Xem mẫu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014

Nghiên cứu Y học

KHẢO SÁT GIÁ TRỊ CỦA XÉT NGHIỆM ĐỊNH DANH VI KHUẨN
Ở BỆNH NHÂN NHIỄM KHUẨN MẮT DỰA TRÊN ĐOẠN GEN 16s rDNA
Lê Xuân Trường*, Nguyễn Vũ Uyên**

TÓMTẮT
Đặt vấn đề: Phương pháp nuôi cấy thông thường trong nhiễm khuẩn mắt thường cho kết quả dương tính
thấp và thời gian trả kết quả lâu. Để rút ngắn thời gian trả kết quả cũng như có kết quả dương tính cao, gần đây
người ta nói đến kỹ thuật định danh vi khuẩn dựa trên đoạn gen 16s rDNA trong sinh học phân tử. Để đánh giá
kỹ thuật mới ở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm phát triển phương pháp định danh vi khuẩn
bằng kỹ thuật sinh học phân tử ở bệnh phẩm mắt.
Đối tượng nghiên cứu: Những bệnh nhân có chỉ định nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ tại Bệnh viện
Mắt thành phố Hồ Chí Minh từ 02/9/2013 – 30/9/2013.
Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang. Trong 72 bệnh nhân nghiên cứu, tăm bông vô trùng được dùng để
lấy mẫu và sau đó cấy vào dung dịch BHI từ 24 – 48 giờ. Dung dịch BHI sau đó được song song định danh bằng
cả 2 xét nghiệm nuôi cấy thông thường và giải trình tự đoạn gen 16s rDNA. Kết quả giải trình tự được so sánh
trên ngân hàng gen NCBI để định danh vi khuẩn. Cuối cùng so sánh 2 kết quả nuôi cấy và giải trình tự đoạn gen
16s rDNA.
Kết quả: Trong tổng số 72 mẫu làm xét nghiệm, có 39 mẫu dương tính với kỹ thuật PCR, 32 mẫu dương
tính với phương pháp nuôi cấy thông thường. Nuôi cấy chỉ dương tính với các vi khuẩn: Acineto bacter
baumannii (n=2), Pseudomonas (n=4), Pseudomonas aeruginosa (n=2), Staphylococci coagulase âm (n=2),
Staphylococci coagulase âm kháng methicillin (n=20), Staphylococcus aureus (n=2). Nói chung, có 39/72 mẫu
(chiếm 45,2 %) cho kết quả 16s rDNA dương tính, trong khi đó chỉ có 32/72 mẫu (tức 44,4%) nuôi cấy dương
tính. Không có mẫu nào nuôi cấy dương tính cho kết quả định danh 16s rDNA âm tính.
Kết luận: Giải trình tự đoạn gen 16s rDNA là phương pháp phù hợp để phát hiện và định danh vi khuẩn ở
mắt nhiễm trùng. Xét nghiệm này cho kết quả nhanh và có thể phát hiện những vi khuẩn không phát hiện được
bằng phương pháp nuôi cấy thông thường.
Từ khóa: kỹ thuật PCR, DNA, định danh vi khuẩn

ABSTRACT
SURVEY VALUE TEST FOR IDENTIFICATION OF BACTERIA BASED ON GENE OF 16S rDNA
IN INFECTION EYES
Le Xuan Truong, Nguyen Vu Uyen
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 - 2014: 77 - 80
Background: Conventional culture method for eye infection specimens often results in low positive and
lasting results time pay. To shorten the duration of high culture as well as positive results are high, we mention
about modern techniques in molecular biology. To evaluate the new technique, we conducted this research topic to
develop methods of bacterial identification by molecular biology techniques in eye swabs, this new method will
result in faster than culture.
* Bộ môn Hoá Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TPHCM ** Khoa xét nghiệm, Bệnh viện Mắt TPHCM
Tác giả liên lạc: TS. BS. Lê Xuân Trường
ĐT: 01269872057
Email: lxtruong57@yahoo.com

Mắt

77

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014

Material and method: Patients indicated bacterial culture and antimicrobial susceptibility at Eye Hospital
of Ho Chi Minh City from 02/09/2013 - 30/09/2013. Cross-sectional descriptive study. From 72 patients in
survey, swabs were taken and cultured in BHI for 24 – 48 hours. After that, we parallel identify bacteria by both
culture and sequencing 16s rDNA. Sequences were compared with sequences of known bacteria listed in the
NCBI data bank. Finally, the results were compared with results obtained from conventional cultivation.
Results: In 72 specimens, there are 39 specimens gave positive for PCR technique, 32 specimens gave
positive conventional culture. Culture was only positive for: Acineto bacter baumannii (n=2), Pseudomonas
(n=4), Pseudomonas aeruginosa (n=2), Staphylococci coagulase negative (n=2), Staphylococci coagulase negative
resist methicillin (n=20), Staphylococcus aureus (n=2). In total, 45.2 % (39/72) analyzed specimens have 16s
rDNA positive, whereas only 44.4% (32/72) were culture positive. No specimen positive by culture gave negative
results by 16s rDNA.
Conclusions: 16S rDNA sequence analyses are appropriated methods for the detection and identification
ocular infections of bacteria that might not be detected by conventional cultivation and this PCR test gave quicker
result.
Keyword: PCR technique, DNA, identify bacteria

ĐẶT VẤNĐỀ
Các bệnh lý nhiễm trùng ở mắt là bệnh lý
thường gặp trong Nhãn khoa, định danh vi
khuẩn là vô cùng cần thiết giúp chẩn đoán và
điều trị, nhưng việc định danh vi khuẩn
không phải là dễ dàng vì một số vi khuẩn chỉ
tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy đặc
biệt. Hơn nữa, lượng bệnh phẩm từ mắt
thường rất ít nên nuôi cấy cho kết quả dương
tính thấp và thời gian nuôi cấy lâu từ 3-4 ngày.
Để giải quyết những khó khăn trên, chúng ta
có thể ứng dụng các kỹ thuật mới vào việc
định danh vi khuẩn trong Nhãn khoa bằng
cách giải mã trình tự đoạn gen 16s rDNA với
kỹ thuật PCR.
Tại Việt Nam đã có các nghiên cứu về
VMNN (viêm mủ nội nhãn) của Bệnh viện
Mắt Trung Ương “Ứng dụng PCR và giải trình
tự trong chẩn đoán định danh nguyên nhân
viêm mủ nội nhãn nội sinh do vi khuẩn”(1),
nhiễm trùng ở Mắt có tác giả Nguyễn Thị Bình
Minh, Phùng Thị Tục thuộc bệnh viện tỉnh Hà
Tây thực hiện nghiên cứu “Nhận xét 84
trường hợp viêm loét giác mạc điều trị tại
Khoa Mắt bệnh viện tỉnh Hà Tây ”(3) và tác giả
Vũ Hoàng Việt Chi, Phạm Thị Khánh Vân
thực hiện nghiên cứu “Viêm loét giác mạc

78

nhiễm trùng tại bệnh viện Mắt Trung Ương
đặc điểm lâm sàng và vi sinh”(5).
Các nghiên cứu trên chỉ ứng dụng sinh học
phân tử vào các trường hợp VMNN mà chưa có
nghiên cứu khả năng ứng dụng của xét nghiệm
16s rDNA vào các bệnh nhiễm trùng Mắt vì vậy
chúng tôi thực hiện nghiên cứu này.

ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
Đối tượng
Tất cả bệnh nhân có chỉ định nuôi cấy vi
khuẩn và làm kháng sinh đồ tại bệnh viện Mắt
TP.Hồ Chí Minh từ 02/9/2013 – 30/9/2013.

Phương pháp nghiên cứu
Lấy mẫu thuận tiện trên những mẫu xét
nghiệm được chỉ định nuôi cấy và làm kháng
sinh đồ, bao gồm những mẫu nuôi cấy dương
tính và âm tính.
Mẫu xét nghiệm được lấy trên tăm bông
vô trùng hay dịch mủ nội nhãn được đem
nuôi cấy trong dung dịch BHI qua đêm.
Sau 24 – 48 giờ dung dịch BHI được cấy
chuyển lên thạch, các mẫu dung dịch BHI còn
lại được làm xét nghiệm 16s rDNA dù vi
khuẩn có mọc hay không.

Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014

Bảng 6. So sánh tỷ lệ dương tính ở các nghiên cứu

KẾT QUẢ VÀ BÀNLUẬN
Bảng 1. So sánh kết quả dương tính của 2 xét nghiệm
Dương tính
32 (44,4%)
39 (54,2%)

Nuôi cấy
16s rDNA

(2)

Ấn Độ
(4)
Đại Học Y Vienna, Áo
Chúng tôi

Bảng 2. So sánh 2 xét nghiệm

16s rDNA dương
16s rDNA âm
Tổng cộng

Nuôi cấy
dương
32
0
32

Nuôi cấy
âm
7
33
40

Tổng cộng
39
33
72

Độ nhạy của xét nghiệm 16s rDNA
Ss = 32/32 = 100 %.
Bảng 3. Kiểm định McNemar
Nuôi cấy
P
Dương tính n Âm tính n
Dương tính n
32
7
16 s rDNA
0,015
Âm tính n
0
33

Kiểm định McNemar với p = 0,015 cho
thấy có sự khác biệt giữa 2 xét nghiệm.
Bảng 4. Thống kê các mẫu dương tính được định
danh bằng nuôi cấy
Tên
Acineto bacter baumannii
Pseudomonas
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococci coagulase âm
Staphylococci coagulase âm
kháng methicillin
Staphylococcus aureus
Tổng cộng

Số lượng
2
4
2
2

Tỷ lệ (%)
6,25
12,5
6,25
6,25

20

62,5

2
32

6,25
100

Bảng 5: Thống kê các mẫu dương tính được định
danh bằng 16s rDNA
Tên
Acineto bacter calcoacetius
Bacillus cereus
Bulkhoderia cenocepacia
Corynebacterium sp
Kocuria sp.
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas otitidis
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus heamolyticus
Staphylococcus hominis
Streptococcus intermedius
Streptococus mitis
Streptococus oralis
Tổng cộng

Mắt

Nghiên cứu Y học

Số lượng Tỷ lệ (%)
1
2,56
1
2,56
1
2,56
1
2,56
1
2,56
5
12,83
2
5,14
2
5,14
18
46,16
3
7,69
1
2,56
1
2,56
1
2,56
1
2,56
39
100

% Sinh học phân % Nuôi cấy
tử dương tính dương tính
31,6%
22%
45%
22%
54,2%
44.4%

Theo nghiên cứu của trường Đại Học Y
Vienna, Áo(4), tỷ lệ dương tính của PCR là 45%
trong khi đó nuôi cấy dương tính chỉ có 22%.
Kết quả của xét nghiệm 16s rDNA của
nghiên cứu chúng tôi là 54,2% và nuôi cấy là
44,4% phù hợp với thống kê bệnh viện Mắt hàng
tháng về tỷ lệ nuôi cấy dương tính, kết quả này
của nghiên cứu chúng tôi có thể khác biệt vì sự
phân bố mẫu của nghiên cứu trên đối với vi
khuẩn và nấm có sự khác biệt, nghiên cứu ở Ấn
Độ(2) có 48 mẫu là vi khuẩn và 66 mẫu là nấm.
Nói chung cả 3 nghiên cứu đều cho thấy
khả năng định danh vi khuẩn tốt hơn của kỹ
thuật sinh học phân tử so với phương pháp
nuôi cấy cổ điển và có khả năng phát hiện
những trường hợp âm tính giả của nuôi cấy do
hạn chế của kỹ thuật.
Các mẫu nuôi cấy âm tính và cho 16s rDNA
dương tính, trong đó có một số loại vi khuẩn
không phát hiện trên nuôi cấy như: Bacillus
cereus, Corynebacterium sp., Kocuria sp., tuy số
lượng không nhiều nhưng góp phần giúp chúng
ta không bỏ sót chẩn đoán và hỗ trợ điều trị.

KẾT LUẬN
Xét nghiệm 16s r DNA cho tỷ lệ dương tính
54,2% cao hơn kết quả nuôi cấy chỉ có 44,4%.
Kỹ thuật sinh học phân tử mới 16s rDNA là
công cụ hữu ích giúp hỗ trợ chẩn đoán và điều
trị trong bệnh lý nhiễm trùng ở mắt. Đây là một
xét nghiệm với độ nhạy cao là 100%.
Các mẫu nuôi cấy âm tính nhưng 16s rDNA
dương tính góp phần giúp chúng ta không bỏ
sót chẩn đoán và hỗ trợ điều trị.

TÀI LIỆU THAMKHẢO
1.

Bệnh viện Mắt Trung Ương (2009). “Ứng dụng PCR và giải
trình tự trong chẩn đoán định danh nguyên nhân viêm mủ
nội
nhãn
nội
sinh
do
vi
khuẩn”,
http://www.thuvienykhoa.vn/chi-tiet-tai-lieu/ung-dung-pcr-

79

Nghiên cứu Y học

2.

3.

4.

80

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014

va-giai-trinh-tu-trong-chan-doan-dinh-danh-nguyen-nhanviem-mu-noi-nhan-noi-sinh-do-vi khuan/5177.yhoc
Kim E, Chidambaram JD, Srinivasan M, Lalitha P, Wee
D, Lietman TM, Whitcher JP, Van Gelder RN (2008)
“Prospective comparison of microbial culture and polymerase
chain reaction in the diagnosis of corneal ulcer”. Am J
Ophthalmol, 146 (5): 714-23;723 e1.
Nguyễn Thị Bình Minh, Phùng Thị Tục (2000) “Nhận xét 84
trường hợp viêm loét giác mạc điều trị tại Khoa Mắt bệnh
viện tỉnh Hà Tây (1999-2000)”, bệnh viện Mắt Trung Ương,
http://www.vnio.vn/Cac-so-TCNK-Cong-trinh-nghien-cuuTCNK-so-2/nhn-xet-84-trng-hp-viem-loet-giac-mc-iu-tr-tikhoa-mt-bnh-vin-tnh-ha-tay-1999-2000.html,
Schabereiter-Gurtnerm C, et al (2001). “16S-rDNA-based
identification of bacteria from conjunctival swabs by PCR and

5.

DGGE fingerprinting”. Invest Ophthalmol Vis Sci, 42 (6),
1164-71.
Vũ Hoàng Việt Chi, Phạm Thị Khánh Vân (2011). “Viêm loét
giác mạc nhiễm trùng tại bệnh viện Mắt Trung Ương đặc
điểm
lâm
sàng

vi
sinh”,
http://thaythuocvietnam.com.vn/Viem-loat-giac-mac-nhiemtrung-tai-Benh-vien-Mat-Trung-Uong-dac-diem-lam-sang-vavi-sinh-di1239--n7597.

Ngày nhận bài báo:01/11/2013
Ngày phản biện nhận xét bài báo:26/11/2013
Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014

Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt

nguon tai.lieu . vn