- Trang Chủ
- Công nghệ - Môi trường
- BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH ĐẶC TRƯNG PHÂN TỬ VÀ CHỨC NĂNG CÁC GENE ỨNG VIÊN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG BỆNH GHẺ CỦ DO VI KHUẨN STREPTOMYCES SCABIES Ở KHOAI TÂY BẰNG TIN SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ MIRNA
Xem mẫu
- BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH ĐẶC TRƯNG PHÂN TỬ VÀ CHỨC NĂNG CÁC GENE ỨNG
VIÊN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG BỆNH GHẺ CỦ DO VI KHUẨN
STREPTOMYCES SCABIES Ở KHOAI TÂY BẰNG TIN SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
MIRNA
Nguyễn Thị Thùy Linh, Nguyễn Thị Phương Thảo*, Nguyễn Thị Thủy
Đại học Nông Nghiệp Hà Nội
*Liên hệ: Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật, Khoa CNSH, ĐH NNHN; Email:
ntpthao@hua.edu.vn
TÓM TẮT
Gene TXR1 ở Arabidopsis thaliana mã hóa cho một protein có vai trò trong sự đi ều hòa v ận
chuyển thaxtomin A - tác nhân chính gây ra bệnh ghẻ c ủ khoai tây vào trong t ế bào. Protein
TXR1 có các trình tự tương đồng cao trên các loài th ực v ật khác nhau, th ậm chí trên c ả đ ộng v ật
và người. Trình tự bảo tồn của TXR1 (từ vị trí 204 đến vị trí 554 trên mRNA TXR1) đã được
nhân dòng và xác định trình tự trên giống khoai tây Atlantic, đồng th ời xác đ ịnh trình t ự này cũng
có 3 intron và 4 exon. Bên cạnh đó, một trình tự khác cũng có khả năng liên quan đến cơ ch ế
kháng/nhiễm bệnh ghẻ củ khoai tây là CV470003.1 cũng đã được nhân dòng. AmiRNA là công
cụ hiệu quả cho việc làm câm gene, ứng dụng trong nghiên cứu chức năng ở th ực v ật. Dựa vào
khung ath-miR319a precursor, cấu trúc vector mang trình tự amiRNA-1 đặc hiệu cho gene mục
tiêu là CV470003.1 đã thiết kế. Cấu trúc này sau đó được chuyển vào khoai tây để đánh giá tác
động của amiRNA-1 đến sự biểu hiện của gen mục tiêu.
Từ khóa: amiRNA, common scab, miRNA, thaxtomin A, TXR1 gene.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong số nhiều bệnh gây hại trên khoai tây, bệnh ghẻ gây hại bởi vi khuẩn Streptomyces
scabies là một trong những bệnh nghiêm trọng, phân bố rộng và xảy ra ở h ầu h ết các vùng tr ồng
khoai tây trên thế giới (Lambert và Loria, 1989). Bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng
suất và phẩm chất củ. Theo điều tra của Đặng Thị Dung và cộng sự (2003), h ầu h ết các vùng
trồng khoai tây ở Việt Nam đều bị ảnh hưởng bởi bệnh này. Thaxtomin A đ ược cho là nguyên
nhân gây bệnh ghẻ củ ở khoai tây (Delserone và cộng sự, 1991; Acuna và cộng sự, 2001). Năm
2003, Scheible và cộng sự công bố phát hiện c ủa họ về đột biến kháng v ới thaxtomin A ở
Arabidopsis, gọi là txr1. Ông cũng tìm được gen tương ứng với đột biến này là TXR1, gen này mã
hoá cho một protein mới có trình tự bảo thủ tương đồng với tất các các sinh v ật nhân th ật.
Protein được mã hóa bởi gene TXR1 được giả thuyết là có vai trò điều hòa hoặc tham gia vào quá
trình vận chuyển thaxtomins vào trong tế bào. Dựa vào các thông tin đã công b ố, nghiên c ứu này
được tiến hành nhằm xác định ở khoai tây có gene TXR1 hay không và gene này có vai trò như
thế nào trong cơ chế kháng hay nhiễm bệnh ghẻ củ ở khoai tây?
Công nghệ miRNA được phát triển gần đây đã và đang tỏ ra là công cụ hiệu quả để điều
hoà ức chế các gen đơn hoặc các nhóm gen khác nhau trên cơ sở các trình tự đặc hi ệu. Vi ệc s ử
dụng thành công các miRNA nhân tạo để điều hoà ức chế các gen cũng đã được công bố trên các
cây hai lá mầm như Arabidopsis, cà chua và thuốc lá và cây một lá m ầm nh ư lúa (Parizotto và
cộng sự, 2004; Alvarez và cộng sự, 2006; Schwab và c ộng sự, 2006; Warthmann và c ộng s ự,
2008). Trong đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các công c ụ tin sinh h ọc, nhân dòng và miRNA
nhằm bước đầu tìm hiểu về trình tự và chức năng của các gen ứng viên cho TXR1. Các phát
hiện về gene TXR1 ở khoai tây sẽ góp phần cung cấp thông tin về cơ sở di truyền c ủa tính
kháng, làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của thaxtomins ở khoai tây ở mức phân tử và từ đó sẽ góp
phần phát triển các chiến lược phòng chống bệnh mới trên khoai tây và các cây trồng khác.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu:
- DNA chiết tách từ mô lá giống atlantic
Các vector
Vector khung- pRS300 chứa ath-miR319a precursor (cung cấp bởi Detlef Weigel, Department
of Molecular Biology, Max Planck Institute for Developmental Biology, Germany). Vector nhân
dòng pZET1.2/blunt (Fermentas). Vector biểu hiện pPS1 (cung c ấp b ởi Walter de Jong, Cornell
University, USA).
Tìm kiếm, phân tích các trình tự tương đồng
Sử dụng công cụ BLAST trên NCBI với các cơ sở dữ li ệu khác nhau (EST, HTGS) và công
cụ ORF Finder để phân tích các đặc trưng của trình tự.
Nhân dòng gene và đọc trình tự
Sử dụng vector pZET1.2/blunt (Fermentas). Xác định trình tự nhân dòng theo b ộ kit Bigdye
terminator v3.1 và kết quả giải trình tự được xử lý bằng phần mềm DNAstar (Lasergene v7.1).
Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật mang amiRNA (miRNA nhân tạo)
Sử dụng WMD3 để thiết kế amiRNA đặc thù cho trình tự mRNA m ục tiêu. Nhân dòng các
amiRNA sử dụng vector RS300 theo quy trình của Rebecca Schwab và c ộng s ự (2006). S ản
phẩm nhân dòng được tái tổ hợp vào vector pPSI để tạo nên vector biểu hiện ở thực vật
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tìm kiếm, phân tích các trình tự tương đồng
Kết quả tìm kiếm trình tự các gene ứng viên TXR1 ở khoai tây cho thấy có tính đồng nhất
cao giữa CX161514.1, DN849236.1, CK852098.1 với trình tự gene TXR1 (NM_115790) ở
Arabidopsis (lần lượt là 72%, 72%, 71%) và với trình tự gene ứng viên TXR1 ở cà chua
(AI781901.1) (lần lượt là 96%, 96%, 95%). Kết quả căn trình tự ở m ức đ ộ nucleotide và amino
acid cho thấy: vùng bảo thủ nằm ở vị trí 138-482 trên CX161514.1, vị trí 114-458 trên
DN849236.1 và 112-156 trên CK852098; tương ứng với vị trí 204-554 trên trình tự mRNA c ủa
gene TXR1 (NM_115790.2) ở Arabidopsis và vị trí 158-502 trên trình tự gene ứng viên TXR1 ở cà
chua (AI781901.1).
Kết quả tìm kiếm trình tự gene ứng viên TXR1 ở khoai tây cũng cho thấy, trình tự
CV470003.1 cũng có tính đồng nhất cao với trình tự TXR1 (NM_115790.2) ở Arabidopsis (71%)
và với trình tự gene ứng viên TXR1 ở cà chua (95%). Đây là trình tự cDNA thu được khi củ khoai
tây bị nhiễm bệnh ghẻ. Bởi vậy rất có thể trình tự này cũng có liên quan đ ến s ự c ảm ứng
kháng/nhiễm bệnh ghẻ trên khoai tây.Từ các trình tự tương đồng trên, 2 nhóm trình t ự đ ược l ựa
chọn như sau:
Nhóm 1: gồm các trình tự CX161514.1, DN849236.1, CK852098.1.
-
- Nhóm 2: gồm trình tự CV470003.1
Trên Arabidopsis thaliana, dựa vào sự so sánh trình tự cDNA (NM_115790.2) với trình t ự
genome (At3g59280, mã số genbank: AI112727.1) đã chứng tỏ rằng gene TXR1 bao gồm 3 và 4
exon (Scheible và cộng sự, 2003). Kết quả phân tích các trình tự gene ứng viên TXR1 ở khoai tây
cho thấy các trình tự này cũng mang 3 intron và 4 exon.
Nhân dòng các gene ứng viên
11 cặp mồi khác nhau được thiết kế cho nhóm trình tự thứ
nhất để thực hiện nhân dòng bằng PCR, trong đó cặp mồi F7-
R7 thiết kế cho vị trí vùng bảo thủ, các cặp mồi còn lại được
thiết kế nhằm nhân toàn bộ chiều dài của gene.
Kết quả PCR cho thấy, chỉ có cặp mồi F1-R5, F1-R6 và F7-
R7 cho sản phẩm, trong đó chỉ có sản phẩm nhân bằng cặp m ồi
F7-R7 cho sản phẩm có kích thước như dự đoán (900-950 bp)
(Hình 1). Với kích thước này có thể trình tự nhân được có chứa
2 intron (intron số 2, 3) và 3 exon (số 2, 3, 4).
Để kiểm chứng dự đoán về cấu trúc của trình tự vừa nêu, các
sản phẩm này được xác định trình tự. Kết quả cho thấy, chỉ có sản Hình 1 : Sản phẩm PCR với
cặp mồi F7-R7 trên giống
Atlantic
- phẩm được nhân lên bằng cặp mồi F7-R7 (gọi là At-F7R7) liên quan đến trình tự mục tiêu. Sản phẩm
này có kích thước 917 nts, đúng như dự đoán của về kích thước của sản phẩm. Kết quả BLAST cho
thấy trình tự này có tính đồng nhất cao nhất với các trình tự ứng viên TXR1 ở khoai tây là 100%. Phân
tích trình tự cũng cho thấy trình tự này đồng nhất với các trình tự EST của các gene ứng viên TXR1 của
khoai tây ở 3 vùng, chứng tỏ trình tự này có chứa 3 exon (exon 2, 3, 4) và 2 intron (intron 2, 3).
Như vậy , có thể kết luận đoạn At-F7R7 nhân được chính là môt phần của gene TXR1 mục tiêu.
Trình tự At-F7R7 được thiết kế nằm trên vùng bảo thủ và được đặt tên TXR1-potato-1.
Kết quả BLAST và kết quả căn trình tự nucleotide và amino acid dự đoán, cùng với thông tin
dự đoán cấu trúc polypeptide của TXR1-potato-1 cho thấy, đoạn TXR1-potato-1 có chứa 2 intron
(intron 2 và 3) có kích thước lần lượt là 412, 104 nts và 3 exon (exon 2, 3, 4) có kích thước lần lượt
là 91, 131, 119 nts. Chúng tôi đưa ra mô hình cấu trúc đoạn TXR1-potato-1 như hình 2.
Mục tiêu tiếp theo là thiết
kế các amiRNA dựa vào thông
tin chính xác về trình tự ở vùng
bảo thủ của gene đã có để
nghiên cứu chức năng của gene
TXR1 trong tính kháng/nhiễm
Hình 2: Mô hình cấu trúc đoạn TXR1-potato-1 nhân dòng từ Atlantic
bệnh ghẻ ở khoai tây.
3’ UTR: trình tự 3’ không mã hóa
Tương tự đối với trình tự E2, E3, E4: exon 2, exon 3, exon 4
CV470003.1, chúng tôi đã thiết I2, I3: intron 2, intron 3
kế cặp mồi nhân dòng F3-R3. Các vị trí được đánh số theo trình tự TXR1-potato-1
Kết quả PCR (hình 3) cho
thấy, kích thước của sản phẩm
phù hợp với dự đoán là đoạn nhân dòng có thể mang cả 3 intron hoặc mang 2 intron (intron 2+3).
Thiết kế vector biểu hiện mang amiRNA đặc hiệu cho trình tự CV470003.1
Phần mêm WMD3 đã đưa ra 28 amiRNA tiềm năng cho
trình tự CV470003.1. Trong đó amiRNA1 có trình tự
UAUCAUUCGUGCAGUUUGCAU được lựa chọn để thực hiện các
nghiên cứu tiếp theo.
Sử dụng công cụ blast trong WMD3, phát hiện amiRNA-1
còn có khả năng “làm câm” một trình tự mục tiêu khác là
DN589430.1 là một cDNA được tạo ra từ của khoai tây bị nhiễm
bệnh mốc sương. Mức đồng nhất của trình tự CV470003.1 và
DN589430.1 là 91% (BLAST). Do vậy, các trình tự này có thể
cùng liên quan đến cơ chế kháng/nhiễm trước tác nhân gây bệnh
bất kỳ. amiRNA-1 đã được nhân dòng và đã thiết kế thành công
vector biểu hiện ở thực vật pPS1 có mang amiRNA-1. Vector
Hình 3: Kết quả nhân PCR
này sau đó được chuyển vào cây khoai tây để đánh giá tác đ ộng
trình tự CV470003.1
của nó đến sự biểu hiện của gen TXT1.
trên giống Atlantic bằng cặp
mồi F3, R3
KẾT LUẬN
1. Sử dụng các công cụ tin sinh, đã mô phỏng đ ược c ấu trúc c ủa gene ứng c ử viên TXR1 ở
khoai tây có chứa 4 exon với độ lớn lần lượt là 61, 91, 131, 119 nts và 3 intron với kích th ước
tương ứng là 3053, 412, 104 nts.
2. Bằng thực nghiệm, đã nhân dòng và xác định trình t ự thành công trình t ự b ảo t ồn c ủa TXR1
(từ vị trí 204 đến vị trí 554 của mRNA TXR1) trên giống khoai tây Atlantic; đoạn nhân được
có kích thước 917 bp, mã hóa cho 114 aa, được dự đoán là mang 2 intron (kích th ước t ương
ứng 412, 104 nts) và 3 exon (kích thước tương ứng 91, 131, 119 nts).
3. Đã nhân dòng thành công bằng PCR trình tự CV470003.1 t ừ khoai tây gi ống Atlantic v ới kích
thước khoảng 4255 bp và dự đoán gene quy định trình tự này có 4 exon và 3 intron.
4. Thiết kế thành công vector nhân dòng mang trình tự amiRNA-1 đặc hi ệu v ới m ục tiêu là
CV470003.1.
- TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Acuna, I.A., Strobel, G.A., Jacobsen, B.L., and Corsini, D.L. (2001). Glucosylation as a
mechanism of resistance to thaxtomin A in potatoes. Plant Sci. 161:77–88.
2. Alvarez, J.P., Pekker, I., Goldshmidt, A., Blum, E., Amsellem, Z. and Eshed, Y. (2006).
Endogenous and synthetic microRNAs stimulate simultaneous, efficient, and localized
regulation of multiple targets in diverse species. Plant Cel. 18:1134–1151.
Delserone, L.M., Loria, R., and Arias, I. (1991). Correlation between susceptibility of potato
3.
cultivars to Streptomyces scabies and sensitivity to thaxtomin A. Phytopathol. 81:1193–1200.
Dung, D.T., Yoshida. H., and Suyama, K. (2003). Susceptibility of different potato varieties
4.
against potato common scab in vietnam. J. ISAAS. 9(2):40-46.
Lambert, D.H., and Loria, R. (1989). Streptomyces scabies sp. nov., nom. rev. Intern. J. Syst.
5.
Bacteriol. 39:387-392.
Parizotto, E.A., Dunoyer, P., Rahm, N., Himber, C., and Voinnet, O. (2004). In vivo
6.
investigation of the transcription, processing, endonucleolytic activity, and functional relevance
of the spatial distribution of a plant miRNA. Genes Dev. 18:2237–2242.
Scheible, W.R., Barbara, F., Kochevenko, A., Schindelasch, D., Zimmerli, L., Somerville, S.,
7.
Loria, R., and Somerville, C.R. (2003). An Arabidopsis Mutant Resistant to Thaxtomin A, a
Cellulose Synthesis Inhibitor from Streptomyces Species. Plant Cel. 15(8):1781–1794.
Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., and Weigel, D. (2006). Highly specific
8.
gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis. Plant Cel. 18:1121–1133.
Warthmann, N., Chen, H., Ossowski, S., Weigel, D., and Herve, P. (2008). Highly Specific
9.
Gene Silencing by Artificial miRNAs in Rice. PLoS ONE 3(3):e1829.
INITIALLY DETERMINE MOLECULAR CHARACTERISTICS AND FUNCTION OF
CANDIDATE GENES RELATED TO RESISTANCE OF POTATOES TO COMMON SCAB
CAUSED BY STREPTOMYCES SCABIES VIA BIOINFORMATICS AND MIRNA
TECHNOLOGY
Nguyen Thi Thuy Linh, Nguyen Thi Phuong Thao*, Nguyen Thi Thuy
Hanoi university of Agriculture
*For correspondence: Department of Plant Biotechnology, Faculty of Biotechnology, HUA;
email: ntpthao@hua.edu.vn
Summary
TXR1 gene of Arabidopsis thaliana encodes a novel protein with homologs in all fully
sequenced eukaryotes and this protein regulates the transport of thaxtomin A – the major toxin
which causes common scab into plant cells. The conserved sequence of TXR1 gene (nucleotides 204
to 554 on mRNA of TXR1 gene) of the potato variety Atlantic was cloned and sequenced
successfully. This sequence contains three introns and four exons. Additionally, another sequence
potentially related to the genetic mechanism of resistance/susceptibility to common scab,
CV470003.1 was amplified by PCR successfully. AmiRNAs have been proved to be an effective
tool for specific gene silencing in plants and amiRNA technology has become a powerful tool for
functional genomics research. An amiRNA vector that contains amiRNA-1 which is specific for
CV470003.1 was generated based on the structure of ath-miR319a. This vector was used to transform to
potato in order to determine the affect of designed amiRNA-1 contruct on the target TXR1 gene.
Keywords: amiRNA, common scab, miRNA, thaxtomin A, TXR1 gene.
nguon tai.lieu . vn
