1. Trang Chủ
  2. Khoa học xã hội
  3. Đề tài: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ liên hoạt tính xúc tác của Enzyme Bromelain trong quả dứa

Đề tài: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ liên hoạt tính xúc tác của Enzyme Bromelain trong quả dứa

Khoản 20 năm gần đây, với hơn 400 đề tài nghiên cứu, giới khoa học Châu Âu đã đưa ra một khuyến cáo rằng với một quả dứa một ngày bạn sẽ không cần gặp bác sĩ..trong công nghiệp chế biến thực phẩm từ quả dứa, sự biến đổi các thành phần giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thường xảy ra trong quá trình tiền xử lý bên cạnh sự tương tác giữa các thành phần bên trong nguyên liệu cũng có thể dẫn đến những biến đổi không mong mún như trên... TRƯ NG I H C C N THƠ KHOA NÔNG NGHI P & SINH H C NG D NG B MÔN CÔN

Thể loại Tài liệu miễn phí Khoa học xã hội

Số trang 49

Ngày tạo 8/30/2018 12:52:19 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.32 M

Tên tệp

Tải Đề tài: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ liên hoạt tín... (.pdf)

Xem mẫu

  1. TRƯ NG I H C C N THƠ KHOA NÔNG NGHI P & SINH H C NG D NG B MÔN CÔNG NGH TH C PH M LÊ KIM THANH NH HƯ NG C A pH VÀ NHI T LÊN HO T TÍNH XÚC TÁC C A ENZYME BROMELAIN TRONG QU D A LU N VĂN T T NGHI P K SƯ Chuyên ngành: CÔNG NGH TH C PH M Mã ngành: 08 Ngư i hư ng d n TR N THANH TRÚC NĂM 2007
  2. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ tài :” nh hư ng c a pH và nhi t lên Lu n văn ính kèm theo ây, v i t a ho t tính xúc tác c a enzyme bromelain trong qu d a” do Lê Kim Thanh th c hi n và báo cáo, ã ư c h i ng ch m lu n văn thông qua. Cán b hư ng d n Cán b ph n bi n Tr n Thanh Trúc Nguy n Th Thu Th y C n Thơ, ngày …tháng…năm 2007 Ch t ch h i ng Nguy n Văn Mư i Trang ii Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  3. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ L IC MT Em xin chân thành g i l i c m t và bi t ơn sâu s c n: Cô Tr n Thanh Trúc ã t n tình hư ng d n và t o i u ki n thu n l i nh t cho em hoàn thành t t lu n văn t t nghi p; Và cô Nguy n Th Thu Th y ã nhi t tình truy n th nh ng ki n th c quý báu, t o cơ s khoa h c v ng ch c cho em trong quá trình th c hi n tài; Em xin chân thành c m ơn quý th y cô phòng thí nghi m Công Ngh Enzyme, Vi n Nghiên C u Và Phát Tri n Công Ngh Sinh H c ã nhi t tình hư ng d n, giúp em trong su t th i gian th c hi n tài. Em xin g i l i c m ơn n quý th y cô b môn Công ngh Th c Ph m ã t n tình gi ng d y và truy n th nh ng tri th c quý báu cho chúng em trong su t th i gian h c t p. Em xin c m ơn th y c v n Nhan Minh Trí và t p th các b n l p Công Ngh Th c Ph m khóa 28 ã ng viên và giúp em trong su t khóa h c v a qua. C n Thơ, ngày 15 tháng 6 năm 2007 Sinh viên th c hi n Lê Kim Thanh Trang i Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  4. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ TÓM T T Trong công nghi p ch bi n th c ph m t qu d a, s bi n i c a các thành ph n và giá tr dinh dư ng c a s n ph m thư ng x y ra trong quá trình ti n x lý. Bên c nh ó, s tương tác gi a các thành ph n bên trong nguyên li u cũng có th d n n nh ng bi n i không mong mu n như trên. M t trong nh ng nguyên nhân gây ra i u này áng ư c quan tâm là h enzyme trong qu d a mà tiêu bi u là h enzyme t i này ư c t ra v i m c ích là tìm ra quy lu t ho t protease_bromelain qu . ng c a h enzyme bromelain qu t d ch chi t qu d a các i u ki n x lý 0 pH = 4,6 – 9,5 và nhi t t 10 – 75 C. K t qu nghiên c u cho th y d ch chi t t qu d a ư c s d ng cho nghiên c u enzyme bromelain t t nh t t ngày b o qu n th tư tr i; và b o qu n d ch chi t ch a enzyme t t nh t là i u ki n l nh ông. ng th i, có s tương tác gi a pH và nhi t x lý lên ho t tính c a h enzyme bromelain qu trong d ch chi t. H enzyme này th hi n ho t tính t i thích trong t 10 – 20 0C môi trư ng pH th p, 30 – 40 0C môi trư ng pH ki m kho ng nhi t (pH = 7,5 – 9,5) và 40 – 60 0C môi trư ng pH trung tính (pH = 6,8 -7,1). Trang i Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  5. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ M CL C TÓM T T ........................................................................................................... trang i M C L C ................................................................................................................... ii DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. iv DANH SÁCH B NG ................................................................................................. iv CHƯƠNG 1 TV N ....................................................................................... 1 1.1 T NG QUAN........................................................................................................ 1 1.2 M C TIÊU NGHIÊN C U ................................................................................... 1 CHƯƠNG 2 LƯ C KH O TÀI LI U .................................................................... 2 2.1 GI I THI U V CÂY D A ................................................................................. 2 2.2 GI I THI U V ENZYME TRONG D A........................................................... 3 2.2.1 Sơ lư c v h enzyme trong cây d a ................................................................... 3 2.2.2 Sơ lư c v enzyme bromelain ............................................................................. 4 2.2.3 C u t o và ho t tính chung c a enzyme bromelain .............................................. 5 i. C u t o ............................................................................................................. 5 ii. Ho t tính enzyme bromelain............................................................................. 6 2.2.4 Các y u t nh hư ng n ho t tính c a enzyme bromelain ................................ 7 i. nh hư ng c a nhân t nhi t ....................................................................... 7 ii. nh hư ng c a nhân t pH............................................................................... 8 2.3 GI I THI U V PH N NG ENZYME ............................................................. 9 2.3.1 ng hóa h c c a ph n ng cơ b n ..................................................................... 9 2.3.2 ng h c ph n ng enzyme .............................................................................. 10 2.4 GI I THI U SƠ LƯ C V CASEIN ................................................................. 11 2.5 SƠ LƯ C CÁC NGHIÊN C U V ENZYME BROMELAIN........................... 12 2.6 N I DUNG NGHIÊN C U ................................................................................ 13 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TI N VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U .................. 15 3.1 PHƯƠNG TI N NGHIÊN C U ......................................................................... 15 Trang ii Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  6. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ 3.1.1 Nguyên li u ...................................................................................................... 15 3.1.2 Hóa ch t thí nghi m ........................................................................................ 15 3.1.3 Thi t b thí nghi m .......................................................................................... 15 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U ........................................................................ 16 3.2.1 Phương pháp chu n b m u và hóa ch t nghiên c u .......................................... 16 3.2.2 B trí thí nghi m ............................................................................................... 17 CHƯƠNG 4 K T QU TH O LU N................................................................... 20 4.1 nh hư ng c a th i gian b o qu n d ch chi t t d a ch a bromelain qu nc tính enzyme ................................................................................................................ 20 4.2 Kh o sát nh hư ng c a pH và nhi t lên ho t tính xúc tác ph n ng th y phân c a enzyme bromelain qu trên cơ ch t là casein ........................................................ 22 CHƯƠNG 5 K T LU N VÀ NGH ................................................................. 26 5.1 K t lu n ............................................................................................................... 26 5.2 ngh ................................................................................................................ 26 TÀI LI U THAM KH O ........................................................................................ 27 PH L C .................................................................................................................... v Trang iii Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  7. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Các gi ng d a ăn qu ph bi n .................................................................................. 2 Hình 2: Qu d a (Ananase Comosus) .................................................................................... 3 Hình 3: Cách s p x p các amino acid trong phân t bromelain ..................................... 6 Hình 4: C u trúc phân t proteases cysteine ......................................................................... 6 Hình 5: Hình v minh h a s tác ng c a pHmôi trư lên ho t tính enzyme........................... 8 ng Hình 6: Sơ quy trình trích ly bromelain qu (thô) ............................................................ 16 Hình 7: Sơ chu n b dung d ch casein 1%........................................................................ 16 Hình 8: th bi u di n s thay i ho t tính c a enzyme bromelain trong d ch qu theo th i gian b o qu n ....................................................................................................................... 21 Hình 9: M u dung d ch chi t ch a enzyme bromelain qu sau 12 ngày b o qu n ................. 22 Hình 10: th bi u di n s nh hư ng tương tác c a pH và nhi t x lý lên ho t tính c a enzyme bromelain trong d ch qu d a .................................................................................. 23 Hình 11: th bi u di n s thay i ho t tính c a bromelain qu khi x lý các nhi t khác nhau............................................................................................................................. 24 Hình 12: th bi u di n ho t tính c a bromelain qu khi x lý các nhi t khác nhau pH th p ................................................................................................................................ 25 Hình 13. ư ng chu n tyrosine............................................................................................ vii DANH SÁCH B NG B ng 1: Thành ph n các acid amine trong casein ................................................................. 12 B ng 2: K t qu theo dõi ho t tính c a enzyme bromelain trong dung d ch d a tươi theo th i gian b o qu n ....................................................................................................................... 20 B ng 3: K t qu thí nghi m kh o sát s nh hư ng c a pH và nhi t môi trư ng x lý lên ho t tính c a enzyme bromelain qu .................................................................................... xii Trang iv Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  8. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ CHƯƠNG 1 TV N 1.1 T NG QUAN Kho ng 20 năm g n ây, v i hơn 400 tài nghiên c u, gi i khoa h c Châu Âu ã ưa ra m t khuy n cáo r ng “v i m t qu d a m i ngày, b n s không c n g p bác sĩ” (Harvey and Ross, 1985). Câu nói trên ã ư c khoa h c th c ti n xác minh là phù h p v i dư c tính c bi t c a qu d a. Qua nhi u nghiên c u cho th y qu d a loài Ananas có kh năng dư c lý cao là do trong thành ph n c a qu có h enzyme bromelain, hay còn g i là enzyme d a. Bromelain là tên g i chung c a m t nhóm enzyme th c v t, ư c tìm th y t nh ng cây d a loài Ananas, h Bromeliaceae. Enzyme này ã mang n cho gi ng d a Ananas s n i ti ng v kh năng dư c lý trong vi c ch a tr các b nh v ư ng tiêu hóa và gi m au, gi m sưng do viêm nhi m. V m t th c ph m, d a là m t lo i cây ăn qu có nhi u giá tr dinh dư ng và r t ư c ưa chu ng. V m t khoa h c, d a là m t ngu n th c v t ch a lo i enzyme c bi t có dư c tính cao. Trong ch bi n th c ph m t qu d a, v n t ra là c n quan tâm n s bi n i v thành ph n, giá tr dinh dư ng và h enzyme trong qu d a. V i vai trò không kém ph n quan tr ng, h enzyme trong qu d a cũng c n ư c quan tâm úng m c. Tuy nhiên, bi t ư c s bi n i v ho t tính c a h enzyme bromelain qu , c n ph i bi t quy lu t chung v ho t tính xúc tác c a chúng. Gi ng như các enzyme khác, ho t tính xúc tác c a enzyme “bromelain qu ” cũng ch u nh hư ng b i nhi u nhân t , trong ó nhân t pH và nhi t , là hai nhân t ư c quan tâm nhi u nh t trong quá trình ch bi n th c ph m t qu d a. T v n t ra trên, vi c nghiên c u kh o sát các nh hư ng c a pH và nhi t lên ho t tính xúc tác c a h enzyme bromelain trong qu d a là c n thi t, nh m t o ti n và cơ s cho vi c nghiên c u lâu dài v h enzyme này. 1.2 M C TIÊU NGHIÊN C U Kh o sát tác ng c a vi c x lý pH và nhi t lên ho t tính xúc tác c a enzyme bromelain qu trên cùng m t lo i cơ ch t. Trên cơ s ó, tìm hi u ư c quy lu t bi n thiên v ho t tính c a h enzyme này theo s thay i c a pH và nhi t ch bi n nh m ph c v cho công ngh ch bi n các s n ph m t d a. Trang 1 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  9. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ CHƯƠNG 2 LƯ C KH O TÀI LI U 2.1 GI I THI U V CÂY D A D a là lo i cây ăn qu nhi t i có ngu n g c t Nam M , ư c ưa t i các o khu v c Caribe nh nh ng th dân Anhdieng Carib. Năm 1493, Christopher Columbus l n u tiên ã nhìn th y các lo i cây c a chi này t i Guadeloupe. Ông ã em chúng v Châu Âu và t ây chúng ư c ngư i Anh và Tây Ban Nha phát tán t i các o trên Thái Bình Dương (Morrison, 1963). Năm 1813, các cánh ng tr ng d a thương ph m ư c thành l p t i Hawaii, Philippines, ông Nam Á, Florida và Cuba. D a ã tr thành m t trong 3 lo i cây ăn qu ph bi n nh t trên th gi i, sau chu i và các lo i qu h citrus (Anon, 1993). D a có tên khoa h c là Ananas comosus. Thu c loài Ananas, h Bromeliaceae. M t s gi ng d a tr ng ph bi n nh t hi n nay là gi ng Queen và Cayenne, tên khoa h c là Ananas comosus (Linnaeus) merril (Brasil). Ngoài ra, còn có m t s gi ng d a ăn qu ph bi n khác như Ananas sativus, Ananas bracteatur (Lindley) (Nam M ).. (Collin et al., 1931). D a Queen D a Cayenne Ru ng d a Hình 1: Các gi ng d a ăn qu ph bi n Hi n nay, trên th gi i cây d a ư c tr ng h u h t các nư c nhi t i như Philippines, Thái Lan, Malaysia, Brazil, Mexico, Cuba, Nam Phi..và m t s nư c c n nhi t i như o Hawaii, ài Loan.. nư c ta, d a tr ng t B c n Nam, di n tích tr ng c nư c hi n kho ng 40.000 ha v i s n lư ng kho ng 500.000 t n trong ó 90% là phía Nam. Các t nh tr ng d a nhi u mi n Nam là Kiên Giang, Ti n Giang, Cà Mau, C n Thơ, Long An… mi n B c có Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Giang, Phú Th ….mi n Trung có Ngh An, Qu ng Trang 2 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  10. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ Nam, Bình nh,… Năng su t qu bình quân m t năm các t nh phía B c kho ng 10 t n, phía Nam 15 t n/ha. D a là m t lo i qu nhi t i có giá tr dinh dư ng và giá tr năng lư ng cao. D a ư c s d ng trong ch bi n th c ph m và r t ư c ưa chu ng. Thành ph n hóa h c c a qu d a bao g m nư c (81 – 87%), sacharose (4,59 – 12%), glucose, fructose, vitamine nhóm B, vitamine C và các khoáng ch t Fe, Na, K, P, Mg.. Ngoài ra trong qu d a còn có m t h các acid h u cơ a d ng, t o nên v chua, thơm h p d n cho qu như acid citric (28 – 66% t ng lư ng acid trong qu ) (Gortner, 1963), acid ascorbic (t 200 – 710 mg/l) (Singleton, 1955), acid malic (18 – 30% t ng lư ng acid trong qu (Chan et al.,1973), acid oxalic, acid formic..Hàm lư ng acid trong qu thay i theo chín c a d a và chúng ư c ph n ánh b i thông s pH. Khi trái chín chuy n sang màu vàng, pH gi m xu ng t 3,9 – 3,7 (Teisson và Pineau, 1982). 2.2 GI I THI U V ENZYME TRONG D A 2.2.1 Sơ lư c v h enzyme trong cây d a Trong d ch chi t t thân cây d a và qu d a có m t h enzyme khá a d ng và ph c t p, chúng thay i trong su t quá trình phát tri n c a cây và qu d a. Gi ng như các lo i th c v t khác, h enzyme trong cây d a cũng bao g m nhi u nhóm enzyme v i các c tính khác nhau, trong ó, nhóm enzyme protease chi m a s . Protease trong d a g m có cysteine protease, ây là nhóm enzyme chính v i i di n là enzyme bromelain; ngoài ra còn có m t lư ng ít các enzyme peroxidase, amylase, cellulase, acid phosphatase. (Ngu n: http://www.greatvistachemicals.com/biochemicals/bromelain.html, truy c p ngày: 13/11/2006) - Enzyme peroxidase, t n t i và có ho t tính không i trong su t quá trình phát tri n c a qu . Tuy nhiên, trong qu chín lư ng enzyme này gi m d n, ch còn kho ng 1/3 so v i ban u (Gortner và Singleton, 1965). - Cysteine protease là nhóm enzyme proteolytic ch y u nh t ư c tìm th y trong d ch thân và qu d a. Protease trong qu xu t hi n t lúc b t u ra hoa, tăng d n v s lư ng trong su t th i kỳ phát tri n c a qu . giai o n qu chín, lư ng enzyme này cũng có xu hư ng gi m d n (Gortner và Singleton, 1965; Lodh et al., 1972). - T cây d a loài Ananas, ngư i ta ã tìm th y ư c có t i thi u 4 lo i cysteine protease khác nhau (Rowan et al., 1988). Protease hi n di n ch y u trong d ch t thân d a là bromelain thân, ngoài ra còn có ananain (EC 3.4.22.31) và Trang 3 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  11. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ comosain. Trong d ch qu d a, cysteine protease ch y u là bromelain qu . - T m t s nghiên c u khác, các nhà khoa h c còn tìm th y trong d ch t thân và qu c a m t lo i d a Bromelia pinguin (cùng h Bromeliaceae) cũng ch a enzyme protease tên là pinguinain (EC.3.4.99.18). Lo i này ch có m t s c tính c bi t và ho t tính hydrolase kém hơn so v i bromelain (Toro-Goyco et al., 1968). - T qu xanh c a gi ng Bromelia Hieronymi Mez, h Bromeliaceae, các nhà khoa h c ã tìm th y ư c m t lo i peptidase m i tên là Hieronymain I. Lo i enzyme này cũng ã ư c xác l p vào nhóm cysteine protease (Bruno M.A.; Pardo M.F.; Caffini N.O.; López L.M.I, 2003). Trong quá trình phát tri n c a cây và trái d a, d ch chi t thân và trái còn ch a m t s các enzyme dehydrogenase, synthase, pectin methyl esterase, pectin galactoronase nhưng v i s lư ng r t th p. 2.2.2 Sơ lư c v enzyme bromelain (bromeline) Enzyme bromelain l n u tiên ư c bi t n vào kho ng th k XIX. Năm 1892, nhà khoa h c Chittenden là ngư i u tiên ã tìm th y s hi n di n c a m t lo i enzyme có kh năng th y phân protein trong d ch c a cây và trái d a, Ananas Comosus (pineapple). Ông ã g i nó là “bromeline”. Sau này, thu t ng “bromeline” hay “bromelain” ã ư c dùng g i chung các enzyme th y phân protein (protease), ư c tìm th y t nh ng cây gi ng cây d a thu c cùng h Bromeliaceae. (Ngu n: http://en.wikipedia.org/wiki/bromelain, truy c p ngày: 15/12/2006) Bromelain hi n di n t t c các ph n c a cây d a, loài Ananas. Chúng chi m trên 50% protein trong thân d a và qu d a. Do ó enzyme bromelain còn ư c g i là “enzyme d a”. Tùy theo ngu n g c, bromelain ư c phân làm 2 lo i là bromelain thân (trích t d ch thân d a) và bromelain qu (trích t d ch qu d a) Trong công nghi p, ph n thân cây d a ư c dùng làm nguyên li u chính s n xu t ra enzyme bromelain thương m i, vì ây là ngu n nguyên li u d i dào c bi t là sau Hình 2: Qu d a mùa thu ho ch trái. (Ananase Comosus) Enzyme bromelain qu (EC 3.4.22.33) - Tên g i khác: bromelain qu , juice bromelain, bromelase, bromelain qu FA2. Trang 4 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  12. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ - Ho t tính: là m t endopeptidase, xúc tác ph n ng th y phân protein t i v trí b t kỳ trên m ch polypeptide. - Cơ ch t: th y phân cơ ch t t nhiên l n t ng h p tương t như bromelain thân.Tuy nhiên, bromelain qu ho t ng th y phân t t nh t trên cơ ch t t ng h p Bz-Phe-Val-Arg+NHMec, không ph n ng v i cơ ch t Z-Arg-Arg-NHMec như bromelain thân. (Ngu n:http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/enzymes/ec3/ec04/ec22/ec0033/index.html, truy c p ngày: 13/11/2006) Bromelain qu là m t protease acid, có phân t lư ng kho ng t 23 n 31 kDa tùy thu c vào k thu t phân tích c a phòng thí nghi m. Bromelain qu có i m ng i n pI = 4,6 khác bi t cơ b n v i bromelain thân v i pI = 9,6 (Yamada et al., 1976; Ota et al., 1985). 2.2.3 C u t o và ho t tính c a enzyme bromelain i. C u t o - Mã s enzyme Bromelain thân: E.C.3.4.22.32 Bromelain qu : E.C.3.4.22.33 (Ngu n: http://www.brenda.uni-koeln.de/information/all_enzymes.php4?ecno=3.4.22.33, truy c p ngày: 21/12/2006) - Tên g i khác: bromelin, bromeline, bromelain - Tên khoa h c và y h c : sulfuhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease - Tên thương m i : Bromanase (Kramer – Novis), Bromelain 2400 Maximum Strength (Vitalize Corp) Bromelain là m t thu t ng dùng chung ch các enzyme ư c tìm th y trong d ch chi t t cây d a, ch y u là các protease cysteine. Enzyme bromelain là m t protease-thiol. Trong trung tâm ho t ng c a bromelain có ch a cysteine. ây là m t amino acid có nhóm hóa h c ho t ng m nh là – SH (sulfuhydryl). Phân t có d ng hình c u do có cách s p x p ph c t p và trong m i phân t có t t c 5 c u n i disulfite. Bromelain thân và qu d a có thành ph n acid amine thay i khác nhau. Bromelain thân có kho ng 321 – 144 acid amin, còn bromelain qu thì có kho ng 283 – 161 acid amin. Bromelain thân là m t s i polypeptide có amino acid u amin là valine và Trang 5 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  13. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ u carbonyl là glycine. Bromelain qu có amino acid u amin là alanine. Khi phân tích c u trúc b c m t c a bromelain, Murachi và Busan nh n th y cách s p x p amino acid trong phân t bromelain như sau Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp – - Gly – Cys – Lys – Hình 3: Cách s p x p các amino acid trong phân t bromelain c Lư ng, 2004) (Nguy n ii. Ho t tính enzyme bromelain Enzyme bromelain có ba ho t tính khác nhau: peptidase, amydase và esterase. Bromelain xúc tác ph n ng th y phân trên nhi u cơ ch t và có th th y phân c cơ ch t t nhiên l n cơ ch t t ng h p như hemoglobin, casein, gelatin, BAA _ Benzoyl-L-Arginine amide, BAEE _Benzoyl-L- Arginine Ethyl Esther, BAEM _ Benzoyl-L-Arginine Methyl Esther…(Nguy n c Lư ng, 2004). Hình 4: C u trúc phân t Nhóm sulfuhydryl trong phân t c a enzyme óng vai trò proteases cysteine r t quan tr ng trong các ph n ng c a enzyme, là thành ph n tr c ti p tham gia các ph n ng xúc tác. Chúng có kh năng g n v i cơ ch t t o thành ph c ch t enzyme – cơ ch t. Chúng tham gia vào nhi u bi n i hóa h c như s ion hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa, alkyl hóa, t o thành các mercaptide, serine mercaptal, liên k t hydrogen và nh ng ph c h p chuy n i n tích. (Nguy n c Lư ng, 2004). Gi ng như papain, bromelain óng vai trò là m t endopeptidase, có kh năng tham gia xúc tác, y m nh ph n ng th y phân protein thành các oligopeptide và các amino acid. R R R ( - NH – CH – COOH )i + + H - OH (- NH – CH – CO – NH – CH – CO - )n R ( H2N – CH – CO - )k Enzyme bromelain n=k+i - i v i cơ ch t là casein, ho t tính phân gi i c a bromelain trong thân d a cao hơn bromelain trong qu xanh và qu chín. Trang 6 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  14. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ i v i cơ ch t t ng h p như BAA, 50C và pH = 6,0 thì ho t tính phân gi i c a - bromelain trong qu xanh cao hơn bromelain trong thân và qu chín (Nguy n c Lư ng, 2004). Ho t tính c a bromelain có th ư c xác nh theo các ơn v : ơn v Rorer, ơn v BTU ( ơn v bromelain tyrosine), ơn v CDU ( ơn v th y phân casein), ơn v GDU ( ơn v th y phân gelatin), ơn v MCU ( ơn v ông t s a)… Thông thư ng ngư i ta ánh giá ho t tính c a enzyme bromelain d a trên ơn v MCU ho c GDU. 1 GDU tương ương v i 1,5 MCU ( Ngu n: http://www.nowfoods.com/index.php, truy c p ngày: 12/12/2006) 2.2.4 Các y u t nh hư ng n ho t tính c a enzyme bromelain Gi ng như các c u trúc xúc tác sinh h c khác, ho t tính c a enzyme bromelain cũng ch u nh hư ng b i các y u t : Nhân t môi trư ng g m nhi t , pH, ion kim lo i..; Nhân t bên trong g m n ng enzyme, n ng cơ ch t, m t s nhóm ch c c a enzyme và tinh khi t c a enzyme. Các y u t nhi t , pH thích h p cho ho t ng xúc tác c a enzyme bromelain còn ph thu c l n nhau và ph thu c vào các y u t khác như cơ ch t, b n thân enzyme, th i gian ph n ng, s có m t c a các ch t ho t hóa.. Bromelain là m t enzyme có ngu n g c th c v t vì th tính ch t c a enzyme này s g n li n v i m t s tính ch t c a lo i th c v t ch a chúng. Trong s các tác nhân nh hư ng n ho t tính c a enzyme thì tác nhân v t lý là ư c quan tâm nhi u nh t b i các ng d ng c a nó trong th c ti n s n xu t, c bi t là s nh hư ng b i nhi t và pH c a môi trư ng x lý enzyme hay trong quá trình ch bi n lo i th c v t ch a chúng. nh hư ng c a nhân t nhi t i. Nhi t có nh ng nh hư ng nhi u m c khác nhau lên ho t tính c a enzyme. Enzyme có b n ch t là protein nên nó không b n dư i tác d ng c a nhi t , a s các enzyme b m t ho t tính trên 700C (Lê Ng c Tú, 2004). t 45 – 600C. Nhi t Enzyme bromelain có kh năng ho t ng trong kho ng nhi t quá cao s làm thay i c u trúc c a enzyme, phá v các liên k t trong phân t enzyme, làm thay i c u trúc không gian c a trung tâm ho t ng cysteine, làm v trí không gian c a nhóm – SH b bi n i nên enzyme không k t h p ư c v i cơ ch t. Nhi t quá th p ho c quá cao s làm phân t protein b bi n tính s làm gi m ho t tính c a enzyme (Ph m Thu Cúc, 1999). Trang 7 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  15. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ Bên c nh ó, nhi t c a ph n ng xúc tác còn ch u nh hư ng b i nhi u y u t , c bi t là th i gian ph n ng, th i gian tác d ng càng dài thì nhi t s có nh ng tác ng làm nh hư ng n ho t tính c a enzyme, n ng enzyme, n ng cơ ch t, d ng t n t i c a enzyme.. Theo nhi u nghiên c u cho th y n 600C thì bromelain v n còn - d ch chi t qu , (pH = 3,5), khi tăng nhi t lên ho t tính. - Bromelain tinh khi t nh y c m v i nhi t hơn 5oC, pH = 4 – 10, enzyme bromelain gi ho t tính t i a trên casein trong vòng 24 gi ; 55oC, pH = 6,1 ,enzyme bromelain b m t 50% ho t tính trong vòng 20 phút. - Quá trình ông khô, enzyme bromelain b m t 27% ho t tính (Nguy n c Lư ng, 2004) nh hư ng c a nhân t pH ii. Giá tr pH là y u t quan tr ng nh t nh hư ng n ho t tính xúc tác c a enzyme. Enzyme r t nh y c m v i s thay i pH c a môi trư ng. M i lo i enzyme thư ng ch ho t ng m nh nh t m t vùng pH xác nh g i là pH t i thích. . ho t pHt i thích ng c a enzyme pH t i thích pH Hình 5: Hình v minh h a s tác ng c a pH môi trư ng lên ho t tính enzyme c Lư ng, 2004) (Nguy n pH nh hư ng n ho t tính c a enzyme do pH làm thay i tr ng thái ion hóa c a enzyme và c a cơ ch t, ph c h p enzyme-cơ ch t. N u pH quá cao ho c quá th p s làm nh hư ng n i n tích và kh năng tích i n c a enzyme và cơ ch t, có th làm gi m ho c m t kh năng k t h p v i cơ ch t c a enzyme, do ó ho t tính enzyme s b gi m ho c th m chí m t h n. Trang 8 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  16. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ Bromelain có biên pH ho t ng khá r ng, chúng có kh năng ho t ng t t trong kho ng pH = 3 – 10. Tuy nhiên, kho ng pH t i thích c a enzyme bromelain l i là pH = 5 – 8. (Nguy n c Lư ng, 2004). Trong phân t enzyme bromelain, trung tâm ho t ng là cysteine, ch a nhóm hóa h c ho t ng m nh là – SH . Kh năng xúc tác c a nhóm cysteine là nh liên k t ng hóa tr ư c t o thành thioester gi a nhóm acyl c a cơ ch t và nhóm sulfuhydryl c a g c cysteine. Trong môi trư ng pH sinh lý (pH = 6 – 8), ph n l n các nhóm – SH tr ng thái không ion hóa và s t o thành liên k t hydro v i cơ ch t là do s tham gia proton c a nhóm – SH . Chính nhóm proton – SH s làm tăng m t i n tích xung quanh nguyên t lưu huỳnh (Lê Ng c Tú, 2004). Bên c nh ó pH còn nh hư ng b i nhi u y u t khác, m c nh hư ng c a pH môi trư ng lên enzyme tùy thu c vào nhi t , lo i cơ ch t, th i gian ph n ng, tinh khi t c a enzyme, b n ch t c a dung d ch m và s hi n di n c a ch t tăng ho t. 2.3 GI I THI U V PH N NG ENZYME Enzyme là m t ch t xúc tác sinh h c c hi u, có vai trò xúc tác các ph n ng sinh hóa di n ra trong cơ th s ng. V c u t o, enzyme có b n ch t là protein, trong phân t enzyme có m t ho c vài b ph n mang tính ch t c hi u, ch có b ph n này m i tham gia xúc tác ph n ng. B ph n này ư c g i là trung tâm ho t ng c a enzyme. Trong trung tâm ho t ng, có nh ng nhóm ch c hóa h c có ch c năng tr c ti p trong quá trình xúc tác ph n ng. T t c các ph n còn l i c a enzyme óng vai trò như m t cái khung, gi cho c u trúc không gian thích h p v i kh năng xúc tác c a enzyme. (Nguy n c Lư ng, 2004). 2.3.1 ng hóa h c c a ph n ng cơ b n T t c các ph n ng sinh hóa u có th di n ra v i s có m t hay không có m t enzyme. Thông thư ng, các ph n ng hóa h c ch có th x y ra khi phân t các ch t tham gia ph n ng ph i ti p xúc v i nhau v trí tham gia ph n ng và chúng ph i tr ng thái ho t ng. Mu n ho t hóa các phân t này c n cung c p cho chúng m t m c năng lư ng nào ó t n tr ng thái ho t hóa. Năng lư ng ó g i là năng lư ng ho t hóa. Khi có s tham gia c a enzyme, năng lư ng c n tr ư c h th p, nh v y s t o thành ph c h p enzyme – cơ ch t di n ra d dàng hơn. T c là i v i ph n ng có enzyme, ch c n m t m c năng lư ng nh cung c p cho h th ng thì ph n ng ã x y ra nhanh chóng. Vai trò xúc tác c a enzyme trong ph n ng hóa h c là khi có s tham gia c a các Trang 9 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  17. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ enzyme, cơ ch t ư c ho t hóa m nh, làm thay i tính ch t và c u trúc c a cơ ch t, t ó sinh ra các s n ph m m i c a ph n ng (Lê Ng c Tú, 2003). 2.3.2 ng h c ph n ng enzyme Năm 1913, hai nhà khoa h c Lenom Michealis và Maud Menten ã ưa ra mô hình ng h c gi i thích ph n ng ư c xúc tác b i enzyme và l p phương trình ph n ánh m i quan h gi a v n t c ph n ng v i n ng cơ ch t và enzyme. Theo mô hình này, enzyme (E) k t h p v i cơ ch t (S) t o thành ph c h p enzyme – cơ ch t (E – S). Ph c h p này s ư c chuy n hóa ti p t c t o thành s n ph m (P) và gi i phóng enzyme. Enzyme ư c gi i phóng s th c hi n ph n ng m i. Theo Michealis – Menten, cơ ch xúc tác t ng quát c a ph n ng có enzyme ư c trình bày theo sơ : K2 K1 E+S ES E+P K-2 K-1 Trong ó: K1, K-1, K2, K-2 là nh ng h ng s v n t c c a các ph n ng tương ng. K-1 có giá tr nh nh t. Ph n ng chuy n hóa cơ ch t thành s n ph m là quan tr ng nh t K2 ES E+P K 2 t l v i n ng ES: v = K2.[ES] (v: v n t c ph n ng) Khi n ng ES càng l n, v n t c ph n ng càng l n (Nguy n c Lư ng, 2004) Theo thuy t Mischaelis và Menten, cơ ch ph n ng có xúc tác c a enzyme x y ra qua ba giai o n: Giai o n m t: enzyme (E) s k t h p v i cơ ch t (S) t i v trí trung tâm ho t ng c a enzyme b ng các liên k t hóa h c, t o thành ph c h enzyme cơ ch t (E-S). giai o n này, các liên k t ư c hình thành thư ng là nh ng liên k t y u nên ph c h E – S thư ng không b n. Ph n ng t o ph c h này thư ng x y ra r t nhanh và c n có m t ít năng lư ng. Gi a E và S có năm lo i liên k t tham gia, m i lo i có c tính riêng và năng lư ng liên k t khác nhau, g m liên k t ph i trí, liên k t hydro, liên k t ion, liên k t k nư c l c Vander-Waals và liên k t do d ch chuy n i n t . Giai o n hai: khi t o thành ph c h E – S, dư i tác d ng c a enzyme, cơ ch t s b thay i v c u trúc không gian và m c b n v ng c a các liên k t bên trong phân t , d n t i s kéo căng và phá v các liên k t ng hóa tr tham gia Trang 10 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  18. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ ph n ng. Sau ó x y ra s thay i m t i n tích c a ph c h p E – S làm bi n d ng các liên k t gi a chúng, k t qu là cơ ch t ư c ho t hóa, d dàng tham gia ph n ng. Giai o n ba: ây là giai o n cu i cùng, s n ph m c a quá trình ph n ng ư c t o thành, enzyme tách ra và tr v tr ng tháng ban u, chu n b k t h p v i phân t cơ ch t khác. Quá trình ph n ng hoàn thành. (citied by P. R. Mathewson, 1998) 2.4 GI I THI U SƠ LƯ C V CASEIN xác nh ho t tính xúc tác c a m t lo i enzyme, i u quan tr ng nh t là l a ch n cơ ch t và phương pháp o ho t tính phù h p. Kh năng xúc tác c a enzyme ph thu c r t nhi u vào lo i cơ ch t. i tư ng nghiên c u ây là bromelain qu , cơ ch t ư c ch n là casein s a (ho c có th là d ng mu i caseinate). Casein là protein ch y u có trong s a, chi m kho ng 80% protein c a s a. Casein là m t trong nh ng protein có tính acid vì trong phân t c a chúng có ch a nhi u g c acid glutamic và acid aspartic. Các casein u có i m ng i n pI= 4,6. Casein không có c u trúc b c ba và b n nên không b bi n tính theo nh nghĩa mà b bi n i ph n l n do b th y phân b ng enzyme ho c do x lý nhi t, khi ó các liên k t peptide b c t t và hình thành nh ng nitro phi protein (các m ch peptide ng n, acid amine t do, mu i amonium..). Các mu i caseinate thì b n v i nhi t và tan trong nư c t t hơn. Casein trong s a g m b n d ng chính: α (s1) và α (s2)-casein, β-casein, κ-casein. (Lê Văn Vi t M n, 2004) α (s1)-casein: phân t lư ng kho ng 23000 Da, có 199 g c acid amine. Do s phân b các ph n tích i n và các ph n ưa béo không ng u nên các phân t lo i này có tính ch t lư ng c c, 1 u ưa nư c, 1 u k nư c. α (s2)-casein: phân t lư ng kho ng 25000 Da, có 207 g c acid amine, có tính ưa nư c cao nh t trong các lo i casein do phân t c a nó ch a nhi u nhóm phosphoryl và g c cation nh t. β-casein: phân t lư ng kho ng 24000 Da, có 209 g c acid amine, có tính ưa béo cao nh t. Dư i 40C, β-casein hoàn toàn b kh trùng h p do có nhi u tương tác ưa béo b phá h y. κ-casein: phân t lư ng kho ng 19000 Da, có 169 g c acid amine. Lo i này ch ch a m t g c phosphoryl và cũng có tính lư ng c c. u amino c a phân t protein thì ưa béo còn u carboxyl thì ưa nư c. Trang 11 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  19. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ Casein trong s a có ngu n g c t nh ng ch ng bò khác nhau thì có th có c u trúc b c m t khác nhau. Tuy nhiên c u trúc b c m t c a cùng m t lo i casein ch khác nhau b i vài g c acid amine trong phân t protein c a chúng (Lê Ng c Tú, 2003). B ng 1: Thành ph n các acid amine trong casein Acid amine T l (%) Glutamic Acid 20,2 % Proline 10,2 % Leucine 8,3 % Lysine 7,4 % Valine 6,5 % Aspartic Acid 6,4 % Serine 5,7 % Tyrosine 5,7 % Isoleucine 5,5 % Phenylalanine 4,5 % Threonine 4,4 % Arginine 3,7 % Histidine 2,8 % Alanine 2,7 % Methionine 2,5 % Glycine 2,4 % Tryptophan 1,1 % Cystine 0,3 % Ngu n: http://www.casein.com/products.htm, truy c p ngày: 16/12/2006 2.5 SƠ LƯ C CÁC NGHIÊN C U V ENZYME BROMELAIN Shoshi et al. (1975) ã nghiên c u v s bi n i v thành ph n hóa h c c a bromelain thân I-1 và bromelain qu A dư i s tác ng c a 2-hydroxy-5-5-nitrobenzyl Bromide, tetra nitromethane và H2O2. K t qu nghiên c u cho th y, dư i tác ng c a các h p ch t trên, enzyme bromelain b bi n i m nh v c u trúc, thành ph n các acid amine trong phân t , trong kho ng pH và nhi t nh t nh. (Ngu n: http://www.brenda.uni-koeln.de/information/all_enzymes.php4?ecno=3.4.22.33, truy c p ngày: 15/03/2007) Trang 12 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
  20. Lu n văn T t nghi p khóa 28 - 2007 Trư ng i h c C n Thơ Yamada, Takahashi và Murachi (1976), ã tinh ch và nh tính ư c m t lo i protease t qu d a, tên là bromelain qu FA2. K t qu nghiên c u cho th y, s bi n i c a enzyme này s sinh ra chu i amino acid cu i cùng là Ala – Val – Pro – Gln – Ser – Ile – Asp – Trp – Arg – Asp – Tyr – Gly – Ala Thành ph n amino acid c a FA2 không khác bi t nhi u so v i bromelain thân, tuy nhiên v c u t o FA2 có ít hơn v t ng lư ng lysine và alanine so v i glycine như bromelain thân nên có th k t lu n FA2 không ph i là m t glucoprotein. (Ngu n: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=956152&d opt=Abstract, truy c p ngày: 12/03/2007) Waliszewski và Corzo (2004) cũng ã nghiên c u v ái l c xúc tác c a enzyme bromelain qu d ng thô trên nh ng cơ ch t protein khác nhau. Nghiên c u ã th c hi n v i d ch qu d a b n m c chín khác nhau trên năm loai cơ ch t g m azocasein, azoalbumine, hemoglobin, natricaseinate và casein. S n ph m t o thành ư c xác nh b ng phương pháp quang ph . Nghiên c u ã ưa ra k t lu n v kho ng pH và nhi t t i thích i v i ho t tính xúc tác c a bromelain qu trên t ng lo i cơ ch t trên. (Ngu n: http://www.ift.confex.com/ift/2004/techprogram/paper26158.htm, truy c p ngày: 15/03/2007) Bên c nh ó, Andrew et al. (1990) cũng ã ti n hành nghiên c u v nhóm các enzyme cysteine proteinase c a cây d a và các nghiên c u v nh hư ng c a pH và nhi t lên ho t tính xúc tác c a bromelain qu , comosain và pinguinain trên các lo i cơ ch t t ng h p, s d ng phương pháp quang ph xác nh s n ph m t o thành. M t ph n k t qu nghiên c u cho th y trong thân d a có t i thi u b n lo i cysteine protease trong khi trong qu d a ch ch a 2 lo i là bromelain thân và bromelain qu v i bromelain qu là ch y u. V i cơ ch t t ng h p, ho t tính c a các cysteine proteinase này là th hi n m nh nh t. trong nư c, Ph m Th Trân Châu và c ng s cũng nghiên c u m t s tính ch t c a bromelain tách t ch i d a tây cho th y trong ch i d a, bromelain có ho t tính c c i t i thích là 600C. pH = 6,5 nhi t Trang 13 Ngành Công Ngh Th c Ph m - Khoa Nông Nghi p Và Sinh H c ng D ng
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược