Xem mẫu
- 2.1. Phân tích acid nucleic:
b. Phân tích ADN nhiễm sắc
thể:
Phương pháp phân tích ở đây
bao gồm việc tách ADN của nhiễm
sắc thể và cắt bằng enzym cắt hạn
chế để phân biệt giữa các vi sinh
- vật với nhau. Một chú ý khi tách
ADN nhiễm sắc thể phải thao tác
nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do
nguyên nhân cơ học. Nói chung các
mảnh cắt nên có kích thước nhỏ
hơn hoặc bằng 50 kb. Việc tách các
mảnh cắt đó được thực hiện dựa
vào kỹ thuật điện di trong trường
xung điện
(PFGE = Pulsed Field Gel Electrop
horesis ).style="text-align: justify;
margin-top: 6.0pt"> Như vậy
kỹ thuật dấu vân tay không chỉ áp
dụng trong trường hợp trên tế bào
mang plasmid mà kỹ thuật này còn
được sử dụng với nhiễm sắc thể
cho mọi trường hợp.rường
hợp.ường hợp.ường hợp.
- Liên quan đến vấn đề này
phải kể đến kỹ thuật BRENDA:
phân tích kết quả xử lý enzym cắt
hạn chế với vi sinh vật. Ở đây cách
chọn loại enzym cắt hạn chế vô
cùng quan trọng, theo cách chọn
này có thể tạo ra quá nhiều mảnh
cắt nên không thể phân biệt được
các băng riêng rẽ trong khi đó đối
với các trường hợp khác lại tạo ra
quá ít mảnh cắt có kích thước lớn
khó tách theo các kỹ thuật điện di
hiện có. Các vi sinh vật khác nhau
có tỷ lệ GC khác nhau (dao động từ
25-75%) các mảnh cắt thu được sau
khi xử lý enzym cắt hạn chế rất
khác nhau. Theo Nei M. và Li W.
- H. (1979) thì số mảnh cắt có thể
thu được tính trên lý thuyết là:
a = (g/2)r1 x {1-(g/2)}r2
Trong đó: g - tỷ lệ GC của
ADN
r1 - số cặp
GC
r2 - số cặp
AT trong vị trí cắt của enzym giới
hạn sử dụng
a - số vị trí
cắt khi sử dụng enzym cắt hạn chế.
Mặt khác, người ta cũng căn cứ
vào kết quả nghiên cứu các vị trí
cắt của bộ gene vi sinh vật làm cơ
sở cho cách chọn enzym cắt. Thông
- thường cho mỗi phép phân tích
người ta ghi được số các băng cắt
bởi enzym và tính toán kích thước
các mảnh tạo thành làm cơ sở cho
các phép phân tích về sau. Tuy
nhiên, một trong những nguyên
nhân hạn chế cho phép phân tích
trên là các phương pháp tách ADN
thông thường đều dẫn đến thay đổi
kích thước do đứt gãy ADN nhiễm
sắc thể, mặt khác sự có mặt của
plasmid lẫn cũng tạo ra sự khác biệt
giả trong kết quả phân tích, để khắc
phục nhược điểm trên người ta phải
thực hiện phép phân tích ADN
nhiễm sắc thể nguyên vẹn để phát
hiện các nguồn ADN tạp nhiễm lẫn
vào kết quả phân tích.
- + Kỹ thuật điện di trong
trường xung điện (điện di trong
trường điện thay đổi, PFGE)
- Nguyên tắc: Trước tiên các
mẫu đưa vào phân tích phải được
xử lý trước bằng loại enzym cắt
hạn chế mà có rất ít điểm cắt. Kết
quả phải tạo ra được các mảnh có
kích thước lớn (50 kb – 12 Mb),
với kích thước này không thể điện
di theo phương pháp thông thường
mà chỉ có thể tách ra bằng kỹ thuật
PFGE (ật PFGE (ật PFGE (uật
PFGE (Pulsed-Field Gel
Electrophoresis ). Kỹ thuật PFGE
lần đầu tiên được Schwartz va
Cantor (1984) giới thiệu. Tuy nhiên
sau đó đã có nhiều tác giả mô tả lại
- kỹ thuật này, tuy có sai khác ít
nhiều nhưng cơ sở lý thuyết của
các phương pháp này là như nhau:
Mục đích của kỹ thuật này là tăng
khả năng di động của các mảnh
ADN có kích thước lớn trong điện
trường, do đó các thành phần gel và
đệm hầu như không thay đổi theo
các phương pháp điện di thông
thường. Tuy nhiên theo phương
pháp thông thường thì sự điện di
liên quan đến sự di động của các
mảnh ADN có kích thước khác
nhau trên gel agarose trong một
trường điện không đổi. Kết quả ở
đây là phân tử lớn khó di động hơn
phân tử nhỏ qua mắt xích agarose,
tạo ra sự tách biệt trong trường điện
- di. Trong trường hợp PFGE lực làm
thay đổi khả năng di động lại là
trường điện tích thay đổi liên tục
dẫn đến các mảnh ADN có kích
thước khác nhau thay đổi hướng di
động. Như vậy kết quả là các mảnh
có kích thước khác nhau sẽ có khả
năng di động khác nhau. Kích
thước càng lớn thì mức độ di động
càng chậm. Sự di động khác nhau
của ADN chủ yếu phụ thuộc vào
kích thước chứ không phải do gel
agarose như ở phương pháp điện di
thông thường, hình 1.2.
- Hình 1.2. Sử dụng kỹ thuật PFGE
phân tích nhiễm sắc thể
sau khi xử lý với Sma I với 7 chủng
Haemophilus ìnluenzae.
Tiếp theo các mô tả của
Schwartz va Cantor, Smith và
Codemine (1990) đã đề cập đến sự
di chuyển của các mảnh ADN khác
nhau là hàm số tuyến tính với kích
thước của chúng. Trên cơ sở đó có
thể điều chỉnh các xung điện và
- điện trường. Tuy nhiên các nhân tố
khác cũng có mối tương tác lẫn
nhau và ảnh hưởng đến khả năng di
động của ADN như: nhiệt độ, điện
thế, nồng độ agarose cũng như
nồng độ ion trong đệm.
- Chuẩn bị ADN cho PFGE:
Chuẩn bị ADN từ nhiễm sắc thể
không giống như các phương pháp
chuẩn bị ADN plasmid. Một vấn đề
thường xảy ra là sự đứt gãy ngẫu
nhiên ADN dẫn đến sai khác trong
kết quả phân tích. Để hạn chế điều
này người ta phải thực hiện kỹ
thuật tách ADN NST khỏi tế bào
mẫu agarose có nhiệt độ nóng chảy
thấp – LMT (Schwartz va Cantor –
1984 và Smith, Klco 1988). Theo
- phương pháp này hỗn dịch tế bào
(dịch nuôi cấy hoặc dịch huyền
phù) được trộn với LMT agarose
tại 37oC. Hỗn dịch đầu tiên được
xử lý với enzym và chất tẩy rửa để
tách ADN NST khỏi thành, màng
tế bào, RNA và protein. Sau đó là
xử lý với EDTA, bất hoạt nuclease
tế bào với proteinase K và N-
lauroylsarcosine để loại các thành
phần khác của tế bào. Kết quả là
phần LMT agarose có chứa ADN
NST được dùng làm mẫu chạy gel
0.5-1.0% (nên làm tan ở 65oC) và
đưa lên mẫu chạy gel PFGE, tài
liệu của Smith (1988) mô tả chi tiết
cách chuẩn bị mẫu từ các tế bào có
và không có thành tế bào: vi khuẩn,
- nấm men, nấm sợi, tế bào thực vật
và động vật. Nói chung với các
trường hợp có thành tế bào thì cần
đến enzym phá thành tế bào. Lượng
ADN NST thường dao động trong
khoảng 0.5-20 µg ADN là thích
hợp. Nếu quá nhiều ADN thì không
thể phân tích được, còn quá ít thì
cũng không thể phát hiện được các
băng ADN trong kết quả phân tích.
Mẫu ADN dùng cho kỹ thuật PFGE
có thể được giữ 1 năm trong lạnh
có chứa 0.5M EDTA.
- Sau khi thu được ADN NST
trong mẫu LMT agarose thì tiến
hành xử lý với enzym giới hạn loại
có ít điểm cắt. Tuy nhiên mẫu đầu
tiên phải được xử lý với PMSF để
- bất hoạt protein K sau đó PMSF lại
phải loại bỏ sau một số lần rửa với
chất tẩy rửa và EDTA. Sau đó chỉ
cần phân nhỏ mẫu trong agarose
được xử lý với đệm và enzym cắt
hạn chế qua đêm trong tube và sau
đó toàn bộ mẫu này được sử dụng
để tách trong trường xung điện.
Bảng 1.2 dưới đây liệt kê các
enzym cắt hạn chế được dùng cho
phân tích PFGE.
Bảng 1.2. Một số enzym cắt hạn
chế được dùng cho kỹ thuật PFGE.
Enzym Vị trí cắt
AatII GACGT/C
- ApaI GGGCC/C
ClaI AT/CGAT
MluI A/CGCGT
NarI GG/CGCC
NheI G/CTAGC
NotI GC/GGCCGC
NruI TCG/CGA
PvuI CGAT/CG
SacII CCGC/GG
SalI C/TCGAC
SfiI GGCC(N)4/NGGCC
SmaI CCC/GGG
XhoI C/TCGAG
nguon tai.lieu . vn
