- Trang Chủ
- Báo cáo khoa học
- Báo cáo khoa học: Khảo sát tác động của tốc độ làm lạnh và nồng độ huyết thanh lên tỉ lệ sống và tính gốc của tế bào gốc trung mô sau khi đông lạnh
Xem mẫu
- Science & Technology Development, Vol 12, No.09 - 2009
KH O SÁT TÁC ð NG C A T C ð LÀM L NH VÀ N NG ð HUY T
THANH LÊN T L S NG VÀ TÍNH G C C A T BÀO G C TRUNG MÔ
SAU KHI ðÔNG L NH
Ph m Văn Phúc(1), Nguy n Thanh Tâm(2), Vương Th H ng Nhung(1),
Dương Th B ch Tuy t(2), Phan Kim Ng c(1)
(1) Trư ng ð i h c Khoa h c T nhiên, ðHQG-HCM
(2)Trư ng ð i h c Sư ph m Tp. H Chí Minh
(Bài nh n ngày 08 tháng 01 năm 2009, hoàn ch nh s a ch a ngày 28 tháng 07 năm 2009)
TÓM T T: T bào g c trung mô có th ñư c thu nh n t nhi u ngu n khác nhau,
trong ñó máu cu ng r n là m t ngu n t bào g c trung mô d i dào. Vi c b o qu n các t bào
g c này sao cho có th duy trì ñư c tính g c và t l s ng cao sau khi b o qu n là c n thi t
cho các ng d ng y h c. Nghiên c u này nh m xác ñ nh t l s ng và tính g c c a các t bào
g c trung mô sau khi ñông l nh b ng các phương pháp và môi trư ng b o qu n khác nhau.
K t qu nghiên c u cho th y: tính g c c a các t bào g c trung mô không b nh hư ng b i
quy trình b o qu n và môi trư ng b o qu n. T t c các t bào g c còn s ng sau các quy trình
b o qu n trong các môi trư ng b o qu n khác nhau ñ u có th hình thành các t p ñoàn cũng
như bi t hóa thành xương và m . Trái l i, t l s ng c a t bào g c trung mô sau gi i ñông b
nh hư ng l n b i phương pháp ñông l nh và thành ph n huy t thanh c a môi trư ng b o
qu n.
T khóa: T bào g c trung mô, ñông l nh, máu cu ng r n, tính g c.
1.M ðU
T bào g c trung mô máu cu ng r n là m t trong nh ng ngu n t bào g c quý. Chúng có
th bi t hóa thành nhi u ki u t bào khác nhau thu c trung mô, n i mô và bi u mô. Nhi u
nghiên c u ñã s d ng thành công ngu n t bào g c này trong ñi u tr c n lâm sàng và lâm
sàng trên nhi u b nh [8]. Tuy nhiên, các nghiên c u v b o qu n ñông l nh và xác ñ nh các
nh hư ng c a quá trình ñông l nh ñ n tính g c c a các t bào này v n chưa ñư c nghiên c u
nhi u.
Nghiên c u này t p trung vào kh o sát các tác ñ ng c a phương pháp ñông l nh và thành
ph n huy t thanh trong môi trư ng ñông l nh ñ n t l s ng sót c a t bào sau khi gi i ñông
nh m xây d ng quy trình ñông l nh hi u qu nh t ñ b o qu n ngu n t bào g c trung mô t
máu cu ng r n ngư i nói riêng và t bào g c trung mô nói chung.
Nghiên c u s d ng 3 phương pháp ñông l nh thư ng ñư c s d ng nh t trong các t bào
sinh dư ng là: (1) ñông l nh in situ: các t bào ñư c ñông l nh tr c ti p trong các flask 25 cm2
(Nunc, ð c) nuôi trong môi trư ng b o qu n l nh nhi t ñ -800C; (2) ñông l nh nhanh: t
bào ñư c ñông l nh trong cryotube 1,8 ml trong môi trư ng b o qu n, ñư c gi m nhi t ñ d n
d n (40C trong 30 phút, -200C trong 45 phút, -800C qua ñêm; và sang hôm sau cho vào nitơ
l ng); (3) ñông l nh c c nhanh hay th y tinh hóa: t bào trong môi trư ng b o qu n trong
cryotube ñư c ñ t tr c ti p vào nitơ l ng.
Chúng tôi s d ng ch t b o qu n là DMSO v i n ng ñ 10%, b sung trong môi trư ng
nuôi t bào g c trung mô máu cu ng IMDM v i các n ng ñ huy t thanh FBS khác nhau:
20%, 50% và 90% (v i kí hi u: Môi trư ng 1: 20% FBS, 10% DMSO, 70% IMDM; Môi
trư ng 2: 50% FBS, 10% DMSO, 40% IMDM; Môi trư ng 3: 90% FBS, 10% DMSO).
Trang 12 B n quy n thu c ðGQG-HCM
- T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 12, S 09 - 2009
2.V T LI U – PHƯƠNG PHÁP
2.1.Thu nh n t bào g c trung mô t máu cu ng r n ngư i
T bào g c trung mô t máu cu ng r n ñư c thu nh n theo quy trình c a Oscar K. Lee và
cs, 2004 [10]. Máu cu ng r n thu nh n t các s n ph ñã ñư c xét nghi m âm tính v i HIV,
HBV, B nh vi n Hùng Vương Thành ph H Chí Minh. Thu nh n qu n th t bào ñơn nhân
b ng phương pháp li tâm trên gradient n ng ñ Ficoll-paque (Sigma) t c ñ 2.500
vòng/phút, trong 5 phút. Sau ñó, thu nh n phân ño n t bào ñơn nhân n m gi a l p Ficoll-
paque và l p huy t tương bên trên.
T bào ñơn nhân sau khi thu nh n ñư c huy n phù trong môi trư ng nuôi c y IMDM, 20%
FBS, nuôi trong bình nuôi c y (Nunc, 25 cm2) sao cho ñ t m t ñ 3.105 t bào/cm2 ñi u ki n
370C, 5% CO2. Sau 48 gi , các t bào g c trung mô b t ñ u bám trên b m t bình nuôi, thay
môi trư ng ñ lo i b các t bào không bám (các t bào ch t và t bào g c t o máu), ti p t c
nuôi ñ n khi t bào ñ t m t ñ 70-80% di n tích b m t bình nuôi c y v i ch ñ thay môi
trư ng là 4 ngày/l n.
Khi m t ñ t bào MSC trong bình nuôi ñ t kho ng 70-80%, ti n hành c y chuy n tăng
sinh. Các t bào sau khi ñư c c y chuy n 7 l n s ñư c s d ng ñ ñông l nh. Ch t b o qu n
l nh ñư c s d ng là DMSO, v i t l 10%; ñây là t l ñư c s d ng trên h u h t các dòng t
bào sinh dư ng và t bào g c phôi cho t l s ng cao sau khi gi i ñông [3; 5; 6; 7; 11].
2.2.Phương pháp ñông l nh nhanh
Các t bào g c trung mô máu cu ng r n sau khi nuôi c y trong flask 25 cm2 v i m t ñ t
bào chi m kho ng 70% b m t ñư c tách b ng trypsin/EDTA 0,25%. Huy n phù t bào ñư c
li tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút và ch nh m t ñ t bào v 106 t bào/ml. Li tâm hút 1 ml
huy n phù trên (2500 vòng/phút trong 5 phút) ñ thu nh n t bào. Tái huy n phù c n t bào
b ng 1 ml môi trư ng ñông l nh (tương ng t ng môi trư ng), chuy n toàn b huy n phù t
bào trên vào Cryotube 1,8 ml (Nunc). Dán nhãn và ñánh d u dòng t bào, lo i môi trư ng
tương ng trên Cryotube.
ð t các Cryotube trên vào t mát 40C trong 30 phút và chuy n sang t l nh -200C trong 45
phút, sau ñó chuy n sang t l nh -800C và ñ qua ñêm. Sáng hôm sau mang các Cryotube ñ t
vào bình nitơ l ng (-1960C) ñ b o qu n. Thí nghi m ñư c ti n hành 10 l n l p l i, m i l n
ti n hành 3 m u; m i m u ch a 1 tri u t bào g c trung mô. K t qu ñư c tính v t l ph n
trăm và x lí b ng ph n m m th ng kê Statgraphic version 7.0.
2.3.Phương pháp ñông l nh c c nhanh (th y tinh hóa)
T bào g c trung mô máu cu ng r n nuôi trong flask 25cm2 (70% b m t phát tri n), ñư c
tách b ng Trypsin/EDTA 0,25%. Huy n phù t bào ñơn thu nh n ñư c li tâm 2500 vòng/phút
trong 5 phút và ch nh m t ñ t bào v 106 t bào/ml. Hút 1 ml huy n phù trên, li tâm 2500
vòng/phút trong 5 phút ñ thu nh n t bào. Huy n phù c n t bào v i 1 ml môi trư ng ñông
l nh (tương ng t ng môi trư ng) vào c n t bào trên, chuy n toàn b huy n phù t bào trên
vào Cryotube 1,8 ml. Dán nhãn và ñánh ñ u dòng t bào, lo i môi trư ng tương ng trên
Cryotube. ð t các Cryotube vào bình nitơ l ng (-1960C). Thí nghi m ñư c ti n hành 10 l n l p
l i, m i l n ti n hành 3 m u; m i m u ch a 1 tri u t bào g c trung mô. K t qu ñư c tính v
t l ph n trăm và x lí b ng ph n m m th ng kê Statgraphic version 7.0.
2.4.Phương pháp ñông l nh in situ (ñông l nh trong bình nuôi)
T bào g c trung mô máu cu ng r n trong flask 25 cm2 phát tri n ñ n 70% di n tích b
m t nuôi. ð b d ch nuôi ra ngoài, r a l i t bào 2 l n b ng PBSA. B sung 4 ml môi trư ng
ñông l nh (tương ng t ng môi trư ng). Dán nhãn, vi t kí hi u tương ng lên các bình nuôi và
B n quy n thu c ðGQG-HCM Trang 13
- Science & Technology Development, Vol 12, No.09 - 2009
ñ t vào t l nh -800C. Thí nghi m ñư c ti n hành 10 l n l p l i, m i l n ti n hành 3 m u; m i
m u ch a 1 tri u t bào g c trung mô. K t qu ñư c tính v t l ph n trăm và x lí b ng ph n
m m th ng kê Statgraphic version 7.0.
2.5.Phương pháp gi i ñông
L y Cryotube ra kh i bình nitơ l ng (-1960C) ho c l y flask ra kh i t l nh (-800C). ð t
vào b n nhi t 370C trong 3 -5 phút ñ n khi tan h t ñá. Chuy n t bào sang ng nghi m vô
trùng ch a môi trư ng IMDM, 40% FBS ñã làm m. Ly tâm nh 800 vòng/phút trong 3-5
phút. Tái huy n phù t bào trong 1 ml môi trư ng IMDM, 20% FBS. Hút 10 µl huy n phù trên
ñi xác ñ nh hi u qu s ng b ng cách nhu m ñ m v i Trypan blue. Ph n huy n phù còn l i
ñư c pha loãng 4 l n, nuôi 370C, 5% CO2 sau 1-3 ngày ñ xác ñ nh kh năng tăng sinh và
phát tri n.
2.6.ðánh giá t bào sau gi i ñông
Các t bào sau khi gi i ñông ñư c ñánh giá thông qua 3 ch tiêu: t l s ng ch t (thông qua
phương pháp ñ m v i trypan blue), kh năng t làm m i (thông qua phương pháp colony
assay) và kh năng bi t hóa thành xương và m [10].
Bi t hóa thành t bào t o m (adipocyte)
ð bi t hóa thành m , các MSC ñư c nuôi trong môi trư ng IMDM 10% FBS b sung 1
µM dexamethasone, 200 µM indomethacin, 1,7 µM insuline, 500 µM isobutyl-methylxanthine
(Sigma). S bi t hóa ñư c ghi nh n khi quan sát dư i kính hi n vi ñ phóng ñ i X20, X40
th y có s xu t hi n các gi t m nh .
Bi t hoá thành t bào t o xương (Osteoblast)
Các t bào MSC ñư c nuôi trong môi trư ng IMDM 10% FBS b sung 100 nM
dexamethasone, 50 µg/ml L-ascorbic acid 2-phosphat (AsAP) và 100 mM β-glycerolphosphate
(Sigma).
Phân tích RT-PCR
Ki u hình c a t bào t o xương ñư c ñánh giá thông qua s bi u hi n c a các gen marker
như osteopontin (hOSP) và osteocalcin (hOC).
RNA ñư c tách t 3-30. 105 t bào MSC s d ng TRI reagent (Sigma) theo hư ng d n nhà
s n xu t. Ph n ng RT-PCR ñư c ti n hành s d ng Kit one-tube c a Stratagene. Trong t t c
các ph n ng s d ng beta-actin như là m t ñ i ch ng n i. Ph n ng PCR ñư c ti n hành theo
chu trình sau: 94°C trong 40 giây, 56°C trong 50 giây, và 72°C trong 60 giây v i 40 chu kì,
sau th i kì bi n tính 94°C trong 5 phút. Sau 49 chu kì, ti n hành thêm 7 phút 720C và làm
l nh xu ng 40C trong 5 phút.
Các primer s d ng cho RT-PCR v i trình t như sau: Osteocalcin: sense 5’-
CGCAGCCACCGAGACACCAT-3’, antisense 5’-GGGCAAGGGCAAGGGGAAGA-3’
(405bp); Osteopontin: sense 5’-CTAGGCATCACCTGTGCCATACC-3’, antisense 5’-
CTACTTAGACTACTTGACCAGTGAC-3’ (330 bp); Beta-actin, Sense: 5’-
CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3’, antisense: 5’-
AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3’ (587 bp).
K t qu RT-PCR ñư c ch y ñi n di trên gel agarose 3%, quan sát k t qu dư i bàn ñèn
UV.
Trang 14 B n quy n thu c ðGQG-HCM
- T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 12, S 09 - 2009
3.K T QU -TH O LU N
3.1.T l ph n trăm t bào s ng sau khi ñông l nh b ng phương pháp ñông l nh
nhanh
D a vào k t qu cho th y s khác bi t rõ r t t l ph n trăm c a t bào s ng gi a 3 môi
trư ng. môi trư ng 1 v i t l t bào s ng là 23,5172 % th p hơn r t nhi u so v i môi trư ng
2 là 64,7806% và môi trư ng 3 là 78,2187%.
Ba môi trư ng s d ng, ch khác nhau v n ng ñ huy t thanh b sung, ñi u này g i cho
ch y r ng n ng ñ huy t thanh ñã nh hư ng ñ n s c s ng sót c a t bào khi ñông l nh.
Nhi u nghiên c u t trư c ñ n hi n nay ñ u cho th y huy t thanh có vai trò c c kì quan
tr ng trong nuôi c y t bào, v i nhi u thành chưa bi t rõ; huy t thanh có th h i ph c màng t
bào, trung hòa tính ñ c c a DMSO, ñ m pH t t, ñi u hòa áp su t th m th u… vì th v i n ng
ñ huy t thanh càng cao thì t l s ng c a t bào càng cao.
ñ tin c y 95% (LSD = 95%), s khác bi t có ý nghĩa th ng kê v t l ph n trăm t bào
s ng c a ba môi trư ng là khác nhau và t l này tăng d n t môi trư ng 1 ñ n môi trư ng 2 và
môi trư ng 3.
3.2.T l ph n trăm t bào s ng sau khi gi i ñông phương pháp ñông l nh c c
nhanh
Sau khi gi i ñông, t l t bào s ng 3 môi trư ng là: môi trư ng 1 là 65,2116 % ; môi
trư ng 2 là 53,3749 % và môi trư ng 3 là 60,3556 %.
Theo k t qu này, dư ng như r ng n ng ñ huy t thanh không nh hư ng quan tr ng ñ n
t l s ng c a t bào sau khi gi i ñông. T l ph n trăm các t bào s ng sau gi i ñông không có
s khác bi t có ý nghĩa th ng kê. ði u này có th gi i thích như sau:
Khi ti n hành phương pháp ñông l nh c c nhanh, sau khi cho môi trư ng ñông l nh vào t
bào, t bào trong môi trư ng b o qu n ñư c ñ t tr c ti p vào bình nitơ l ng nhi t ñ -1960C,
trong t bào x y ra hi n tư ng hình thành tinh th th y tinh (glass) thay vì hình thành băng ñá
(ice) n i bào. Tuy nhiên, vì nhi t ñ gi m quá nhanh t 250C c a nhi t ñ phòng xu ng -1960C
trong 1 - 2 giây hay gi m t c ñ 12.0000C/phút; th i gian ñ t bào m t nư c khi b sung ch t
ñông l nh vào quá ng n nên v n còn m t lư ng l n nư c t n t i trong t bào ch t c a t bào
khi ñông l nh. Tuy r ng nh ng phân t nư c này không gây h i cho t bào vì chúng t n t i
d ng tinh th th y tinh (kính) nên không làm ch t t bào. Song, v n ñ nghiêm tr ng có th
x y ra quá trình gi i ñông. Khi gi i ñông, t bào -1960 C v 370C, nên các tinh th th y
tinh chuy n t tr ng thái này sang tr ng thái tinh th ñá r i tr l i tr ng thái l ng. Vì th , khi
có s xu t hi n các tinh th ñá là nguyên nhân gây ch t t bào. [1; 2; 9]
100
78.2187
80
64.7806
60
40
23.5172
20
0
Môi Môi Môi
trư ng 1 trư ng 2 trư ng 3
a)
B n quy n thu c ðGQG-HCM Trang 15
- Science & Technology Development, Vol 12, No.09 - 2009
100
80
65.2116
60.3556
60 53.3749
40
20
0
Môi trư ng Môi trư ng Môi trư ng
1 2 3
b)
100
80
60
39.9859
40 34.5337
27.2727
20
0
Môi Môi Môi
trư ng 1 trư ng 2 trư ng 3
c)
100 Phương pháp in situ
90 Phương pháp 3 bư c
78.2187
80 Phương pháp c c nhanh
70 65.2116 64.7806
60.3556
60
53.3749
50
39.9859
40 34.5337
30
23.4887
23.5172
20
10
0
Môi trư ng 1 Môi trư ng 2 Môi trư ng 3
d)
Hình 1. T l ph n trăm t bào s ng sau khi ñông l nh b ng phương pháp ñông l nh nhanh (a), c c
nhanh (b), và in situ (c). (d) T l ph n trăm t bào s ng trong các phương pháp và môi trư ng ñông l nh
khác nhau.
Th t v y, nhi u nghiên c u khi ti n hành ñông l nh phôi b ng phương pháp này, các tác
gi ph i s d ng môi trư ng có áp su t th m th u cao hơn môi trư ng ñông l nh t bào theo
quy trình bình thư ng (3 bư c) ñ lo i b nhanh chóng các phân t nư c n i bào, làm gi m s
hình thành các tinh th ñá khi gi i ñông; và khi ñó t l s ng s ñư c c i thi n.
Trang 16 B n quy n thu c ðGQG-HCM
- T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 12, S 09 - 2009
Trong quá trình ñông l nh 3 bư c (nhanh); t bào ch u tác ñ ng gi m d n c a nhi t ñ
trong tr ng thái ti p xúc v i ch t ñ c DMSO, trong khi chúng chưa hoàn toàn ng ng tăng
trư ng nên n ng ñ huy t thanh càng cao s giúp t bào gi m ñư c các tác ñ ng b t l i c a
DMSO gây ra. Trong khi ñó, trong quy trình ñông l nh c c nhanh, th i gian t bào chuy n t
tr ng thái còn s ng v tr ng thái ti m tàng quá ng n nên huy t thanh không phát huy ñư c vai
trò h n ch tác ñ ng x u c a DMSO. [1; 3].
3.3.T l ph n trăm t bào s ng sau khi gi i ñông phương pháp ñông l nh in situ
Trong phương pháp ñông l nh in situ, t l s ng c a t bào sau quá trình ñông l nh là
không cao, c ba môi trư ng ñ u th p hơn 50% t bào s ng. T l t bào s ng môi trư ng 1
luôn th p hơn môi trư ng 2 và môi trư ng 3 vì n ng ñ huy t thanh trong môi trư ng ñông
l nh th p ch chi m 10%. ði u này m t l n n a kh ng ñ nh nh hư ng c a huy t thanh ñ n s
s ng sót c a các t bào trong các quá trình ñông l nh nhi t ñ h ch m.
môi trư ng 2 và môi trư ng 3 v i n ng ñ huy t thanh khác nhau nhưng t l ph n trăm
t bào s ng sau khi gi i ñông là như nhau. ði u này có th gi i thích là phương pháp ñông
l nh này huy t thanh nh hư ng ñ n s c s ng c a t bào là có ngư ng tác ñ ng (tuy nhiên
ngư ng này chưa xác ñ nh trong nghiên c u này).
Nhi u nghiên c u ti n hành ñông l nh t bào g c t o máu, t bào g c trung mô t t y
xương và t bào g c phôi cho th y h u h t các k t qu v i t l ph n trăm t bào s ng sau gi i
ñông cao ñư c ñ ngh là 40-50% huy t thanh b sung trong môi trư ng nuôi. ði u này có th
suy lu n r ng, n u s d ng n ng ñ huy t thanh th p thì t l ph n trăm t bào s ng sót sau
gi i ñông th p hơn hay là ngư ng n ng ñ 40-50% là cho k t qu t t. Vi c tăng n ng ñ huy t
thanh cao hơn không ñư c ñ ngh trong h u h t các nghiên c u vì giá thành c a t bào sau khi
gi i ñông tăng r t cao (huy t thanh là thành ph n chi m ñ n 99% giá c a m t môi trư ng
nuôi).
ñ tin c y 95% (LSD = 95%), cho th y s khác bi t có ý nghĩa th ng kê v t l t bào
s ng môi trư ng 1 so v i môi trư ng 2 và môi trư ng 3. Trong khi ñó, môi trư ng 2 và môi
trư ng 3 không có s khác bi t có ý nghĩa th ng kê.
3.4.T l s ng c a các t bào các môi trư ng và các phương pháp ñông l nh khác
nhau
Trong môi trư ng 1 (10% FBS), t l ph n trăm t bào s ng sau khi gi i ñông gi a hai
phương pháp in situ và ñông l nh nhanh là tương ñương nhau (23,4887% và 23,5172%);
phương pháp ñông l nh c c nhanh cho t l ph n trăm t bào s ng r t cao so v i hai phương
pháp còn l i (g p ch ng 2,5 l n). ði u này có th gi i thích:
Trong phương pháp ñông l nh nhanh và in situ, t bào chuy n t nhi t ñ 250C xu ng -
0
80 C ch m, v i n ng ñ huy t thanh th p, nên s lư ng t bào ch t nhi u. Trong khi ñó,
phương pháp ñông l nh c c nhanh, do s thay ñ i nhi t ñ c c nhanh nên tác ñ ng c a DMSO
làm h i t bào gi m.
ði u th y rõ hơn trong môi trư ng 2 khi ñông l nh b ng 3 phương pháp trên. môi
trư ng v i n ng ñ huy t thanh cao (50%), s c s ng c a t bào tăng lên ñáng k , g i ý cho
r ng ñ c tính c a DMSO gi m khi n ng ñ huy t thanh tăng. T l ph n trăm t bào s ng trong
3 môi trư ng có s khác bi t có ý nghĩ th ng kê. T l ph n trăm t bào s ng cao nh t
phương pháp ñông l nh nhanh. Như v y, n u ñông l nh v i môi trư ng có 50% FBS trong môi
trư ng nuôi và b ng phương pháp ñông l nh nhanh thì s có t l t bào s ng cao nh t.
B n quy n thu c ðGQG-HCM Trang 17
- Science & Technology Development, Vol 12, No.09 - 2009
Trong môi trư ng 3, t l t ph n trăm t bào s ng cao nh t v n ñư c ghi nh n phương
pháp ñông l nh nhanh. Có l , trong phương pháp này nhi t ñ gi m t t , n u b sung n ng ñ
huy t thanh thích h p thì s c s ng c a các t bào sau khi gi i ñông khá cao.
Tóm l i, các phương pháp ñông l nh khác nhau khi ti n hành ñông l nh v i m t môi
trư ng ñông l nh s cho k t qu t l ph n trăm t bào s ng khác nhau.
3.5.S tương quan h i quy gi a n ng ñ huy t thanh trong môi trư ng b o qu n và
t l s ng sót sau gi i ñông
Các k t qu th c nghi m ñư c phân tích ANOVA cho th y:
Trong phương pháp ñông l nh nhanh n ng ñ huy t thanh có nh hư ng ñ n t l ph m
trăm t bào s ng sau khi gi i ñông: n ng ñ huy t thanh càng cao, t l s ng cao. Tuy nhiên,
khi phân tích ANOVA cho th y s tương quan này không tuy n tính hay nói cách khác khi
tăng n ng ñ huy t thanh càng cao thì t l ph n trăm t bào s ng không tăng theo. M t l n
n a cho th y, s tác ñ ng c a huy t thanh lên t l ph n trăm t bào s ng sau gi i ñông là
ngư ng tác ñ ng.
Trong phương pháp ñông l nh in situ: n ng ñ huy t thanh cũng có nh hư ng ñ n s c
s ng c a t bào sau gi i ñông. Các s li u cho th y, s c s ng c a t bào n ng ñ huy t thanh
50% và 90% là như nhau nhưng cao hơn có ý nghĩa th ng kê n ng ñ huy t thanh 20%. Như
v y, trong thí nghi m, ngư ng tác ñ ng lên s c s ng c a t bào ñông l nh khi gi i ñông cho
th y rõ r t. S tương quan c a t l ph n trăm t bào s ng sau khi gi i ñông và t l ph n trăm
huy t thanh là không tuy n tính hay ch tuy n tính trong m t kho ng nào ñó (có th dư i 50%
huy t thanh) mà nghiên c u chưa xác ñ nh.
Trong phương pháp ñông l nh c c nhanh: s tương quan gi a t l ph n trăm t bào s ng
và t l ph m trăm huy t thanh là không có.
Như v y, t các phân tích trên có th k t lu n r ng: s tác ñ ng c a huy t thanh lên s c
s ng c a t bào có ý nghĩa khi t bào chìm trong môi trư ng b o qu n ti p xúc DMSO và nhi t
ñ gi m t t . Vai trò b o v c a huy t thanh không th y rõ khi ti n hành ñông l nh c c nhanh
(hay gi m nhi t ñ c c nhanh). Trong nghiên c u, chưa xác ñ nh tác ñ ng có hay không c a
huy t thanh lên s c s ng khi ñông l nh c c nhanh (không có ti n hành b o qu n t bào trong
môi trư ng không có huy t thanh).
3.6.K t qu xác ñ nh colony assay
K t qu ñ m các colony hình thành t các t bào còn s ng sau gi i ñông cho th y, 100%
các t bào còn s ng s hình thành các t p ñoàn sau 24 gi , 48 gi . Sau 7 ngày, các colony h p
dòng và m t ñ ñ t t 70-80% di n tích b m t bình nuôi.
Các t bào sau khi gi i ñông ñã c y chuy n 3 l n (ñ n th i ñi m vi t báo cáo) và v n cho
th y kh năng tăng sinh m nh.
Trang 18 B n quy n thu c ðGQG-HCM
- T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 12, S 09 - 2009
(a) (b)
(c) (d)
Hình 2. K t qu xét nghi m colony assay. Các c m t bào hình thành sau khi nuôi c y 3 ngày (a), 5
ngày (b), 7 ngày (c) và 10 ngày (d).
Quá trình tăng sinh hình thành t p ñoàn và h p dòng c a các t bào sau khi gi i ñông là
tương t v i các t bào trư c khi ñông l nh. Th i gian th h c a các t bào ñư c xác kho ng
24 gi . K t qu này tương t v i các nghiên c u c a m t s tác gi khác trên th gi i v th i
gian th h các t bào g c trung mô t t y xương ngư i.
3.7.Bi t hoá hành t bào t o m
Sau 48 gi , các t bào b t ñ u tích t các gi t m trong t bào ch t. Các gi t m nh góp
l i d n thành các gi t l n. Các gi t m l n sau ñó s góp l i thành gi t m l n hơn chi m g n
h t th tích t bào và ép nhân t bào ra ngoài. Vì th , chúng t d ng dài, tr i r ng chuy n sang
d ng b u d c và cu i cùng là hình tròn. Các t bào t o m v i hình d ng tròn b t ñ u xu t hi n
vào ngày th 7 sau khi ti n hành c m ng.
(a) (b)
Hình 3. T bào sau khi bi t hóa trong môi trư ng c m ng t o m 7 ngày. (a) T bào trư c khi c m ng
bi t hóa, (b) T bào sau khi c m ng bi t hóa.
B n quy n thu c ðGQG-HCM Trang 19
- Science & Technology Development, Vol 12, No.09 - 2009
S xu t hi n các gi t m có th quan sát dư i kính hi n vi ñ o ngư c ñ phóng ñ i 200
hay 400 l n. Dư i kính hi n vi, các gi t m có d ng tròn, ph n chi u ánh sáng.
3.8.Bi t hóa thành t bào t o xương
Sau khi nuôi trong môi trư ng bi t hóa, sau 7 ngày, các t bào b t ñ u chuy n t d ng dài
sang d ng tròn và hình h t ñ u. ðó là hình d ng ñ c trưng c a t bào t o xương (osteoblast).
Khi ñư c c m ng bi t hóa, h u như t t c các t bào ñ u ng ng phân chia. ðây cũng là m t
d u hi u cho th y t bào g c ñã bi t hóa thành t bào ch c năng. ði u này cũng ñúng v i
trư ng h p khi c m ng bi t hóa MSC thành t bào t o m .
Các t bào sau khi c m ng bi t hóa dương tính v i các marker cho t bào xương là
osteocalcin và osteopontin khi xác ñ nh b ng RT-PCR.
M 1 2 3
(a) (b)
Hình 4. (a) T bào g c trung mô khi chưa bi t hóa, (b) K t qu ch y RT-PCR c a m u t bào g c trung
mô sau khi bi t hóa xương. M: thang chu n (100 bp), 1: osteopontin, 2: osteocalcin, 3: beta actin.
4.K T LU N
Phương pháp ñông l nh nhanh v i môi trư ng 90% FBS và 10% DMSO cho k t qu t t
nh t (78,22% t bào s ng sau gi i ñông) trong các phương pháp kh o sát. Trong phương pháp
ñông l nh c c nhanh, s c s ng c a t bào sau khi gi i ñông trong 3 môi trư ng b o qu n ch a
10% DMSO và l n lư t 20%, 50% và 90% FBS là tương ñương nhau (kho ng 60%). Trong
phương pháp ñông l nh in situ: s c s ng t bào trong ba môi trư ng là khác nhau, t l s ng
cao hơn môi trư ng 2 và 3 v i 10% DMSO, 50% và 90% FBS; nhưng th p hơn 50% t bào
s ng sau khi gi i ñông.
Trong ba phương pháp ñông l nh, dù môi trư ng nào thì t l ph n trăm t bào s ng c a
phương pháp ñông l nh nhanh cũng cao hơn phương pháp ñông l nh in situ, và tương ñ i cao
hơn phương pháp ñông l nh c c nhanh. Tác ñ ng c a huy t thanh lên s c s ng t bào sau
khi gi i ñông là có, nhưng ch t n t i trong m t ngư ng nh t ñ nh (có th là 50%).
Tính g c c a t bào g c trung mô máu cu ng r n sau quá trình ñông l nh b ng ba phương
pháp v i ba môi trư ng khác nhau s không thay ñ i, ti m năng tăng sinh và phát tri n c a
chúng trư c và sau khi gi i ñông là như nhau.
ð b o qu n t bào g c trung mô t máu cu ng r n, n u s d ng ñông l nh nhanh thì nên
ch n môi trư ng ñông l nh là 90% FBS và 10% DMSO. N u s d ng phương pháp c c nhanh
thì nên ch n môi trư ng v i 10% FBS và 10% DMSO vì s gi m giá thành. Phương pháp này
cũng có l i ñi m khác là ti n hành r t nhanh (ch trong 15 phút, k c th i gian ñưa t bào vào
cyotube) v i phương pháp ñông l nh nhanh (t n ch ng 3 gi ñ ñưa vào nitơ l ng). Phương
Trang 20 B n quy n thu c ðGQG-HCM
- T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 12, S 09 - 2009
pháp ñông l nh in situ dù v i môi trư ng có n ng ñ huy t thanh c c cao (90%) cũng cho t l
ph n trăm t bào s ng r t th p (
- Science & Technology Development, Vol 12, No.09 - 2009
[7]. Moustapha Kassen, Mesenchymal Stem Cells: Cell Biology and Potenntial Use in
Therapy. Basic & Clinical Pharmacology & Texicology. 95, 209 – 214, (2004)..
[8]. Orief Y, Mosgau AS, Dafopoulos K, Al-Hasani S, Vitrification: will it replace the
conventional gamete cryopreservation techniques? Middle East Fertility Society Journal.
10(3): 171 – 184, (2005).
[9]. Oscar K. Lee, Tom K. Kuo, Wei-Ming Chen, Kuan-Der Lee, Shie-Liang Hsieh and
Tain-Hsiung Chen, Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord
blood. Blood, 103: 1669-1675, (2004).
[10]. Son JH, Kim KH, Nam YK, Park JK, Kim SK, Optimization of Cryoprotectants for
Cryopreservation of Rat Hepatocyte. Biotechnol Lett. 26 (10): 829 – 833, (2004).
Trang 22 B n quy n thu c ðGQG-HCM
nguon tai.lieu . vn
