Xem mẫu
- KHỐI PHỔ & LC-MS
Mass Spectrometry & LC-MS
Phạm gia Huệ
Hà nội 07-08-2009
- Khối phổ (MS) là gì?
Công cụ PT hay dùng nhất hiện nay.
Kỹ thuật cung cấp thông tin về:
1. Khối lượng và công thức phân tử 1 hợp chất
2. MS cùng với NMR và IR cho phép nghiên cứu cấu trúc phân
tử
3. Thành phần định tính và định lượng của một hỗn hợp.
4. Máy MS chuyển các Phân tử thành các ion ở thể khí và tách
chúng theo tỷ số m/z và ghi lại cường độ từng ion, cho một
phổ khối.
5. PT được mẫu rất nhỏ, dạng rắn, lỏng, khí của các chất PTL
nhỏ cỡ (một số Da) tới các protein (cỡ trên 300 000 Da).
(Dalton (Da) = amu)
- Khối phổ (MS) là gì?
Nguyên lý cơ bản là
• sự tạo thành các ion,
• các ion này được tách hay lọc theo
tỷ lệ m/z (khối lượng/điện tích) của chúng,
• và được phát hiện.
- Các thành phần một máy MS
Nạp mẫu
Tránh ion PT va chạm với các
Chân không
R
phân tử trong không khí
cao
L
K
Detector
PT khối
Nguồn ion ion
Signal Intensity
Cường độ tín
Xử lý và lưu dữ
hiệu
liệu
m/z
Phổ Khối
- 1. Nguồn ion hoá
Biến đổi chất PT, tạo thành các ion phân tử
(molecule) và các ion mảnh (fragment)
Hai kỹ thuật chính hay dùng:
• Bắn phá electron (Electron Impact - EI):
tạo ion dùng chùm electron năng lượng
cao: phương pháp “cứng”
• Ion hoá hoá học (chemical ionization -CI)
tạo ion thông qua phản ứng với các ion
thuốc thử: phương pháp “mềm”
- 1.1. Bắn phá electron (EI)
• Ví dụ: Electron bắn phá methanol:
tạo cation gốc methanol, một ion phân tử:
CH3OH + 1 e- CH3OH+. + 2 e-
• Chỉ một số (~0.01%) phân tử chất PT (M) được
ion hoá
• Phần lớn các ion phân tử bị phá thành các mảnh
nhỏ hơn (cation, gốc, phân tử trung hoà nhỏ
hơn)
- 1.1. Bắn phá electron (EI)
Sợi đốt
PT
+
+ khối
Khu vực
Chùm electron Gia tốc ion
- Bắn phá / ion hoá Chỉ các mảnh tích
điện được phát hiện
Phân mảnh
e-
70 eV
[Mảnh Con]
••
M+•
M
F1+ + F1•
Mẫu Cation gốc
Mảnh Mảnh
/ Ion phân tử
2e- gốc
cation
[M ẹ ]
F1+• + NF1
Mảnh
Mảnh
trung hoà
cation gốc
F2+ + F2•
Mảnh Gốc
cation
Các LK dễ gãy là các LK yếu nhất, tạo các mảnh bền
- Pic cơ bản Phổ MS của
pentobarbital,
bắn phá
bằng electron
Khối lượng phân tử =226
Molecularphân tử M+.
Pic ion ion peak
• Ion phân tử M+., có m/z 226, mất gần hết.
• Tạo thành các mảnh m/z 197, 156, 141, 112, 98, 69, and 55,
• Các pic này là dấu vết các mảnh trong cấu trúc của phân tử M.
• Pic lớn nhất trên phổ MS là pic cơ bả n (coi như có cường độ 100%) . Cường độ pic khác tính theo
% của pic cơ bản.
- 1.2. Ion hoá học (CI) – PHƯƠNG PHÁP mềm
• Tạo ít mảnh.
• Dùng thừa thuốc thử dạng khí như CH4.
• Chùm electrons (100–200 eV) chuyển CH4 thành các SP như CH5+
CH5+ là chất cho proton mạnh, phản ứng hoá học với
chất phân tích tạo ra phân tử proton hoá MH+, có nhiều trên phổ
MS ion hoá hoá học dùng methan
CH4 e CH4 . 2e
CH4 . CH4 CH5 .CH3
CH5 M CH4 MH
(M+1) peak
- Phổ ion hoá hoá học của
pentobarbital
Ion hoá
Cường độ tương đối
Hoá học
Pic của ion phân tử MH+ ở m/z 227 (M+1) là pic lớn thứ nhì.
Ít các pic của mảnh so với phổ EI
- 2. Bộ Phân tích Khối
• Trái tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách
các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần
riêng biệt.
• Phân loại:
Bộ phân tích từ,
Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)
Bộ phân tích bãy ion tứ cực (Ion trap)
Bộ phân tích thời gian bay (TOF)
•Sau đây là bộ phân tích từ
- m/z = B2r2e/2V
Where m = mass,
2.1 Bộ phân tích từ
e = electron charge,
z = # of charges/ion
Magnetic field r = radius of curvature
B
Focusing slits 2 mV
r
B 2e z
Accelerating
Focused ion M+
Ion M+
voltage V
Ionizing
Increase B
voltage
Radius r
Detector
Sample
Low vacuum
inlet
- Ion Beam Magnetic Field
Detector
- 2.2 Bộ phân tích tứ cực
(Quadrupole)
• Một số ion có tỷ số m/z xác
định cộng hưởng với thế xoay
chiều xác định có thể đi thẳng qua
khoảng không đến detector. Trong
khi đó.
•Các ion khác không sẽ có quĩ đạo
không ổn định, va chạm với các
cực và bị giữ lại ở đó.
•Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các ion có tỷ số m/z khác
nhau có thể vượt qua khoảng không để đến detector.
- 2.2 Bộ phân tích tứ cực
Bẫy ion (Quadrupole Ion trap)
• Bẫy ion tứ cực hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tích
khối tứ cực; chỉ có một điểm khác là các ion được lưu giữ
và đưa dần ra khỏi bẫy
• Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các
ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vượt qua khoảng không
để đến detector.
- 2.3 Bộ phân tích tứ cực Chập Ba (Triple Quadrupole)
Q Q
Q Detector
1 3
2
Ba bộ tứ cực nối tiếp nhau:
Ở Q1: Ở các ion được tách
Ở Q2: Với áp suất cao, các ion bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt
như nitơ, argon, heli. Bộ Q2 tạo ra phân ly do va chạm chúng bị phân
mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions).
Ở Q3: làm nhiệm vụ tách các ion con
- Độ phân giải của máy khối phổ
• Đó là khả năng của máy có thể phân biệt được 2 pic có
khối lượng gần nhau m1 và m2. Độ phân giải R là:
R = m 2 / (m 2 - m 1)
Hai pic cạnh nhau đươc coi là đã tách riêng khi phần chồng lấp giữa
•
hai pic đó nhỏ hơn 10% pic nhỏ.
• Bộ phân tích từ hội tụ đơn có trị số R khoảng 5000.
• Cần có máy với độ phân giải cao hơn để phân biệt các
ion có khối lượng gần nhau.
• Ví dụ: để phân biệt 2 ion có m1= 280,2881 và m2= 280,2768
máy MS cần có R= 25 000
- 2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight)
Nguyên tắc:
• Dùng bộ phận gia tốc ion đẩy ion bay tới
detector, đo thời gian bay
• Thời gian bay được chuẩn hóa theo tỷ lệ
m/z
- 2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight)
Ưu điểm:
• Độ phân giải rất cao (>10.000)
• Độ chính xác rất cao ( 2- 5 mDa)
Ứng dụng:
• Xác định chất mới (xác định công thức)
• Yêu cầu xác định khối lượng chính xác
• Xác định được tạp
• Đo tỷ lệ các pic đồng vị
nguon tai.lieu . vn
