1. Trang Chủ
  2. Sinh học
  3. Bài giảng Thực hành sinh lý động thực vật: Phần 2 - TS. Nguyễn Hoài Hương, KS. Phạm Minh Nhựt

Bài giảng Thực hành sinh lý động thực vật: Phần 2 - TS. Nguyễn Hoài Hương, KS. Phạm Minh Nhựt

Bài giảng Thực hành sinh lý động thực vật được biên soạn bởi TS. Nguyễn Hoài Hương và KS. Phạm Minh Nhựt. Bài giảng Thực hành sinh lý động thực vật Phần 2 này gồm 2 bài cuối của bài giảng, bài xác đinh số lượng hồng cầu, bạch cầu và bài khảo sát enzyme catalase trong gan. Đây là tài liệu dùng cho sinh viên ngành Công nghệ sinh học. BÀI S 3 XÁC NNH S LƯ NG H NG C U VÀ B CH C U I. LÝ THUY T 1. Sinh lý máu Máu là lo i mô liên k t bao g m các t bào lơ l ng trong kho ng gian bào là d ch l ng. Chúng c

Thể loại Tài liệu miễn phí Sinh học

Số trang 15

Ngày tạo 8/30/2018 4:36:05 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.02 M

Tên tệp

Tải Bài giảng Thực hành sinh lý động thực vật: Phần 2 ... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BÀI S 3 XÁC NNH S LƯ NG H NG C U VÀ B CH C U I. LÝ THUY T 1. Sinh lý máu Máu là lo i mô liên k t bao g m các t bào lơ l ng trong kho ng gian bào là d ch l ng. Chúng có ch c năng v n chuy n các ch t gi a các t bào trong cơ th và môi trư ng bên ngoài, ng th i làm nhi m v b o v cơ th , i u hòa ho t ng c a các cơ quan, i u hòa thân nhi t, cân b ng nư c và mu i khoáng. Ngoài ra máu còn tham gia vào vi c duy trì n nh áp su t thNm th u và pH c a d ch th . Cùng v i b ch huy t và các d ch th khác, máu t o thành môi trư ng bên trong (n i môi). Môi trư ng này luôn có ch tiêu sinh lý – sinh hóa n nh m b o cho s t n t i và phát tri n c a h th ng s ng trong cơ th . N u máu vào ng nghi m l ng ho c ly tâm s th y máu phân thành 2 l p: phía trên là huy t tương màu vàng nh t chi m 55% th tích , phía dư i là t bào máu chi m 45 % th tích. Trong các t bào máu h ng c u có s lư ng l n nh t kho ng trên 99% t ng s , còn l i m t ph n r t ít là b ch c u và ti u c u (xem hình 1). Hình 1. Caùelements 45%u Cellular c teá baøo maù Daïng teá Soá löôïng/ Chöùc naêng µL (mm3) baøo HoÀng caàu 5–6 trieäu Vaän chuyeån oxy 5,000–10,000 Baïch caàu Baûo veä, mieãn dòch B ch c u ưa ki m T bào lympho B ch c u ưa acid B ch c u trung tính Monocyte Tieåu caàu 250,000− − Ñoâng maùu 400,000 22
  2. II. TH C HÀNH 1. Xác nh s lư ng h ng c u Trong thành ph n c a máu, s lư ng t bào máu thay i r t ít ngư i bình thư ng trong i u ki n bình thư ng. Vì v y, s thay i s lư ng h ng c u cũng như s thay i s lư ng và thành ph n các b ch c u s là nh ng d u hi u cho ta bi t ư c tr ng thái sinh lý c a cơ th . Nguyên t c xác nh s lư ng h ng c u: Do lư ng h ng c u trong máu r t nhi u nên mu n xác nh ta ph i pha loãng, sau ó m trong m t th tích nh , t ó tính s lư ng trên th tích l n. a) V t li u c n thi t - Kính hi n vi - Bu ng m h ng c u: có nhi u lo i nhưng thư ng dùng bu ng m Neubauer, là m t mi ng kính dày hình ch nh t, m t trên có 2 khu v c có k ô m (Hình 2). a) Bu ng m nhìn th ng và nhìn nghiêng, b) Bu ng m h ng c u Neubauer dư i kính hi n vi: m h ng c u trong ô l n trung tâm, thư ng m 5 ô trung bình (R); m b ch c u các ô l n 4 góc (W). Hình 2. Bu ng m h ng c u Neubauer 23
  3. Dư i kính hi n vi ta th y c u t o c a bu ng m h ng c u như sau: Bu ng m ư c chia thành 9 ô vuông l n, m i ô có di n tích 1 mm2. Ô chính gi a ư c s d ng m h ng c u, các c nh là nh ng ư ng song song, ư c chia thành 25 ô trung bình, m i ô trung bình ư c thành 16 ô nh . T ng c ng ô m h ng c u có 400 ô nh (m i ô có di n tích 1/400 mm2) B n ô 4 góc ư c s d ng m b ch c u, m i ô ư c chia thành 16 ô trung bình. Lưu ý ô m b ch c u ch chia n ô trung bình không chia ô nh . - ng tr n h ng c u: là ng th y tinh có ư ng kính r t nh , gi ng như pipette, ph n trên có b u phình ra, trong b u có h t nh a vuông ho c h t th y tinh màu , nó ư c s d ng tr n u h ng c u v i dung d ch pha loãng. ng tr n có kh c v ch và ánh s 0,5 – 1 – 101. Các s này bi u th th tích bên trong c a ng tr n, theo ó th tích t u ng n v ch 101 g p 200 l n so v i o n t u ng n v ch 0,5 và g p 100 l n v ch so v i o n t u ng n v ch 1. Hình 3. ng tr n h ng c u (ph i), b ch c u (trái). - Lamelle - Bông, c n 24
  4. - Dung d ch pha loãng h ng c u: Dung d ch pha loãng h ng c u là m t dung d ch ng trương và ch a các ch t ch ng k t dính h ng c u. Có th dùng dung d ch các dung d ch pha loãng dư i ây: Dung d ch Hayem: NaCl (1g), Na2SO4 (5g), HgCl2 (0,5 g), nư c c t (200 ml) Dung d ch Ringer: trong 100 ml có 860 mg NaCl, 30 mg KCl, 35 mg CaCl2. Dung d ch nư c mu i sinh lý NaCl (9g) , nư c c t (1000 ml). b) Cách th c hi n i) L y máu: vào bu i sáng khi thú chưa ăn, ít v n ng - V trí l y máu: tĩnh m ch rìa tai, tĩnh m ch c ho c uôi tùy lo i thú - Máu có th ư c kháng ông hay không kháng ông. N u l y máu tr c ti p thì không c n ch t kháng ông. - C t lông ch nh l y máu, sát trùng ch l y máu và kim chích b ng c n, b gi t máu u, hút gi t th nhì ch y ra. Lưu ý máu ch y t nhiên không ư c n n. t ng hút nghiêng 300 ho c 450 v i gi t máu. N u l y máu kháng ông ta ph i chuNn b ch t kháng ông và l ng máu ã ư c r a s ch và s y khô. Ch t kháng ông thư ng dùng là Natri citrate 5%. - Hút máu n v ch 0,5; c t máu liên t c không l n b t khí, dùng c n lau s ch u ng hút i) Pha loãng: cho ng hút vào l dung d ch pha loãng h ng c u hút n v ch 0,5 và hút dung d ch pha loãng n v ch 101. Như v y, h ng c u ư c pha loãng 200 l n. Trong trư ng h p m u máu c a các loài có s lư ng h ng c u th p thì có th hút máu n v ch 1 và d ch pha loãng n v ch 101 có pha loãng là 100 l n. ii) Tr n máu: B t kín 2 u ng hút b ng ngón gi a và ngón cái r i l c ng tr n u theo ng tác s 8 ít nh t 1 phút h ng c u ư c tr n u trong dung d ch. Cũng có th dùng máy l c pipette tr n. iii) Cho máu vào bu ng m và m: Bu ng m ư c làm s ch và s y khô. y lamelle lên 2 khu v c có k ô m; ưa bu ng m lên kính hi n vi, dùng th kính 10 và v t kính 10 i u ch nh tìm ô m; t bu ng m lên m t ph ng, l c l i ng hút và b i m t vài gi t u, sau ó nh m t gi t vào khe bu ng m ch lá kính y lên, dung d ch máu theo mao d n s lan kh p ô m; yên bu ng m trong 2 phút h ng c u l ng xu ng, sau ó ưa lên kính hi n vi m v i v t kính 40; Trên bu ng m Neubauer: m h ng c u 25
  5. 5 ô trung bình c a khu v c m h ng c u (4 ô b n góc và 1 ô gi a). Trong m i ô trung bình m c 16 ô nh . Trong m i ô nh , m t t c nh ng h ng c u n m g n trong ô và nh ng h ng c u n m c nh trên và c nh trái. Như v y, bi t ư c s h ng c u trong 80 ô nh (m i ô là 1/400mm2). Nh ng h ng c u n m ngay trên v ch ngoài thì m 2 tính 1, còn h ng c u nào n m gi a 2 v ch ho c trên v ch thì 1 tính 1. - M i m u máu nên ư c m2l n t ki m ch ng kh năng. Hình 4. Quy t c m h ng c u c) Cách tính N u g i A là t ng s h ng c u m ư c trên 80 ô nh thì s h ng c u trong bu ng m máu s là A x 4.000 x 200 S HC trong 1mm3 = -----------------------------------= A x 10.000 5 x 16 Trong ó: A: s h ng c u m ư c trong 80 ô 4.000 = 400 x 10 ( 1/400 mm2: di n tích m t ô nh ; 1/10 mm: chi u cao t m t bu ng m n t m lamelle) 200: pha loãng m u máu d) R a d ng c - Sau khi làm xong ph i th i h t dung d ch máu trong ng tr n h ng c u và r a nhi u l n b ng HCl 0,1N, nư c c t. - R a bu ng m b ng nư c c t và lau nh b ng bông gòn - S y ho c lau khô bu ng m, ng tr n. 26
  6. 2. Xác nh s lư ng b ch c u B ch c u là nh ng t bào có nhân, có hình d ng bi n i và di ng ư c. S lư ng b ch c u thay i tùy lo i và ph thu c vào i u ki n sinh lý, b nh lý. ngư i bình thư ng có 7000 BC/mm3 Heo: 20.000 BC/mm3; Trâu: 13.000.mm3; Gà: 30.000 BC/mm3 a) V t li u c n thi t Tương t như ph n m h ng c u - Bu ng m Neubauer m b ch c u là 4 ô vuông l n 4 góc có di n tích m i ô l n là 1 mm2. M i ô vuông l n ư c chia thành 16 ô vuông nh - ng tr n b ch c u: trong b u phình có viên á ho c nh a màu tr ng, trên ng có kh c v ch 0,5 – 1 – 11. - Dung d ch pha loãng b ch c u: là dung d ch có tác d ng phá v h ng c u, ó là dung d ch HCl 1N ho c acid acetic 2 – 3%. b) Cách làm - L y máu: tương t - Pha loãng: hút máu n v ch 0,5 r i hút dung d ch pha loãng n 11, như v y b ch c u ư c pha loãng 20 l n - Tr n máu - ChuNn b bu ng m - Cho máu vào bu ng m - m máu: Trên bu ng m Neubauer m 4 ô vuông 4 góc v i t ng s 64 trung bình. Cách m gi ng như m h ng c u. c) Cách tính toán N u g i B là s b ch c u m ư c trên 64 ô trung bình (4 mm2) thì s b ch c u trong 1 mm3 s là: B x 10 x 20 S b ch c u trong 1 mm3 = --------------------- = B x 50 4 Trong ó: B: s b ch c u m ư c 1/10: chi u cao t bu ng m n lamelle 20: pha loãng 4: vì 1 mm3 có 16 ô trung bình trong khi ó m 64 ô 27
  7. d) R a d ng c - Sau khi làm xong ph i th i h t dung d ch máu trong ng tr n h ng c u và r a nhi u l n b ng HCl 0,1N, nư c c t. - R a bu ng m b ng nư c c t và lau nh b ng bông gòn - S y ho c lau khô bu ng m, ng tr n. III. BÀI N P 1. Mô t thí nghi m và k t qu . 2. Ý nghĩa c a k t qu phân tích s lư ng h ng c u và b ch c u: cao hơn ho c th p hơn giá tr trung bình. 3. Nêu ng d ng phương pháp m t bào b ng bu ng m h ng c u i v i các i tư ng t bào khác. 28
  8. BÀI 4 KH O SÁT ENZYME CATALASE TRONG GAN I. LÝ THUY T Gan là m t cơ quan trung gian gi a tiêu hóa và trao i ch t c a cơ th . Gan có các ch c năng chính sau ây: - Ch c năng trao i ch t bao g m c d hóa và ng hóa: chuy n hóa protein, chuy n hóa carbohydrate, chuy n hóa lipid, chuy n hóa cholesterol. - Ch c năng d tr : vitamin tan trong d u, B12, Fe, d tr máu. - Ch c năng ti t m t tiêu hóa ch t béo - Ch c năng kh c: NH3, s c t c porphyrin, purine, thu c, các ch t c t môi trư ng như kim lo i n ng, thu c tr sâu, alcohol... Hình 1: C u t o gan Quá trình trao i ch t x y ra m nh m t bào gan d n n s lư ng peroxisome trong t bào gan r t cao. H2O2, m t d ng g c t do (reactive oxygen species, ROS) sinh ra trong quá trình trao i ch t bình thư ng hay b nh lý là ph phNm c c a quá trình trao i ch t c a t bào ư c phân h y nh catalase – enzyme ch y u c a peroxisome. Catalase là enzyme thu c nhóm oxy hóa kh (oxidoreductase, EC 1.11.1.6). ó là m t hemoprotein, m t phân t catalase ch a 4 nguyên t s t. Catalase xúc 29
  9. tác ph n ng phân h y hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) thành nư c và oxy theo phương trình sau: 2H 2 O 2 → 2H 2 O + O 2 Catalase có trong m i t bào, c bi t trong gan và h ng c u. ây là m t enzyme thu c ch c năng gi i c c a gan ho t ng m nh nh t. Ngoài vi c phá h y hydrogen peroxide, catalase còn oxy hóa các rư u phân t như methanol, ethanol. II.TH C HÀNH 1. Nguyên t c: Trong bài này sinh viên s tách chi t catalase t gan bò b ng h n h p dung môi alcohol: chloroform 1:1 và k t t a enzyme b ng ammonium sulfate. Cu i cùng ho t tính catalase ư c xác nh qua n ng cơ ch t ư c s d ng trong ph n ng enzyme. Mu n v y, n ng H 2 O 2 còn l i sau ph n ng ư c xác nh t i th i i m “0” và th i i m “t” c a ph n ng b ng phương pháp chuNn iod r i l y hi u s . chuNn Iod, ta thêm KI vào h n h p ph n ng. Trong i u ki n acid, KI chuy n thành HI. H 2 O 2 oxy hóa HI thành Iod t do theo phương trình: H+ + KI → HI + K+ H2O2 + 2HI → I2 + H2O M t mol H2O2 gi i phóng 1 mol I2 . Iod t do ư c chuNn b ng sodium thiosulfate v i s có m t c a dung d ch tinh b t làm ch t ch th màu. Kh I 2 thành 2I- l i làm dung d ch m t màu theo phương trình: 2Na2S2O3 + I2 →2NaI+Na2S4O6 Phương trình t ng quát: H2O2 + 2HI + 2Na2S2O3 → 2NaI+Na2S4O6+ H2O Qua lư ng dung d ch sodium thiosulfate s d ng chuNn , ta tính lư ng H2O2 còn l i t i m i th i i m ph n ng enzyme. 2. V t li u Gan bò tươi (có th tr ng l nh vài ngày) 5 g cho m i nhóm Cân C i, chày 30
  10. Bình tam giác 100 ml: 3 cái C c th y tinh có m 50 ml: 1 cái Máy ly tâm ng ly tâm 50 ml ũa th y tinh Biuret chuNn Pipette Hóa ch t: H n h p dung môi ethanol: chloroform = 1:1 Dung d ch m phosphate 0,15 M pH = 7,2 (NH4)2SO4 H2SO4 1M Dung d ch H2O2 10mM trong m phosphate 0,15 M, pH = 7,2. Dung d ch KI 5% Dung d ch ammonium molybdate bão hòa Dung d ch 0,005 M Na2S2O3 Dung d ch tinh b t 0,1%. 3. Quy trình thí nghi m a) Tách chi t catalase t gan bò: - C t 5 g gan bò thành mi ng nh , thêm 10 ml nư c c t r i nghi n trong c i. - Chuy n gan ã nghi n sang bình tam giác, thêm 5 ml h n h p ethanol-chloroform (1:1) và l c m nh trong vòng m t phút. - Ly tâm d ch nghi n gan 3000 vòng/min trong 10 phút. - L y d ch trong ch a catalase, o chính xác th tích V. Thêm vào dung d ch catalase m i thu ư c ammonium sulphate (3 g cho m i 10 ml dung d ch enzyme). Dùng ũa th y tinh khu y cho n khi hòa tan toàn b mu i. - Catalase k t t a s ư c tách b ng ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút. Lo i b d ch trong. - Thêm vào ng ly tâm m t th tích m phosphate 0,15 M (pH=7,2) b ng th tích d ch trong v a lo i b hòa tan k t t a. ó là dung d ch catalase g c. - Pha loãng dung d ch enzyme g c 100, 200, 400 l n và xác nh ho t tính. b) Xác nh ho t tính catalase. 31
  11. ChuNn b 2 bình tam giác 100 ml và ánh d u 1 bình là i ch ng ( C) và 1 bình là thí nghi m (TN). - Cho vào m i bình tam giác 5 ml H2 O 2 10 mM pha trong m phosphate. - Cho vào bình i ch ng 5 ml H2SO4 1M. - Thêm vào m i bình tam giác 1 ml dung d ch catalase pha loãng. (Enzyme trong bình i ch ng b b t ho t ngay t u do acid). - Sau 5 phút, thêm vào bình thí nghi m 5 ml H2SO4 1M. ch m d t ph n ng enzyme. - Thêm vào bình tam giác 1ml KI 5% và 0,5 ml dung d ch ammonium molybdate bão hòa, l c và yên 3 phút. - ChuNn I2 sinh ra b ng sodium thiosulfate 0,005M n khi th y màu vàng nh t. Cho vào 3 gi t dung d ch tinh b t 0,1 % th y màu xanh xu t hi n. - Ti p t c chuNn v i sodium thiosulfate 0,005M c h o n khi m t màu hoàn toàn. B ng tóm t t phương pháp xác nh ho t tính enzyme catalase Hóa ch t i ch ng Thí nghi m Ph n ng enzyme H2O2 10 mM trong m 5 ml 5 ml phosphate pH = 7,2 H2SO4 1M 5 ml - Dung d ch enzyme pha 1 ml 1 ml loãng Ph n ng enzyme 5 phút, nhi t phòng H2SO4 1M - 5 ml Xác nh H2O2 còn l i trong h n h p ph n ng enzyme KI 5% 1 ml 1ml Ammonium molybdate bão 3 gi t 3 gi t hòa ChuNn b ng Na2S2O3 Màu vàng nh t Màu vàng nh t 0,005 M Tinh b t 0,1% 3 gi t 3 gi t 32
  12. ChuNn ti p b ng M t màu xanh c a ph n M t màu xanh c a ph n Na2S2O3 0,005 M ng iod – tinh b t ng iod – tinh b t Th tích Na2S2O3 0,005 M V C = VTN = dùng chuNn c) Tính k t qu Ho t tính enzyme o b ng ơn v katal (1 mol cơ ch t b phá h y trong 1 giây) ho c ơn v qu c t U (1 micromol cơ ch t b phá h y trong 1 phút). Thí d tính toán ho t tính catalase: Th tích Na2S2O3 0,005 M dùng chuNn m u i ch ng và thí nghi m là V C = 16,3 ml và VTN = 12,1 ml. Như v y, trong th i gian ph n ng 5 phút lư ng H2O2 b phân h y tương ng (V C –VTN) =16,3 – 12,1 = 4,2 ml dung d ch sodium thiosulfate 0,005 M. Bi t r ng 1 ml sodium thiosulfate 0,005M dùng chuNn tương ng 2,5 µmol H2O2, như v y, s micromole cơ ch t b phân h y ư c tính như sau: 1,0 ml Na2S2O3 0,005M - 2,5 micromol H2O2 4,2 ml Na2S2O3 0,005M - X micromol H2O2 X = 10,5 micromol H2O2 bi u di n ho t tính enzyme b ng ơn v qu c t , chia s lư ng micromole H2O2 b phân h y cho s phút th i gian ph n ng. Trong trư ng h p trên ho t tính enzyme catalase trong dung d ch enzyme pha lõang là X = 10,5 micromole: 5 = 2,1 U/ml. bi u di n ho t tính enzyme b ng katal, t ( phút ) chuy n micromole thành mol và phút thành giây. Ho t tính dung d ch enzyme g c = ho t tính enzyme thí nghi m x h s pha loãng n X •n = t ( phút ) ho t tính enzyme catalase trong 1g gan bò, c n tính n th tích dung d ch chi t enzyme và kh i lư ng gan bò dùng tách chi t enzyme (5g). Tóm l i, ho t tính catalase/ 1 g gan bò X • n •V A (U) = t ( phút ) • m 33
  13. X s micromol H2O2 n = h s pha loãng (ví d n = 200) V = th tích dung d ch chi t enzyme (ml) t = th i gian ph n ng (phút) m= kh i lư ng gan bò (g) 10,5 • 200 • 10 A (U) = 5•5 A = 840 U/g A(U ) • 10 -6 840 • 10 -6 A (katal) = = = 14 • 10-6 katal/g = 14 • 10-6 katal/(10-3 kg) = 14 • t ( giây ) 60 10-3 katal/ kg. III.BÀI N P 1. Mô t thí nghi m và cách tính toán cùng v i k t qu ho t tính theo b ng sau: ơn v qu c t U Katal Ho t tính catalase trong m u thí nghi m ( vht/ml) Ho t tính catalase trong dung d ch enzyme g c ( vht/ml) Ho t tính catalase trong 1 g gan bò ( vht/g) 2. So sánh h at tính enzyme v i các h s pha lõang khác nhau. 34
  14. TÀI LI U THAM KH O 1. Evert RF. Essau’s Plant Anatomy. Third Edition. Wiley Interscience. 2006 2. Nguy n Bá. Hình thái h c th c v t. Nhà xu t b n giáo d c.2006. 3. Hematology Laboratory: Manual RED Cell Counts CLS 312. The clinical laboratory sciences of the University Mississipi Medical Center. cls.umc.edu/COURSES/CLS312/rbcounts.doc. 4. Dunn EE, Morgulis S. Studies on the catalase and peroxidase activity of the liver cell. J. Biol. Chem. 1937. 5. Tauber H, Petit ED. Convenient Methods for preparing crystalline catalase from cow liver. J. Biol. Chem. 1951. 35
  15. PH L C V t li u thí nghi m Lá khoai lang Lá l t Rau t n dày lá (húng chanh) Thân cây hoa h ng Cây chanh (Citrus limon) Cây c voi Cây rau mu ng Cây dâm b t 36
nguon tai.lieu . vn
Toán học Môi trường Vật lý Sinh học Địa Lý Hoá học Nông - Lâm - Ngư Cơ khí - Chế tạo máy Tiếng Anh phổ thông Khoa học ứng dụng Nông - Lâm Kiến thức tổng hợp Giáo dục học Xã hội học