Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống thực vật: Phần 2

98 Chương 5 LAI TỂ BÀO SOMA 5.1. Mỏ ĐẦU Như ta đă biết, khác với các tế bào động vật, tế bào thực vật ctí thành tế bào là lớp bao ngoài cùng. Thành tế bào gồm xenlulo (khoảng 20-30 % ), hemixenluỉo và pectin. Nếu như thành tế bào bị tách bỏ, thì lúc đđ tế bào thực vật sẽ lộ ra lớp màng sinh chất ngoài cùng, mà trạng thái ta gọi là tế bào tràn hay protoplast. Khi các protoplast tiếp xúc với nhau thỉ chúng cổ thể hợp nhất lại làm một, mà ta gọi là 8ự dung hợp protoplast. Nếu như các protoplast cđ nguòn gốc từ các tế bào soma thuộc các giống, loài hoặc chi khác nhau được dung hợp lại thi nó cđ thể dẫn đến hiện tượng lai té bào soma (somatic hybrydization), Vi tế bào thực vật cố thành tế bào, nên trước đây trong một thời gian dài người ta cho ràng kỷ thuật dung hợp protoplâst chỉ giới hạn ở các tế bào động vật; mặc dầu ngay từ rất sớm Kuster (1909) đă nêu ra ý tưởng sử dụng phương pháp lai tế bào soma để vượt qua những khó khản nảy sinh trong quá trình lai xa ở thực vật. Mãi cho đến nảm 1960, sau những nghiên cứu thành cổng của Cocking với việc dùng một hỗn hợp các emym cellulose, pectinase và maceroz nne để tách bỏ thành tế bào thực vật, thi kỹ thuật dung hợp protoplast mdi được áp dụng ở thực vật. Tuy nhiên, nổ chi thực sự phát triển mạnh mế và cố xu hiỉớng được úng dụng trong chọn giổng chỉ sau các kết quả n^iên cứu về việc tái sinh hoàn chỉnh cây thuổc lá từ protopỉast của Ikkebe (1971) và việc tái sinh cây thuốc lá lai do dung hợp protoplast giữa hai loài N. tabacum với N. langsdorffi của Carlson (1972), Sự ra đời của kỹ thuật protoplast cho phép ngườỉ ta tẹo ra những tái tổ hợp di truyền giữa các đơn vị phân loại xa ( loài hay chi) mà bằng phương pháp ỉai hữu tính khò hoặc không đạt được. Trong quá trỉnh dung hợp, bên cạnh sự kết hợp giữa các genom trong nhân, còn cố thể xảy ra sự hợp nhất tế bào chất giữa các protoplast. Nhờ vậy, một số tính trạng do các gen trong tế bào chất kiểm soát, như tính bất thụ đực, cố thể được chuyển một cách không khó khăn từ cây này sang cây khác nhờ kỹ thuật này. Muốn tiến hành lai tế bào soma càn phải tách được các protoplast một cách nguyên vẹn, cho chúng dung hợp với nhau, làm cho các sản phẩm dung hợp phân chia và tái sinh chúng thành cây. 5.2. TÁCH PROTOPLAST Về nguyên tác, có hai phương pháp tách bỏ thành tế bào thực vật : phương pháp cơ học và phương pháp dùng enzyin. T\xy nhiên, trong thực tế người ta chỉ dùng phương co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỤC VẬT 99 pháp enzym, vì nđ cd^hiệu suẩt rất cao mà lại không gây thương tổn cho tế bào. Khi thành tế bào được tách ra, protoplast phải được phóng thích ra môi trường cd áp suất thắm tháu cao để tránh nước xâm nhập vào không bào, gây vỡ protoplast ( ví dụ, cd thể dùng dung dịch manitol 0,5 M). Tuy nhiên, thời gian lưu lại ở đó không nên quá dài khiến cho trao đổi chất của tế bào và cấu trúc màng lưới sinh chất bị tổn hại. Dể tách protoplast, ví dụ từ cây thuốc lá được trồng trong nhà kính, được tưới thường xuyên ở 25"C, thỉ lá thứ ba từ trên xuống là ngiiồn thực liệu thích hợp nhất. Lá được khử trùng bằng ethanol 70% trong vài giây, sau đó được nhúng vào dung dịch hypoclorit canxi 5% rồi rửa bằng nước cất. Lá được thái nhỏ cho vào đỉa Petri chứa hỗn hợp enzym như sau : 0,1 % cellulase, 0,02% macerozyme và 0,05% driselase, để qua đêm (khoảng 16 h). Sau đó lọc qua rây cđ lỗ 50 - 80 /ym, rồi rửa 2 làn bàng dung dịch mới không chứa enzyxn bầng cách ly tâm. Ngoài lá, người ta cd thể dùng phần trụ dưới lá mầm hay rễ làm nguyên liệu tách protoplast. Do không chứa diệp lục nên nguồn protoplast này dễ phân biệt với các protoplast được tách ra từ mô thịt lá. Một nguồn nguyên liệu khác cũng được dùng để tách protoplast là các tế bào nuôi cấy dạng huyền phù. Đôi với các cây hoà thảo, điều cần biết là, chỉ cd các protoplast được tách ra từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyền phù mới có khả nảng phân chia và tái sinh cao (Fujimura,1985 ). 53. DUNG HỘP PROTOPLAST Lần đầu tiên Carlson (1972) đã tái sinh ra những cây thuốc lá từ protoplast bàng cách cho dung hợp protoplast trong môi trường cfòng thẩm tích của dung dịch nitrat natri. Còn Melchers (1974 ) thì dung hợp protoplast củng của thuốc lá ở môi trường 50 mM Ca + 0,4 M manitol với pH = 10,5. Môi trường của Melchers tỏ ra rát thích hợp cho việc dung hợp tế bào chất. Sau này, Kao (1974) đả phát hiện ra chát polyethylen glycol (PEG) cd tác dụng làm tâng hiệu quà dung hợp của protoplast; vl nd là chất qd ái lực với nước, làm tăng tính thẩm thấu và tăng bề mặt tiếp xúc giữa các protoplast. Chỉ sau vài phút được ngăĩh vào dung dịch 20 - 40 %(w/v) của PBG (mol. Wt. 1500 - 1600) hàu như tất cà các protoplast đều được kết dính lại. Tuy nhiên, việc dung hợp chỉ thực sự xảy ra khi pha ỉoâng PEG trong môi trường có nồng độ cao và pH cao (pH=« 10,5). T\iy nhiên, do PEG có độc tính đối với tế bào thực- vật nên người ta thường dùng ở nồng độ thấp hơn và thêm vào đó một ít DMSO (dimethyl sulíoxid). Sau này, phương pháp dung hợp nhờ xung điện (electrofusion) do Zimmerman đề xướng (1982) được nhièu người áp dụng. Nguyên tác của phương pháp là ; môi trường chứa protoplast được đặt giữa hai điện cực; sự dung hợp xảy ra khi ta tạo ramột xung điện với điện thế cao ( 500 - 10000 v/cm) trong khoảnh khác 5-6/1000 giây. Với các cây họ cà, hiệu quả dung hợp của phương pháp này đạt tới > 50%. Càn nhớ là, hiệu suất dung hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố: mật độ protoplast, nhiệt độ khi thí nghiệm, nồng độ PEG, cường độ điện trường... và nguồn nguyên liệu cho protoplast (tế bào mô thịt lá thường thích hợp hơn là mô sẹo hoặc rễ cây). Sự cd mặt của một lượng lớn không bào và các hạt tinh bột làm giảm khả nảng sống sơt của protoplast trong quá trinh dung hợp. Dưối đâv (bảng 5.1) là môi trường Bourgin (1979) dùng cho nuôi cấy protoplast được tách ra từ thịt lá cây thuốc lá. 100 LAI TẾ BÀO SOMA Bàng 5.1. MÔI truròrng nuối cấy protoplast thuốc lá (Bourgỉn, 1979 ) Hoá chất NH4 NOj KNOj Ca0 2 2 H2 0 MgSố4-7H20 KH2 PO FeSQ,.7H20 Na2 myrA Tsắo^ H2 BẶ MnS04.4H2Ơ CuS0 4 ^H 2 0 AIOị NICI2 . H2 O KI Nồng độ (mg /ỉ) 825 950 2 2 0 185 85 27^5 37^5 1 1 0 ,1 0,03 0,03 0,03 0 ,0 1 Hoá chất Inositon Calciuiii pantothenat BẾtXin Axit nicoUi^ PyrỉdcKin Thiamin Axit naphthalen acetỉc 6 -Ben ylamlnopui1n Sucrose Mannitol pH5^ Nồng độ (mg/l) KK) 1 0 ,0 1 1 1 1 3 1 2 0 0 0 0 80000 5.4. NUÔI CẤY PROTOPLAST VÀ TÁI SINH CÂY Môi trường nuôi cấy protoplast khác xa so với các môi trường nuôi cấy mô để cho tế báo cổ thể phfln chia và hinh thành md sẹo. Điều khác trưãc tiên là, mổi trưdng này cần phảỉ cd áp suăt thẩm thâu cao lúc ban đầu bầng cách aử dụng mannitol hoặc sorbitol ; thứ hai là, môi trường phẩd ctí nông độ chất sinh trưởng tương đổi cao. Đối với protoplast thuổc lá nồng độ các chất đổ là : 3 mg/1 NAA (15 Ịiim.) và 1 mg/ỉ benzylaminopurín (5 /im) - Xem bảng 5.1. Mật độ protoplast / ml phải điều chỉnh sao cho cd thể đếm được bầng bu&ng đốm hồng cầu. Vối thuốc lá, nồng độ đó là 60000 protoplast /ml (nốu tế bào cđ kích thước bé thỉ mật độ ctí thể tAng lên). Môi trường dịch thể của protoplast cần đật trong điều kiộn tổi cho đến khi chứng b&t đ&u phftn chia l&n thú nhát. Sau đổ kho&ng tìỉ 2 -6 ngày thỉ thành tế bào được tái sinh (tùy theo loài cây). Cấu trúc 2 tế bào cố thế quan sát được dưới kính hiển vi soi ngược, nếu chúng được nuôi cấy trên môi trường lỏng. THỉy nhiên, nếu nuôi cấy trôn môi trường đặc thl ta có thể theo dõi được sự phát triển của từng protoplast và sự hinh thành từng cụm tế bào bé cđ nguồn góc từ từng protoplast. Để chọn lọc các đột biến sinh hoá hoậc các con lai soma ngưdi ta cổ thể nuỗi cẨy tách riêng từng protoplast trên từng đĩa Petri nhỏ trong mối trường cổ n&ng độ auxin thấp và mật độ tế bào thấp (1 tế bào / Iml). Với protoplast của cây cải dầu, bàng phương pháp nuôi cấy liên tục cđ thay môi trường mới 2-3 lần thì có thể thu được các nhổm tế bào cổ kỉ}ả n&ng tái sinh, sau khi chuyển chúng sang mối trường đặc tạo ch&ỉ thân. Cổ hai con đường phát sinh hình thái trong quá trinh hình thành cây hoàn chỉnh đối với các tế bào cd nguồn gốc từ protopiast. Đối với các protoplast cđ nguồn gốc tỉl mỏ thịt ỉá của cây thuốc lá, thỉ từ trong các tập đoàn tế bào nhỏ xuất hiện những u 16i ( vài tuần sau khi tách protoplast). Các u này phát triển thành rễ trong mổi trường khổng có chát sinh trưởng hoặc có ít auxin. Còn trong trường hỢp khi protoplast có nguồn gốc từ các co sò DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 101 tố bào phôi được nuôi cẩy dạng huyền phù ( thưòng đổi với họ hoà thảo ) thi các cụm tố bào v&n giữ nguyẽn được khả n&ng phát sinh phối để hinh thành nên các phổi. Nếu đảm bảo được qui trình chặt chẽ như trên, thi phồi hoặc mô phân sinh sỗ hỉnh thành sau khoảng 3 -5 tuần lễ. Tuy nhiên, trong những trường hợp khi mà điều kiện thí ni^iộm khống tổi ưu và có những biến đối về mặt di truyền thỉ sẽ xuát hiện sự thay đổi VẾ sổ lượng nhiễm sác thể. Ví dụ, với các protoplast từ cây khoai tây 2n, tần số cây 2n được tái sinh chỉ khoảng 10%, còn lại chủ yếu là các cây 4n. 5.5. CHỌN LỌC SẤN PHẨM DUNG Hộp Giả sử ta cho dung hợp giữa các protoplast từ 2 cây khác nhau và thu được kiểu tế bào dị nhân (heterokaiyocjrte), trong đó có sự trộn lẫn cả nhân và tế bào chất (bao gốm cả ty, lạp thể trong tế bào chẫt ). Song, sự dung hỢp này cũng có thể chỉ xảy ra giữa 2 nhãn hoậc giữa các tế bào chất hoặc chi một phần giữa các nhân. Điều này phụ thuộc vào quan hệ giữa các loài. Ví dụ, tàn số dung hợp giữa N.tabacum / N.tabacum ỉà 10 ■*, giữa Brassica campetris / B. oleracea là 0,5. Dể làm tăng khả năng tái sinh các cáy lai, người ta đã sử dụng một số phương pháp làm tảng tỷ lệ các tế bào dị nhân hoậc các phương pháp chọn lọc tế bào lai. Dưới đây, ta xem xét một sổ kỹ thuật tách các sản phẩm dung hợp. 1) Gleba (1978) đề xuất kỹ thuật tách và ũh&n dòng đổi với các sản phẩm dung hạp dưới kính hiển vi, dựa vào sự sai khác về mặt hinh thái; chẳng hạn sự cổ mặt của các chloroplast từ protoplast của mô thịt lá và sự khũng cổ mặt của chúng trong các protoplast cd nguồn gốc từ mô sẹo hay trụ dưới lá mầm. Việc tách các tố bào dị nhán được tiến hành bằng micropipet. 2) Galbraỉth (1978) và Redenbaugh (1981) đS ra phương pháp nhận diện các sản phẩm dung hợp bằng cách nhuộm huỳnh quang hoặc với chất rhodamin isothiocyanat đối với các protoplast trước lúc cho dung hợp. 3) Các sản phẩm dung hợp cũng có thể được tách ra bàng phương pháp kốt hợp tìí trường với gen chỉ thị kháng ehẵt khấHg ẫÌRh. Nguyên tấc nhu ẫãu; protoplast của dạng A được gán những phân tử nhỏ cố ái lực tỉí tính mạnh; protoplast của dạng B có gán gen kháng chất kháng sinh (ví dụ như kanamycin) Sau thí nghiệm dung hợp, protoplast được cho đi qua cột phàn ly ctí từ tính mạnh; protoplast dạng A và protoplast lai được gỉữ lại ở cột, còn proíoplast dạng B thỉ tách khỏi cột. Hỗn hợp protoplast lai và dạng A được nuổi căy trong mổi trường có kanamycin để tách ra các tế bào lai. 4) Các hiện tượng bổ sung di truyền trong quá trinh dinh dưỡng được dùng rất rộng rãi và cđ hiệu quả để nhận biết các sản phắm dung hợp, như sử dụng các đột biến bạch tạng hay thiếu hụt diệp lục, các đột biến sinh hoá do thiếu enzym nitrat reductase - NR (Melchers, 1974; Glỉmelius, 1978 ) hoặc các gen đánh dấu (ctí được bằng phương pháp chuyển gen) có liên quan đến tỉnh kháng các chát kháng sinh (Hamil, 1984) hoặc kháng chất diệt cỏ (Evola, 1983). - Chẳng hạn, cđ những trưòng hợp, khi được nuôi cấy trong môi trường thiếu hoocmon ngoại sinh thi các tế bào lai có khả nãng cho mỏ sẹo và tái sinh cây, còn các tế bào của từng dạng bó mẹ lại không có khả năng ấy (Power (1977) và Shenck (1982)) . - Trong nghiên cứu của Cocking (1977), khi dung hợp protoplast giữa các dạng đột 102 LAI TỂ BÀO SOMA biến thuộc hai ioài Petunia hybrida và p. parodii, trong đổ protoplast từ dạng đột biến albỉno của p. hybrida cho md sẹo màu tráng trên mối trưòng mà d đd protopỉast của p. parodii khống cho mữ sẹo, còn tế bào lai thì cho mỗ sẹo màu xanh. • Masson (1989) và Thomas (1990) đa sử dụng phương pháp biến nạp cho cả hai dạng bố mẹ : một dạng được g&Đ gen kháng kanamydn còn dạng kia được gán gen kháng hygromydn; việc chọn lọc các tế bào lai được tifo hành trong mữi trường chứa cả hai loại kháng sinh đđ. Nếu một trong hai dạng bổ mẹ là kiểu đột biến sinh dưỡng, ví dụ, kiốu thiếu enz}an NR nén khống thể sổng được tr6n mỗi trường NO^do khống có khả năng khử NO^ -*■ N0J" -* NH , còn dạng kia được chuyển gen kiểm soát một tính trạng trội - như kiểu kháng chất diệt cỏ hoặc kháng sinh - thi ta cổ thế chọn lọc trực tiếp các tế bào lai trên mỗi trường tổi thiểu và cổ bổ sung chãt kháng sinh hoặc chất diệt cỏ (các tế bào bổ hoặc mẹ khổng thổ sỔBg binh thườhg được). Dạng con lai đa năng như vậy đa được sử dụng d cây thuổc ỉá hoặc cải d&u. 5.6. CON LAI DO sự DUNG Hộp NHẢN Nhiều dạng con lai soma do kết quả của sự hợp nhấib nhân (nuclear hybrid) đa được tạo ra thành cống giữa các ỉoài cây trồng vỗi loài hoang dại d chi cải dầu; ví dụ, giữa loài B. nigra chứa 1 bộ gen (B) vói ỉoài B. napua chúa 2 bộ gen (ÁC). Bàng phương pháp dung hợp protoplast giữa hai loỉd ây, người ta đã tạo ra được dạng con lai chứa 3 bộ gen (ABC). Hoặc khi dung hợp protoplast giữa Enica sativa vói B. napus người ta đã chuyển được gen kháng cỏn trùng và chịu khô nguon tai.lieu . vn