Bài giảng Nhập môn Công nghệ sinh học: Chương 3 - Nguyễn Vũ Phong

3/3/2015 Lịch sử hình thành Công nghệ DNA tái tổ hợp Nguyễn Vũ Phong QUY TRÌNH TIẾN HÀNH • Bước 1: Nuôi tế bào chủ và tế bào cho • 1972 – 1973: DNA tái tổ hợp in vitro từ 3 nguồn vật liệu di truyền khác nhau. (Berg, Boyer và Cohen) • 1973 – 1974: DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh học (Cohen, Henlinski, Boyer). Tên gọi: • Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology) • Kỹ thuật gene (Gene engineering) hay công nghệ gene (Genetic technology) • Thao tác gene (Gene manipulation) • Tạo dòng phân tử (Molecular cloning) • Kỹ thuật di truyền (Genetic engineering): thao tác với những phần lớn hơn của bộ gene. 1. Enzyme 1.1. Enzyme cắt giới hạn (Restriction endonuclease enzyme, RE) • Bước 2: Tách DNA plasmid và DNA tế bào cho • Bước 3: Cắt DNA plasmid và DNA mục tiêu bằng 1 loại enzyme cắt giới hạn • Bước 4: Trộn và nối 2 loại DNA bằng enzyme nối tạo DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh • Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận (E. coli, nấm men) • Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng tế bào mang gene tái tổ hợp • Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu hiện ra sản phẩm - 1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn - Hệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của DNAlạ. Restriction enzyme.swf 1. Enzyme 1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE) 1. Enzyme 1.2. Enzyme nối (Ligase) - Trình tự nhận biết: gồm 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom) - Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end) . - Khoảng 3000 RE với 230 trình tự nhận biết khác nhau. Hình thành cầu phosphodiester gắn các nucleotid kề cận hay chụm cầu với nhau - EcoRI: Escherichia coli R: dòng vi khuẩn I: thứ tự tìm ra (I: đầu tiên) 1 3/3/2015 1. Enzyme 1.3. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) 1. Enzyme 1.4. Các enzyme khác • Tổng hợp sợi DNA bổ sung c-DNA (complementary DNA) từ một sợi mRNA hoặc từ polyribonucleotide tổng hợp • c-DNA có thể tổng hợp thành c-DNA kép (c-DNA duplex) nhờ DNA polymerase. c-DNA kép được dùng trong việc tạo dòng c-DNA cDNA.swf Enzyme DNaseI Nuclase BAL31 S1 nuclease Đoạn Klenow Taq polymerase Chức năng Phân hủy DNA mạch kép bằng phản ứng thủy phân nội liên kết phosphodiester (Endonuclease) Phân hủy 2 đầu mút 3’ và 5’ của DNA (Exon nuclease) Cắt DNA mạch đơn DNA polymerase chỉ còn hoạt tính exonuclease 3’-5’ DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus 2. Các vector chuyển gene Plasmid: - DNA vòng tròn - Sao chép độc lập trong tế bào - Có khả năng mang một số gene có khả năng biểu hiện thành protein Vector: - Phân tử DNA có khả năng tự tái bản - Tồn tại độc lập trong tế bào - Mang được gene mong muốn 2. Các vector chuyển gene Các loại vector chuyển gene 2. Các vector chuyển gene Yêu cầu tối thiểu đối với vector chuyển gene. - Có trình tự khởi đầu sao chép (ori) để tự sao chép mà tồn tại độc lập - Trình tự nhận biết cho RE tạo vết cắt để chèn gene lạ - Trình tự điều hòa (promoter) tạo điều kiện thuận lợi phiên mã gene lạ - Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp - Có gene đánh dấu (marker) để dễ dàng nhận biết các gene lạ. 2. Các vector chuyển gene Ứng dụng của vector chuyển gene Vector Plasmid Phage λ Cosmid Phage M13 BAC YAC MAC Đặc điểm Dạng vòng Tự động xâm nhiễm và sinh sản trong TB vi khuẩn Plasmid + đoạn cos của phage λ DNAmạch đơn NST nhân tạo vi khuẩn Vòng tròn 2 micrometre cải tiến NST nhân tạo động vật có vú Khả năng chèn 0,1 – 10kb 15 – 23 Kb 45kb 50 – 300kb 100-2000kb >2000kb Ứng dụng Procaryote Lập ngân hàng gene Lập thư viện gene Xác định trình tự nu Sản xuất mẫu dò Gây đột biến điểm định hướng - Tạo dòng và khuyếch đại trình tự DNA (nhiều bản sao) - Nghiên cứu sự biểu hiện của đoạn DNA - Chuyển gene - Sản xuất RNA - Sản xuất protein từ gene được tạo dòng. Hệ thống vector chuyển gen được hoàn thiện không ngừng. 2 3/3/2015 2. Các vector chuyển gene Plasmid Ti - 200Kb - Agrobacterium tumefaciens - Chuyển gen ở thực vật - Chuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene của tế bào 3. Hệ thống tế bào chủ (Host) 3.1. Escherichia coli (E.coli) - Dễ nuôi cấy và nhân dòng - Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau. - Vi khuẩn Gram-, hình que, - Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base 3.2. Saccharomyces cerevisiae - Eukaryote đơn bào - Dễ dàng nuôi cấy và thu sinh khối - Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh - Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có đủ hoạt tính sinh học. - Sản xuất protein tái tổ hợp dễ dàng - Sinh vật an toàn Kỹ thuật và phương pháp căn bản 3. Hệ thống tế bào chủ (Host) Mục đích: - Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng. - Biểu hiện gene, đặc biệt ở Eukaryote - Sản xuất protein tái tổ hợp. 3. Hệ thống tế bào chủ (Host) 3.3. Hệ thống tế bào thực vật 3.4. Hệ thống tế bào động vật - Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney) ... - tailieumienphi.vn