sản đơn tính đực
(androgensis). Khi nuôi cấy hạt phấn đơn nhân in vitro có thể có 3 phương thức sinh
sản đơn tính đực như sau:
Sinh sản đơn tính đực trực tiếp như ở thuốc lá, cà độc dược. Khi đó hạt phấn
đơn nhân (tiểu bào tử) tạo phôi 1n, phôi này sẽ phát triển thành cơ thể 1n (cây 1n).
Sinh sản đơn tính đực gián tiếp như ở lúa, ngô. Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểu
bào tử) tạo mô sẹo 1n, nhân nhanh thành chồi 1n, phát triển thành cây 1n.
Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: Qua trình này diễn ra tương tự như sinh sản
đơn tính đực gián tiếp, nhưng sự thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết như ở cây cà
chua.
+ Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn:
Bước 1: Chọn bao phấn. Giai đoạn phát triển của hạt phấn có vai trò quyết định
trong việc tạo cây đơn bội, tốt nhất là hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào giảm nhiễm
lần một. Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn.
Bước 2: Xử lý nụ hoa. Xử lý nhiệt độ thấp cho nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và
trước khi tách bao phấn để cấy sẽ kích thích sự phân chia của tiểu bào tử để tạo cây
đơn bội. Chế độ xử lý lạnh phụ thuộc vào loại cây. Ví dụ: lúa Japonica xử lý ở 100C
trong 2-3 tuần; lúa Indica xử lý ở 70C trong 1 tuần; thuốc lá xử ý ở 2-3 ngày.
Bước 3: Chọn môi trường thích hợp. Môi trường nuôi cấy thích hợp là điều vô
cùng quan trọng. Với mỗi loại cây trồng khác nhau thì lại có môi trường thích hợp
khác nhau. Chẳng hạn, với họ hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt 2,4 D ở nồng độ
cao để khởi động sự phân chia đầu tiên (lúc mì 10-5mol 2,4 D trong 12 ngày); Cây
họ cà cần ít hơn, khoảng 10-6 mol. Về hàm lượng đường cũng khác nhau, ở ngô là 60-
120g saccarose/l, lúa 50-60 g saccarose/l, cây họ cà 20-40g saccarose/l, v.v. Ngoài ra
một số hỗn hợp tự nhiên như dịch chiết khoai tây, nước dừa tỏ ra có tác dụng tốt
trong nuôi cấy bao phấn. Còn các nguyên tố đa lượng và vi lượng ít ảnh hưởng
trong nuôi cấy bao phấn.
Bước 4: Chọn lọc cây đơn bội. Không phải tất cả các cây tái sinh khi nuôi cấy bao
phấn đều là cây đơn bội, vì vậy để xác định cây đơn bội có thể sử dụng một số
phương pháp như đếm số lượng NST, đo gián tiếp hàm lượng ADN của tế bào, trồng
cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước, khả năng sinh trưởng.
+ Kỹ thuật nuôi cây cấy hạt phấn: Các bước nuôi cấy hạt phấn tương tự như nuôi
cấy bao phấn, tuy nhiên hạt phấn được rời khỏi bao phấn trước khi nuôi. Các hạt
phấn này thước được nuôi cấy trong môi trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôi
cấy trong môi trường bán lỏng.
16
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
Sơ đồ tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn:
Cây đơn bội
Phôi hóa
Tạo callus
Cây đơn bội
Nuôi cây bao phấn
môi trường dinh dưỡng đặc hiệu
- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh:
Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay
trinh nữ sinh (gynogensis).
Đã có nhiều thành công trong việc nuôi cây bao phấn và hạt phấn để tạo cây đơn
bội. Tuy nhiên, khi đi sâu vào nghiên cứu và thực hiện người ta thấy rằng, nuôi cấy
bằng bao phấn và hạt phấn đã bộc lộ nhiều nhược điểm như tỷ lệ bạch tạng là rất
cao. Đặc biệt với các loại cây như hành, củ cải đường, hướng dương, v.v. đã không
cho kết quả như mong muốn. Trên cơ sở đó, vòa những năm 70 các nhà khoa học đã
tập trung nghiên cứu giải quyết cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh và đã
thu được nhiều thành tựu.
Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng trinh nữ sinh biến động ở các loại cây khác nhau. Đối
với hành, củ cải đường tỷ lệ này là 5-20%; ở lúa là 1,5-12%; ở dâu tằm là 3-6%, …
Tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn và phức tạp do
việc tách tế bào trứng rất khó và dễ gây thương tổn. Nhằm tăng hiệu quả của quá
trình này, người ta tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn
phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy, …
17
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
Trong các cây ngũ cốc, ở cây ngô việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tương đối đơn
giản và thu được nhiều thành công hơn cả.
18
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
Chuyên đề 6. Kỹ thuật tách, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần (protoplast)
---------- o 0 ----------
a. Khái niệm tế bào trần
Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào chỉ còn phần
nguyên sinh chất, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân biệt
bên trong và bên ngoài tế bào trần.
b. Phương pháp tách tế bào trần
* Nguyên tắc:
- Sử dụng hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza để phân giải
thành tế bào và giải phóng các tế bào trần.
- Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào được tách ra, tế bào trần phải được
phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào
không bào, gây vỡ tế bào chất bằng việc bổ sung các chất gây áp suất thẩm thấu như
saccarose, manitol, sorbitol, Ca2+…
- Nồng độ chất áp suất thẩm thấu và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho phù hợp
với từng loại cây trồng.
Đây là phương pháp dùng phổ biến và có hiệu quả cao: Có thể thu được từ 1g lá
tươi có thể thu được 6÷12 triệu tế bào trần.
* Các bước tiến hành
- Chọn nguyên liệu: ex ivtro: mô lá non (cần phải khử trùng), in vitro: lá, mô sẹo,
tế bào huyền phù.
- Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl2, đường monitol …0,5÷0,7M)
- Xử lý hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza
- Tách và làm sạch protoplast: lọc, ly tâm.
- Kiểm tra khả năng sống (fluorescein diacetate) và tạo huyền phù protoplast có
mật độ phù hợp (104 ÷107/ml)
Ví dụ về kỹ thuật tách tế bào trần
+ Ở cây thuốc lá
Nguyên liệu thực vật: lá thứ 3 từ trên xuống.
Hỗn hợp enzym: cellulolaza 1%
macerozyme 0,02%
driselaza0,05%
Thời gian ủ: 16h (ngâm qua đêm)
+ Ở cây ngô
Nguyên liệu thực vật: tế bào hạt phấn.
Hỗn hợp enzym: cellulolaza 2%
macerozyme 0,1%
pectolyaza 0,05%
19
- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
Thời gian ủ: 4÷12h (ngâm qua đêm)
Các tế bào trần sau khi tách thành tế bào được lọc qua rây có kích thước 50÷80µm,
rồi rửa bằng dung dịchkhông có enzym bằng ly tâm.
c. Quá trình tái sinh của tế bào trần và các yếu tố ảnh hưởng
* Quá trình tái sinh:
- Nuôi cấy protoplast: thường chia 2 giai đoạn
20
nguon tai.lieu . vn
