1. Trang Chủ
  2. Ngư nghiệp
  3. Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus)

Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus)

Nghiên cứu được thực hiện để xác định đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) nuôi ở các tỉnh phía bắc Việt Nam. Vietnam J. Agri. Sci. 2020, Vol. 18, No. 2: 94-104 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2020, 18(2): 94-104 www.vnua.edu.vn ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ VÀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ NHEO MỸ (Ictalurus punctatus) Trương Đình Hoài1*, Kim Văn Vạn1, Đào Lê Anh2,

Thể loại Tài liệu miễn phí Ngư nghiệp

Số trang 11

Ngày tạo 7/8/2020 12:35:29 PM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 27.04 M

Tên tệp

Tải Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn ... (.pdf)

Xem mẫu

  1. Vietnam J. Agri. Sci. 2020, Vol. 18, No. 2: 94-104 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2020, 18(2): 94-104 www.vnua.edu.vn ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ VÀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ NHEO MỸ (Ictalurus punctatus) Trương Đình Hoài1*, Kim Văn Vạn1, Đào Lê Anh2, Nguyễn Thị Huyên2, Nguyễn Văn Tuyến1, Vũ Đức Mạnh1, Nguyễn Thị Hương Giang2, Trương Quang Lâm2, Nguyễn Thị Lan2 1 Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2 Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: tdhoai@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 28.10.2019 Ngày chấp nhận đăng: 24.02.2020 TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện để xác định đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) nuôi ở các tỉnh phía bắc Việt Nam. Để thực hiện nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thu thập và phân tích mẫu cá nheo Mỹ bệnh, xác định các triệu chứng, các đặc điểm bệnh lý đại thể và vi thể thông qua phương pháp quan sát lâm sàng và phương pháp mô bệnh học và ứng dụng PCR trong chẩn đoán khẳng định mầm bệnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy cá bệnh có triệu chứng bơi lờ đờ, mang nhiều nhớt, xuất huyết nắp mang, các gốc vây và hậu môn. Các đặc điểm bệnh lý đại thể của cá bị bệnh gồm gan, thận có các đốm mủ màu trắng, thành ruột và biểu mô xuất huyết nặng. Kết quả giám định bằng PCR cho thấy cá bị bệnh do nhiễm E. ictaruli. Kết quả nghiên cứu mô bệnh học chỉ ra rằng mô mang, gan, thận và ruột bị tổn thương nghiêm trọng nhất. Mang cá tăng sinh và xuất huyết, trong khi gan và thận cá bị hoại tử, cấu trúc lỏng lẻo, giảm số lượng tế bào và xuất huyết. Từ khóa: Edwardsiella ictaluri, bệnh lý, PCR, cá nheo Mỹ. Pathological characterization and PCR application for diagnosis Edwardsiella ictaluri infecting Channel catfish (Ictalurus punctatus) ABSTRACT This study was conducted to determine the pathological characteristics and to apply PCR method to diagnose the disease caused by Edwardsiella ictaluri for Channel catfish (Ictalurus punctatus) in Northern provinces of Vietnam. The infected Channel catfish was collected and determined the clinical symptoms, gross features and microscopic lesions using through clinical observation and histopathological methods. Subsequently, PCR method was applied to confirmed the pathogen. The results revealed that the diseased fish exhibited the symptoms of lethargy swimming, mucus in the gills, haemorrhage of gill operculum, fins, anus. The liver and kidneys contained white spots, intestinal walls and epithelial cells were severe haemorrhage. The evaluation by PCR showed that all affected fish was infected with E.ictaluri. Histopathological examination revealed that the gill tissue, liver, kidney, and intestines were the most severely damaged organs. Gills exhibited the hyperplasia and hemorrhage, while liver and kidneys are necrosis and loose structure, decreasing cells and severed haemorrhage. Keywords: Ewardsiella ictaluri, pathoglogy, PCR, Channel catfish. và hơn 45 loài, chúng sống trong môi trường nước 1. ĐẶT VẤN ĐỀ ngọt ở sông, hồ và ao. Chúng chịu được ngưỡng Cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus, biến đổi môi trường khá rộng, nhiệt độ thích hợp Rafinesque, 1818) có tên tiếng anh là Channel là 24-30C nhưng có thể chịu rét tốt (Gatlin & catfish, đây là loài cá bản địa của Châu Mỹ, phân Stickney, 1982). Ngày nay, cá nheo Mỹ đã có ở bố ở phía nam Canada và phía đông bắc Mỹ cũng trên 35 quốc gia trên thế giới di nhập và phát như phía bắc của Mexico. Cá nheo Mỹ gồm 7 họ triển. Loài cá này trở thành một đối tượng thủy 94
  2. Trương Đình Hoài, Kim Văn Vạn, Đào Lê Anh, Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Văn Tuyến, Vũ Đức Mạnh, Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan sản quan trọng của thế giới. Cá nheo Mỹ được 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU nuôi nhiều nhất ở Trung Quốc với sản lượng trung bình 255.000 tấn/năm (FAO, 2014). 2.1. Vật liệu nghiên cứu Loài cá này được du nhập vào miền Bắc Mẫu cá nheo Mỹ thương phẩm bị bệnh (kích Việt Nam từ năm 2010. Đây là loài cá có giá trị cỡ 0,5-1,7kg) được thu từ các hộ nuôi cá ao, cá dinh dưỡng cao, thịt cá thơm ngon, bổ dưỡng, lồng khu vực phía bắc Việt Nam. Môi trường nhiều khoáng chất canxi, phốt pho, sắt, vitamin. Tryptic soya broth và Tryptic soya Agar- (TSB Từ năm 2013, loài cá này được nuôi thử nghiệm và TSA; Merck). Bộ thuốc nhuộm vi khuẩn ở nhiều tỉnh miền Bắc cho kết quả tốt, cá có thể Gram (Merck); Kit chiết tách DNA thương mại sinh trưởng và phát triển tốt ở điều kiện tự QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN), GoTaq PCR nhiên ở Việt Nam (Kim Văn Vạn, 2017). Hiện green (Promega) và các hóa chất, máy móc, thiết nay, nhiều cơ sở sản xuất giống cá nước ngọt đã bị trong phòng thí nghiệm phục vụ chạy PCR, có thể chủ động sản xuất giống cá nheo Mỹ và làm tiêu bản mô học, phân tích kết quả và một nuôi dưới nhiều hình thức như nuôi ghép, nuôi số trang thiết bị dụng cụ cần thiết khác. thâm canh, nuôi lồng hay nuôi ở hệ thống nước chảy. Do vậy, sản lượng loài cá này càng ngày 2.2. Phương pháp nghiên cứu càng tăng nhanh và cung cấp một lượng lớn 2.2.1. Địa điểm và phương pháp thu mẫu thực phẩm cho người tiêu dùng, mang lại thu Để thực hiện nghiên cứu này, chúng tôi đã nhập cao cho người nuôi. tiến hành thu thập 70 mẫu cá bị bệnh từ các hộ Tuy nhiên, dịch bệnh trên cá nheo Mỹ diễn nuôi cá nheo Mỹ ở Lý Nhân - Hà Nam (32 mẫu), biến khá phức tạp, gây khó khăn và thiệt hại Lương Tài - Bắc Ninh (22 mẫu), Ân Thi - Hưng lớn cho người nuôi, các bệnh thường gặp gồm Yên (16 mẫu). Thời gian thu thập từ tháng 3 - xuất huyết, lỡ loét, bệnh nội và ngoại ký sinh tháng 11 năm 2019. Mẫu được vận chuyển về và (De la Cruz & cs., 2017; Hoai & cs., 2019; phân tích tại phòng thí nghiệm Bệnh thủy sản, Wagner & cs., 2002). Những năm gần đây bệnh Khoa Thủy sản - Học viện Nông nghiệp Việt gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Nam bằng phương pháp vận chuyển kín. gây ra trên cá nheo Mỹ nuôi ở Việt Nam đã được ghi nhận và bệnh gây thiệt hại rất lớn cho người 2.2.2. Quan sát lâm sàng nuôi. Tuy nhiên đặc điểm về bệnh gan thận mủ Cá được phân tích ngay sau khi chuyển tới trên cá nheo Mỹ đặc biệt là các đặc điểm lâm phòng thí nghiệm. Các triệu chứng lâm sàng sàng, đặc điểm mô bệnh học, phương pháp chẩn được quan sát và ghi chép cẩn thận. Sau đó, tiến đoán bệnh gan thận mủ cho đối tượng nuôi này hành giải phẫu cá bằng dao kéo tiệt trùng để vẫn chưa được nghiên cứu sâu. Các nghiên cứu thu thập bệnh tích đại thể, nuôi cấy và phân lập trước đây về bệnh mủ gan tập trung trên cá tra vi khuẩn theo mô tả của Hoai & cs. (2019), thu và basa ở miền Nam, bệnh do vi khuẩn mẫu mô để làm tiêu bản mô bệnh học theo mô E. ictaluri gây ra hao hụt có thể lên đến 90% tả của Hoai & cs. (2014). (Crumlish & cs., 2002; Dung & cs., 2008). Với sự phát triển ngày càng mạnh mẽ của cá nheo Mỹ 2.2.3. Phân lập vi khuẩn gây bệnh ở các tỉnh Miền Bắc và Bắc Trung bộ, cùng với Dùng que cấy vô trùng thu mẫu vi khuẩn từ tình trạng ô nhiễm môi trường nước, bệnh gan tiền thận cá bị bệnh, nuôi cấy vi khuẩn trên môi thận mủ có thể diễn biến phức tạp trong thời trường TSA và TSA bổ sung 5% máu cừu. Vi gian tới và có thể gây thiệt hại cho người nuôi. khuẩn được nuôi cấy ở nhiệt độ 28C. Các mẫu Do vậy, cần có các nghiên cứu liên quan đến tác bệnh có nhiễm khuẩn được quan sát hình dạng, nhân, đặc điểm bệnh lý và phương pháp chẩn màu sắc, kích thước khuẩn lạc. Trong trường đoán bệnh để góp phần giúp người nuôi sớm hợp có sự hiện diện của nhiều hơn 1 loại khuẩn nhận dạng, đề ra các biện pháp phòng trị bệnh lạc, xác định loại khuẩn lạc chiếm ưu thế và loại hiệu quả và giảm thiểu thiệt hại trong tương lai. thiểu số để sơ bộ xác định loại khuẩn lạc nào là 95
  3. Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) tác nhân chính, nhuộm Gram theo hướng dẫn Chu trình nhiệt được thực hiện gồm 3 bước của nhà sản xuất kit nhuộm Gram (Merck) để bao gồm: Tiền biến tính ở nhiệt độ 94°C trong 2 xác định đặc tính. Các chủng vi khuẩn phân lập phút; Chu kỳ lặp lại 30 lần: Biến tính ở nhiệt độ được sử dụng để thử đặc tính sinh hóa bằng kit 95°C trong 30 giây, gắn mồi ở 53°C trong 45 giây, API 20E theo hướng dẫn của nhà sản xuất tổng hợp kéo dài ở 72°C trong 30 giây; Hoàn (BioMerieux, Pháp) và bảo quản trong môi thành ở 72°C trong 7 phút. Sản phẩm PCR được trường TSB bổ sung 20% glycerol (v/v) và giữ ở điện di trên gel 1,2% (TBE 1X) với thang DNA tủ âm sâu (-80C). chuẩn 100bp (marker). Sử dụng nguồn điện di ở hiệu điện thế 100V, cường độ 100mA, thời gian 2.2.4. Giám định vi khuẩn gây bệnh bằng chạy điện di trong 30 phút. Sản phẩm PCR nếu phương pháp PCR dương tính sẽ cho vạch sáng 407bp. DNA từ vi khuẩn (n = 70) được tách chiết theo phương pháp sử dụng kit chiết tách DNA 2.2.5. Thu mẫu mô, làm tiêu bản và phân thương mại QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). tích biến đổi mô bệnh học Quy trình chiết tách DNA được thực hiện theo Các cơ quan và bộ phận của 14 cá bị bệnh hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng PCR gan thận mủ được chọn ngẫu nhiên từ số bị dùng để giám định các chủng phân lập sử dụng bệnh gan thận mủ (đã được khẳng định bằng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gene 16S PCR) và 1 cá khỏe mạnh (mẫu đối chứng) được rRNA của vi khuẩn Edwardsiella ictaluries tiến hành làm tiêu bản mô học. Mang, gan, EiFd-1 (Forward) 5’- GTAGCAGGGAGAAAGCT thận, ruột của cá bị bệnh được thu và cố định TGC - 3’ và EiRs-1 (Reverse) 5’- GAACGCTATT trong dung dịch buffer formalin 10%, sau đó AACGCTCACACC - 3’ (Panangala & cs., 2007). được đúc parafin, cắt mô và nhuộm Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 5,5 Hematoxyline và Eosin (HE) theo quy trình và nuclease-free water; 12,5µL 2X Go Taq green phương pháp của Mumford & cs. (2007). Các master mix (Promega); 1µL Mồi ngược (10 mẫu mô được phân tích đặc điểm bệnh lý vi thể pmole EiFd-1-F); 1µL mồi xuôi (10 pmole EiFd- ở độ phóng đại 40, 100 và 400 lần để phát hiện 1-R) và 5µL khuôn mẫu DNA. Đối chứng dương và so sánh các biến đổi mô học. sử dụng trong phản ứng PCR là chủng Edwardsiella ictaluri LMG 7860, đây là chủng 2.3.6. Xử lý số liệu đối chứng dương chuẩn quốc tế phân lập từ cá Tỷ lệ xuất hiện các triệu chứng, bệnh tích nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) được cung cấp từ của cá bệnh được thu thập và tính toán bằng Viện Nuôi trồng thủy sản II. phần mềm Microsoft Excel 2010. Bảng 1. Triệu chứng và bệnh tích của cá nheo Mỹ bị bệnh gan thận mủ (n = 70) Triệu chứng và bệnh tích cá bị bệnh Số cá có triệu chứng/bệnh tích Tỷ lệ (%) Triệu chứng Cá bỏ ăn, bơi lờ đờ 70 100 Mang có nhiều nhớt 60 85,7 Nắp mang xuyết huyết 48 68,5 Sưng và xuất huyết lỗ hậu môn 44 62,8 Gốc vây ngực xuất huyết 40 57,1 Thân bị lở loét 12 17,1 Bệnh tích Gan, thận có các đốm mủ trắng 70 100 Xuất huyết ruột 58 82,8 Bụng chứa nhiều dịch vàng 44 62,8 Thận sưng 36 51,4 96
  4. Trương Đình Đình Hoài, Kim V Văn Vạn, n, Đào Lê Anh, Nguy Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Nguy n Văn Tuyến, Tuy Vũ V Đức Mạnh,nh, Nguy Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Nguy Thị Lan 3. KẾT T QU QUẢ VÀ TH THẢO LUẬN nhớớt và xuấtt huy huyết nắp p mang chiếm chi tỷỷ lệ cao và là các triệu tri u ch chứng thường ng thấy th ở cá bịb bệnh. 3.1. Đặc c đi điểm bệnh nh lý c của a cá c nheo Mỹ ỹ bị Giảải phẫu u cá bbị bệnh nh cho thấy th y gan thận th có các bệnh nh gan th thận mủ đốmm hoại ho tử màu tr trắng ng có thể th quan sát rõ trên Kiểm m tra 70 mẫu u cá thu từ ừ các hộ nuôi có bề mặtt gan và th thận. Các đốm đ mủ này mềm,m dấu hiệu bị bệnh gan th thận mủ cho thấy th y cá nheo nhũn, mộtm số đ đốm mủ dễ vỡ ra nhiều u dịch d khi Mỹ mắcc bbệnh có biểu u hi hiện triệuu chứng ch ng như b bỏ tác động đ nhẹ và đ đồng ng nhất nh t khi quan sát trên ăn, bơi llờ đờ,, mang nhi nhiềuu nhớt, nh xuấtt huy huyết kính hiển hi vi. RuRuột xuất huyết huy t và xoang bụng b có xương nắắpp mang và các g gốcc vây, ngoài ra hi hiện nhiều nhi dịch ch vàng cũng chi chiếm m tỷt lệ khá cao (Bảng (B tượng xuấất huyếtt và llở loét trên da cũng thư thường 1). Các triệu u chchứng, bệnh nh tích đại đ i thể th của cá xuất hiện n.. Trong đó, cá b bỏ ăn, bơi lờ l đờ,, ng ngửa nheo MỹM bị bệnh nh gan th thận n mủ m và tỷ lệ % xuất bụng trướớc khi chết, t, cá b bị xuấtt huyết huy gốcc vây, hiệnn từng t triệệu chứng, bệệnh tích cụ ụ thể được sưng và xuxuất huyếtt llỗ hậu u môn, mang nhi nhiều trình ở bảng 1, hình 1 và hình 2. Ghi chú: A - Cá bơi lờ đ đờ, ngửa bụng ng trong lồng l ng nuôi; B - Mang nhiều nhi nhớớt, xuất huyết ết trên gốc g c vây; C - Mang nhiều nhớt, t, xương n nắpp mang xu xuấtt huyết; huy D - Xuất ất huy huyết lỗ hậu u môn. Hình 1.. Triệu Tri chứng ng cá nheo M Mỹỹ bị bệnh nh gan th thận mủ ủ Ghi chú: A - Bụng ng tích nư nướcc vàng, gan có nhiều đốm ốm m mủ trắng; ng; B, C - Gan xu xuất hiện nhiềm m đốm đ mủ, xuất huyết, tụ huyết; D- Th Thậnn sưng, nhi nhiều đốm mủ trắng, tr xuấtt huy huyết và tụ huyết; huy E, G - RuRuột xuất huyết, ết, niêm mạc m c xuất xu huyết. Hình 2. Bệ ệnh nh tích cá nheo Mỹ bị b bệnh nh gan th thận mủ 97
  5. Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) Theo người nuôi cá nheo Mỹ, cá bị bệnh gan 3.3. Kết quả phân lập, kiểm tra đặc điểm thận mủ rất khó phát hiện sớm, vì các triệu sinh hóa và giám định vi khuẩn bằng chứng bệnh bên ngoài không đặc trưng, người phương pháp PCR dân chỉ phát hiện được bệnh khi cá bắt đầu có hiện tượng chết rải rác, mổ khám mới nhận diện Vi khuẩn nuôi cấy từ cá bị bệnh trên môi được bệnh. Trong quá trình thu mẫu ở 3 tỉnh trường nuôi cấy phần lớn đều có hình dạng là cho thấy bệnh gan thận mủ ở cá nheo Mỹ các khuẩn lạc nhỏ, không nhân, phát triển sau thường xuất hiện rải rác quanh năm, bệnh xuất 48h ở môi trường TSA và phát triển nhanh hơn hiện từ tháng 3 đến tháng 11 hàng năm, tập (24h) ở môi trường TSA có bổ sung 5% máu cừu. trung nhiều ở các tháng mùa hè nắng nóng từ Các khuẩn lạc có màu trắng hơi đục, rìa bằng, tháng 6-9. Theo Francis-Floyd & cs. (1987), vi hơi lồi (Hình 3A). Kết quả nhuộm Gram cho khuẩn phát triển và gây bệnh ở nhiệt độ từ 17 thấy vi khuẩn hình que, thon mảnh, tròn hai đến 32C, nhưng cá có triệu chứng bệnh rõ khi đầu và bắt màu Gram âm (Hình 3B). Khoảng nhiệt độ nước >22C và có thể gây bùng phát 3% khuẩn lạc còn lại có kích thước khá lớn, khi dịch bệnh khi nhiệt độ nước nuôi dao động xung nhuộm gram bắt màu Gram âm, dạng trực quanh 28C. Điều nay cũng hoàn toàn phù hợp khuẩn. Các vi khuẩn này có thể là Aeromonas với đặc điểm phát triển của bệnh gan thận mủ ở cá nheo Mỹ ở miền Bắc Việt Nam, từ tháng 11 spp. và đây là vi khuẩn cơ hội trong môi trường năm trước đến tháng 3 năm sau, nhiệt độ nước nước và thường có trong cơ thể cá nên rất dễ bắt thấp, do vậy bệnh ít xuất hiện. Trong khi tháng gặp khi phân lập vi khuẩn từ cơ thể cá (Wang & 6-9 là thời điểm nắng, nhiệt độ cao và là điều Silva, 1999). Với tỷ lệ phần trăm khuẩn lạc xuất kiện cho vi khuẩn phát triển và gây bùng phát hiện trên đĩa thạch cho thấy vi khuẩn có khuẩn dịch bệnh. lạc nhỏ là tác nhân chính gây bệnh. Các chủng Hiện nay, một số tác nhân gây bệnh có thể vi khuẩn này đã được nuôi cấy thuần, thử đặc gây ra hiện tượng đốm mủ trắng trên nội tạng tính sinh hóa và tăng sinh để phục vụ giám cá da trơn, do vậy cần phân biệt để chẩn đoán định bằng PCR. đúng tác nhân gây bệnh. Bệnh gan thận mủ Các chủng vi khuẩn (n = 70) được đánh giá trên cá tra chủ yếu do E. ictaluri (Crumlish & là tác nhân gây bệnh gan thận mủ cho cá nheo cs., 2002; Dung & cs., 2008), trong khi đó theo Mỹ đã được nuôi cấy thuần để xác định sử dụng Đặng Thị Hoàng Oanh & Nguyễn Trọng nghĩa cho các thử nghiệm tiếp theo. Kết quả phản ứng (2016) tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá sinh hóa sử dụng API 20E cho thấy các chủng vi lóc (Channa striata) nuôi ở đồng bằng sông cửu long là Aeromonas schubertii. Ngoài ra một số khuẩn phân lập có khả năng thủy phân lysine đốm trắng trên gan, thận cá da trơn có thể do (dương tính LDC) và ornithine (dương tính bào tử sợi Myxobolus sp. gây ra (Đồng Thanh ODC), có khả năng lên men và oxy hóa đường Hà, 2009). Theo Đồng Thanh Hà (2009) bệnh (dương tính D-glucose), 17/20 phản ứng còn lại gan thận mủ trên cá tra do E. ictaluri thường cho kết quả âm tính. Kết quả này hoàn toàn gây ra các đốm mủ nhỏ, kích thước 1-2mm, phù hợp với đặc tính sinh hóa của E. ictaluri trong khi cá bị bệnh, các đốm trắng lớn thường theo mô tả của Hawke (1979) ở cá nheo mỹ và do bào nang bào tử sợi gây ra. Tuy nhiên, theo của Đặng Thị Hoàng Oanh & Nguyễn Trúc quan sát của chúng tôi, cá nheo Mỹ bị bệnh gan Phương (2010) (Bảng 2). thận mủ, các đốm mủ này có kích thước dao Kết quả giám định các chủng vi khuẩn bằng động lớn, từ 1-8mm và hoàn toàn không có sự xuất hiện của bào tử sợi. Đặc điểm khác biệt về phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu EiFd- kích thước đốm mủ này có thể do sự khác biệt về 1F/EiFd-1R để phát hiện DNA của vi khuẩn loài cá nheo Mỹ và cá tra, ngoài ra có thể có sự E. ictaluri cho thấy 100% chủng đều cho kết quả khác biệt về chủng vi khuẩn gây bệnh và giữa PCR dương tính với DNA của vi khuẩn điều kiện môi trường giữa 2 miền Nam và Bắc E. ictaluri và cho sản phẩm PCR có độ dài mà biểu hiện bệnh ở 2 loài cá là khác nhau. 407bp (Hình 4). 98
  6. Trương Đình Đình Hoài, Kim V Văn Vạn, n, Đào Lê Anh, Nguy Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Nguy n Văn Tuyến, Tuy Vũ V Đức Mạnh,nh, Nguy Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Nguy Thị Lan Bảng ng 2. Kếtt qu quả thử sinh hóa các ch chủng Edwardsiella ictaluri phân lập l từ cá bệnh b Các ch chỉ tiêu sinh hóa Các chủng ch ng vi khu khuẩn phân lập p cá bệnh b (n = 70)) Edwardsiella ictaluri CAF255* Nhuộm m gram - - Hình dạng ng Trực khuẩn Trực khuẩn n Tính di động ng + + ONPG - - ADH - - LDC + + ODC + + Citrate utilization - - H2S Production - - Urease - - TDA - ND Indole production - - Voges-Proskauer Proskauer - - Gelatin - - Tạo axit từ ừ D-glucose glucose + + D-mannitol mannitol - - Inositol - - D-sorbitol sorbitol - - L-rhamnose rhamnose - - D-sucrose sucrose - - D-melibiose melibiose - - Amygdalin - - L-arabinose arabinose - - Ghi chú: * - Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Nguy n Trúc Phương (2010); ND - Không xác đ định nh. Hình 3. Hình d dạạng khuẩn n lạc l c và nhu nhuộm m gram chủng ch ng vi khu khuẩn E. ictaluri Ei-VN19 VN19-6 thu từ t cá nheo MMỹ bị bệnh nh gan thận th n m mủ 99
  7. Đặc điểm mbbệnh lý và ứng ng d dụng phương ng pháp PCR ch chẩn đoán bệnh nh gan thận th mủủ trên cá nheo Mỹ M (Ictalurus Ictalurus punctatus) punctatus Ghi chú: M: Marker; Gi Giếng 1-7: 7 chủ ủng vi khuẩn nđđại diện n thu từ t cá nheo bịị bệnh; Giếng ng 8: Đối chứng ng âm; Giếng ng 9: Đ Đối chứng ng dương ch chủng ng vi khuẩn khu n E. ictaluri LMG 7860. Hình 4. Kếtt qu quả chạy y PCR 7 chủng ng vi khu khuẩn n đại đ diện n phân llập từ ừ cá nheo Mỹ M bị bệ ệnh gan thậ ận mủ Từ các đđặcc tính hình thái khuẩn khu lạc, kếtt qu quả mang cá khỏe kh e các tơ mang sơ cấp, c thứứ cấp và số nhuộm m Gram và k kếtt qu quả giám định nh bằng b ng PCR, có lượng ng các tế t bào mang phân bố b đều,u, không gian thể nói rằ ằng ng cá nheo M Mỹ bị bệnhnh gan thận th mủ ủ do giữaa các tơ mang th thứ cấpp rõ và nhiềnhiều khoảng E. ictaluri gây ra. Theo Waltman & cs.. (1986) (1986), trống ng giúp cho quá trình hô hấp h thuận n lợi l (Hình các chủng ng E. ictaluri phân lập từ ừ một số loài cá 5, 6 7 và 8). Mang tăng sinh, phù nề nề và nhiều khác nhau nhưng có đ độ tương đồng ng cao trong ccấu nhớ ớtt làm cho cá thithiếuu oxy, sức s khỏee kém cũng là trúc gen. C Cặp mồi đặ ặc hiệu u EiFd-1F/EiFd-1R EiFd 1R đđể nguyên nhân làm cho cá chết ch nhiều. u. Gan cá bệnh phát hiệnn DNA ccủa a vi khu khuẩn E. ictaluri đã đư được xuấất hiện nhiều u ttế bào đạii thực th c bào, nhiều nhi vùng sử dụng ng đ để chẩn n đoán b bệnh nh gan thận th mủ trên cá xuấất huyết, tụ máu, giảm m sốs lượng tếế bào gan, tra, cá rô phi và cá nheo M Mỹ trong nghiên ccứu thoái hóa kèm theo ho hoại tửử nghiêm trọngtr (Hình này. Mặcc dù v vậy, y, gi giữa a các chủng ch ng vi khukhuẩn 10 và 12). ThậnTh n cá cũng xuấtxu hiện nhiềều vùng bị E. ictaluri gây bệnhnh cho các loài cá khác nhau có thoái hóa, xuất xu t huy huyếtt và tụt huyết, t, các vùng bị b thể có sự khác nhau v về đặcc tính di truyền truy n và ccần hoạại tử ống thậ ận bị tổnn thương nặngn nềề (Hình 14 có các nghiên ccứu tiếp p theo, đđặcc biệt bi là giảii trình và 16). Thành ru ruột xuấtt huyết, huy t, cơ trơn của c ruột tự bộ gen ccủaa các chchủng gây bệnh nh ở các loài cá cấu u trúc lỏng l lẻẻo, biểu u mô lông nhung của c ruột bị khác nhau đ để làm rõ v vấn đề này. đứtt nát, thoái hóa, lan tràn vi khuẩn khu n gây bệnh b và hồng ng cầuc u đã phphản ảnh nh đúng đặc đ điểm m bệnh b tích 3.4. Mộtt ssố đặc điể ểm mô bệnhnh học h của a cá đạii thể th ở ruộtt cá b bị bệnh nh (Hình (Hình 19 và 20). Cho nheo Mỹ ỹ mắc bệnhnh gan th thận n mủ m đếnn nay, chỉ ch có m mộtt nghiên cứuc về mô bệnh b học Để nghiên ccứu uđ đặc điểm bệnhnh lý vi thể th của củaa cá nheo Mỹ Mỹ nhiễm E. ictaluri do Miyazaki & cá bị bệnh, nh, 14 m mẫuu mô đư đượcc thu từ t cá nheo M Mỹ Plumb (1985) thực hiện, n, tuy nhiên kết k quả bị bệnh nh gan th thận mủ đã giám định nh bằng b ng PCR và nghiên cứu c chỉ nêu được đặ ặc điểm m mô bệnh b học ở 01 cá khỏỏe mạnh đượợc sử dụng ng để đ làm tiêu b bản cơ, thận th n và mô máu cá. Hi Hiệện tượng ng cơ cá bịb lở loét mô học.c. Nh Những biếnn đđổi mô họ ọc ở mang, gan, và hoại ho tử da đã đư được Miyazaki & Plumb (1985) thận, ruộột của a cá nheo MMỹ mắcc bệnh b nh gan ththận mô tả t kỹ,, tuy nhiên trong nghiên cứu c u này, tỷ t lệ mủ đượcc so sán sánh vớới cá khỏe e mạnh m nh và đư được cá có hiện hi tượng ng llở loét và hoại ho tử cơ chiếmchi tỷ lệ trình bày ở các hình 5 đ đến n hình 20. khá thấp th p (17,1%). Các đ đặcc điểm đi về biến bi đổi mô Kếtt qu quả kiểm m tra bi biến đổii mô bệnh b họọc cá bệnh nh họch ở thậ ận cá bệnhnh trong nghiên cứu c của mắc bệnh nh gan th thận n mmủ cho thấy y mang cá tăng Miyazaki & Plumb (1985) là khá tương đồng đ so sinh, mô mang xuxuấtt huy huyếtt và phù nề n trong khi vớii kết k quả nghiên ccứu u này. 100
  8. Trương Đình Đình Hoài, Kim V Văn Vạn, n, Đào Lê Anh, Nguy Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Nguy n Văn Tuyến, Tuy Vũ V Đức Mạnh,nh, Nguy Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Nguy Thị Lan Hình 5. Mang cá nheo M Mỹ khỏ ỏe, e, các tơ mang Hình 6. Mang cá nheo Mỹ M khỏe, các tế t bào sơ cấp p và th thứ cấp prrộng ng và thoáng (HE × 40) mang có cấu c u trúc, ssố lượng lư ng và kích thước thư bình thường thư ng và phân bố ố đều u trên tơ mang th thứ cấp (HE ×100) Hình 7. Mang cá nheo MMỹ bị bệnh, b nh, tơ mang Hình 8. Mang cá bệnh,, tơ mang tăng sinh và tăng sinh, mang xu xuất huyếtt nặng n (HE × 100) xuấtt huy huyếtt lan tràn (HE × 400) Hình 9. Gan cá bình thư thường, ng, cấu c u trúc, m mật Hình 10. Gan cá b bệnh, nh, nhu mô gan hoại ho tử, độ và phân b bố tế bào gan đ đều u trên nhu mô xuất xu huyết, t, ttế bào gan thưa thớt, th t, cấu c trúc gan (HE × 100) lỏng l lẻo o (mũi tên đen), sựs hiện diệ ện của E. ictaluri trong mô (mũi tên vàng) (HE × 100) 101
  9. Đặc điểm mbbệnh lý và ứng ng d dụng phương ng pháp PCR ch chẩn đoán bệnh nh gan thận th mủủ trên cá nheo Mỹ M (Ictalurus Ictalurus punctatus) punctatus Hình 11. Gan cá bình thư thường, ng, tế t bào o hình đa Hình 12. Gan cá b bệnh, số lượng tế bào gan giác, nhân rõ và phân b bố đềuu trong nhu mô giảm, m, cấu c u trúc llỏng lẻo, o, hoại ho tử và xuất xu huyết gan (HE × 400) lan tràn (mũi tên đen), sựs hiện diệện của E. ictaluri trong mô (mũi tên vàng) (HE ( × 400) Hình 13. 3. Thận n cá bình thư thường, ng, số s lượngng và Hình 14. Thận n cá b bệnh, nh, thận th bị hoại ho tử, số cấ ấu trúc ống ng th thận rõ (HE HE × 40 ) lượ ợng ống thậận giảm, cấấu trúc ống ng thận th bị biến bi dạng, ng, xu xuất huyếtt lan tràn (mũi tên đen), sự s hiện n di diện của E. ictaluri trong mô (mũi tên vàng) (HE × 40) 5. KẾT T LU LUẬN Các chủng ng vi khu khuẩn từừ cá bệnh nh có khuẩn khu lạc nhỏỏ,, không nhân, trtrắng ng hơi đục, đ rìa bằng, hơi lồi, Cá nheo M Mỹ bị bbệnh nh gan thận th mủ thư thường vi khuẩn khu dạng ng tr trực khuẩnn bắt b t màu Gram âm. bơi lờ đờờ,, mang nhi nhiều nhớt, t, xuất xu huyếtt n nắp mang, gốcốc vây và h hậ ậuu môn. Các nội n i quan như Các chủng ch ng vi khu khuẩn n này đã được đư thử ử đặc tính gan, thận n có nhi nhiều u đđốm mủ trắ ắng do hoạii ttử, sinh hóa và giám đ định bằng ng PCR vớiv i 100% mẫu m ruột xuấtt huy huyết. Về mô b bệnh học,c, mang cá bbệnh dương tính vớiv i E. ictaluri.. Nhữngng thông tin từt có biểuu hi hiệnn tăng sinh mạnh nh và xuất xu huyếtt lan kếtt quả qu nghiên ccứu u này là cơ sởs để người ngư nuôi tràn. Ruộột bị xuấtt huy huyếtt và thành ruột ru bị đứt phát hiện hi sớm m b bệnh, đề ra phương phương pháp chẩn ch nát. Gan, ththận bị hoạại tử, cấu u trúc nhu mô llỏng đoán và phòng và tr trị bệnh nh phù hợp, h p, giảm gi thiểu lẻoo kèm theo hi hiện tượợng xuấtt huyết huy và tụ huyhuyết. thiệệt hại do dịch ch bbệnh nh này gây ra trong tương lai. 102
  10. Trương Đình Đình Hoài, Kim V Văn Vạn, n, Đào Lê Anh, Nguy Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Nguy n Văn Tuyến, Tuy Vũ V Đức Mạnh,nh, Nguy Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Nguy Thị Lan Hình 15. Th Thậnn cá bình thư thường, ng, cấu c u trúc ống Hình 16. Thận Th n cá b bệnh, nh, nhu mô bịb hoại ho tử, các thận n rõ, các ttế bào ống thậnn phân bốb đ đều ống ng thận th bị mmất cấuu trúc, nhân thoái hóa, (HE HE × 100) nhu mô thận th n xu xuất huyếtt lan tràn (HE HE × 100) Hình 17. Ruộtt cá bình thư thường, ng, thành ru ruột Hình 18. Ruộộtt cá bình thường, thư ng, thành ruột ru cấu u trung r rắn chắc,c, bi biểu u mô và lông nhung cấu u trung rắn r n chchắc, biểu u mô và lông nhung rõ cấu u trúc (HE × 40) rõ c cấu trúc (HE HE × 100) Hình 19. Ruộtt cá b bị bệnh, nh, thành ruột ru lỏ ỏng Hình 20. Ruộ ột cá bị bệnh, nh, thành ruột ru giãn lẻo lông nhung rách nát, xu xuấtt huyết huy t trên ccả ra, ra cấu u trúc cơ vòng llỏng ng lẻo, l o, lông nhung thành ru ruộtt và bi biểu mô ruộột (HE × 40)) rách nát, xuấ xuất huyếtt trên cả c thành ruột ru và biểu u mô ruruột (HE ( × 100) 103
  11. Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) LỜI CẢM ƠN FAO (2014). The State of Food and Agriculture - Innovation in family farming. Để thực hiện nghiên cứu này, các tác giả Francis-Floyd R., Beleau M., Waterstrat P. & Bowser nhận được kính phí từ đề tài trọng điểm P. (1987). Effect of water temperature on the (T2018-03-12TĐ) do Học viện Nông nghiệp Việt clinical outcome of infection with Edwardsiella ictaluri in channel catfish. Journal of the American Nam tài trợ. Nhóm tác giả xin chân thành cảm Veterinary Medical Association. 191: 1413-1416. ơn sự hỗ trợ của các em sinh viên Khoa Thủy Gatlin D.M. & Stickney R.R. (1982). Fall‐winter sản, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt growth of young channel catfish in response to Nam và các chủ trang trại nuôi cá nheo Mỹ ở quantity and source of dietary lipid. Transactions Hưng Yên, Bắc Ninh và Hà Nam đã giúp đỡ và of the American Fisheries Society. 111: 90-93. tạo điều kiện trong quá trình điều tra, thu mẫu Hoai T.D., Trang T.T., Van Tuyen N., Giang N.T.H. & Van Van K. (2019). Aeromonas veronii caused để hoàn thành nghiên cứu này. disease and mortality in channel catfish in Vietnam. Aquaculture. 513: 734425. TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoai T.D., Hoai N.T, Phuong N.T.M & Hau N.T. (2014). Histopathological features of tilapias Crumlish, Dung M., Turnbull T., Ngoc J., N. & cultured in Nothern Vietnamese provinces Ferguson H. (2002). Identification of Edwardsiella naturally infected with Streptococcus sp. J. Sci. & ictaluri from diseased freshwater catfish, Devel. 12: 360-371. Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in Miyazaki T. & Plumb J. (1985). Histopathology of the Mekong Delta, Vietnam. Journal of fish Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus diseases. 25: 733-736. punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. Đặng Thị Hoàng Oanh & Nguyễn Trọng Nghĩa (2016). 8: 389-392. Xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá Panangala V.S., Shoemaker C.A., Van Santen V.L., lóc (Channa striata) nuôi ở đồng bằng sông cửu Dybvig K. & Klesius P.H. (2007). Multiplex-PCR long. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn. for simultaneous detection of 3 bacterial fish 9: 82-89. pathogens, Flavobacterium columnare, De la Cruz N.I., Rabago J.L., Monreal A.E., Colín Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophila. V.H., Aguirre G., Merino J.O., Carmona S.D., Diseases of Aquatic Organisms. 74: 199-208. Rangel J.A., Horta J.V. & Venegas C.S. (2017). Kim Văn Vạn (2017). Xây dựng mô hình nuôi cá nheo Diagnosis and frequency of parasites in channel mỹ (Ictalurus punctatus) trong ao tại Hưng Yên. catfish (Ictalurus punctatus) on northeastern and Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. gulf coast farms Mexico. 5(3): 98-103. 15(6): 738-745. Dung T.T., Haesebrouck F., Tuan N.A., Sorgeloos P., Wagner B.A., Wise D.J., Khoo L.H. & Terhune J.S. Baele M. & Decostere A. (2008). Antimicrobial (2002). The epidemiology of bacterial diseases in susceptibility pattern of Edwardsiella ictaluri food‐size channel catfish. Journal of Aquatic isolates from natural outbreaks of bacillary Animal Health. 14: 263-272. necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Waltman W., Shotts E. & Hsu T. (1986). Biochemical Vietnam. Microbial drug resistance. 14: 311-316. characteristics of Edwardsiella ictaluri. Appl. Đồng Thanh Hà (2009). Nghiên cứu xác định tác nhân Environ. Microbiol. 51: 101-104. gây bệnh “mủ ở gan thận” trên cá tra (Pangasius Wang C. & Silva J.L. (1999). Prevalence and hypophthalmus) nuôi tại bến tre. Kỷ yếu hội nghị characteristics of Aeromonas species isolated from sinh viên NCKH 2008-2009. Trường Đại học Thủy processed channel catfish. Journal of Food sản Nha Trang. Protection. 62: 30-34. 104
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng